Imagerie Ca

L'objectif général de cette procédure est d'enregistrer les signaux calciques induits par un stimulus lumineux dans les photorécepteurs coniques de la rétine de souris à l'aide d'un biosenseur fluorescent. Cela est réalisé en isolant la rétine d'une lignée de souris transgéniques exprimant un capteur calcique génétiquement codé exclusivement dans les photorécepteurs coniques. La deuxième étape consiste à découper des tranches verticales du tissu rétinien.

Ensuite, les tranches rétiniennes sont montées sur des lamelles et placées sous un microscope à deux photons. La dernière étape consiste à enregistrer les signaux calciques provenant des terminaisons synaptiques individuelles des photorécepteurs coniques en réponse à une stimulation lumineuse. Enfin, les signaux calciques enregistrés sont analysés hors ligne.

Avec cette méthode, nous pouvons enregistrer l'activité de nombreux récepteurs alimentaires du maïs simultanément avec une résolution subcellulaire. C'est là le principal avantage par rapport aux techniques existantes telles que les enregistrements électriques unitaires, qui sont plus difficiles et plus longs. La question que nous souhaitons donc aborder est de savoir si et comment le calcium est impliqué dans la dégénérescence des photorécepteurs.

Cette méthode nous permet de déterminer si l'entrée de calcium provoque la dégénérescence des photorécepteurs ou si elle résulte du fait que la cellule est en train de mourir. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent principalement des difficultés car la sensibilité à la lumière de la rétine doit être préservée chaque semaine, et par conséquent toutes les étapes délicates, notamment la dissection de la rétine et la préparation des tranches, doivent être réalisées sous lumière rouge verte. Pour commencer cette procédure, transférez un globe oculaire de souris dans une boîte de Pétri contenant une solution extracellulaire fraîchement carbogénée.

Percez le globe oculaire en un point quelconque situé le long de la limite entre la cornée et la sclérotique à l’aide d’une aiguille d’injection pointue. Ensuite, maintenez l’œil par la sclérotique à l’aide d’une pince et insérez délicatement une lame de ciseau dans le trou. Coupez le long de la pars serrata afin de séparer la partie antérieure de l’œil de la cupule oculaire.

Ensuite, couper le cupule oculaire radialement au niveau de la marque au stylo afin d'indiquer la position dorsale sur la rétine. Puis positionner le cupule oculaire de sorte que l'incision dorsale soit orientée vers l'extérieur. Saisir la sclérotique sur les côtés gauche et droit du cupule oculaire en insérant les pointes de la pince entre la rétine et la sclérotique.

Ensuite, détachez la rétine en inversant délicatement la partie sclérale de l'iica. Enfin, coupez le nerf optique pour libérer la rétine de la sclérotique. Saisissez le bord de la rétine avec une paire de forceps et retirez doucement les débris et le corps vitré de la surface rétinienne à l’aide d’une deuxième paire de forceps.

Lorsque la surface rétinienne est propre, effectuez trois autres coupes radiales plus courtes. Immergez lentement une lame de verre dans la solution extracellulaire près du tissu. Ramenez délicatement la rétine sur la lame de verre, côté cellules ganglionnaires vers le haut, en saisissant le bord afin de réduire les dommages mécaniques et les plis du tissu.

Ensuite, découpez un rectangle d'environ un sur deux millimètres dans la région rétinienne sélectionnée à l'aide d'une lame de scalpel courbe, puis essuyez la solution excédentaire autour du tissu. Placez ensuite la membrane en fibres de nitrocellulose préalablement préparée sur le fragment de rétine, de sorte que le côté contenant les cellules ganglionnaires adhère à la membrane. Ajoutez immédiatement une goutte de milieu extracellulaire sur la membrane afin d'attacher fermement le tissu à celle-ci.

Transférez le tissu rétinien monté sur membrane vers la chambre de découpe contenant une solution extracellulaire fraîche. Ensuite, découpez la rétine en tranches verticales d'une épaisseur de 200 micromètres. À l'aide d'une colle pour hacheur de tissus, fixez une seule tranche montée sur membrane sur un lamelle de verre préparée au préalable avec de la graisse à vide élevée.

Gardez la surface en verre située sous la rétine et exempte de graisse. Ensuite, ajoutez une goutte de solution extracellulaire sur chaque lame porteuse montée dans la chambre de maintien à température ambiante. Introduisez du carbogène dans la chambre en faisant barboter un petit réservoir d'eau et maintenez l'atmosphère de la chambre de maintien humidifiée.

Laisser reposer les tranches dans la chambre de maintien pendant 10 à 15 minutes avant de les transférer une par une dans la chambre d’enregistrement. Transférer une tranche de la chambre de maintien vers la chambre d’enregistrement et commencer immédiatement à la perfuser avec une solution extracellulaire carbogénée. Maintenir un débit de perfusion de deux millilitres par minute et une température de 37 degrés Celsius.

Dans la chambre d’enregistrement. Utilisez un objectif à immersion dans l’eau de 20 x 0,95 NA et une caméra CCD en combinaison avec une DEL infrarouge placée sous la chambre d’enregistrement. Pour localiser la coupe rétinienne, démarrez le système d’imagerie à deux photons conformément aux indications du fabricant.

Ensuite, allumez le laser et réglez-le à 860 nanomètres. Activez les deux canaux de détection pour l'imagerie de fluorescence de l'ECFP et de la citrine. Ensuite, à l'aide du logiciel d'acquisition d'images, contrôlez le microscope à deux photons pour balayer et sélectionner une rangée de terminaisons coniques afin d'enregistrer ; réglez l'acquisition d'images sur des images de 128 par 16 pixels ou une configuration similaire, et restreignez la zone balayée aux terminaisons coniques afin d'éviter la décoloration des pigments photo-sensibles dans les segments externes.

Activez le laser. Laissez les cônes s'adapter au laser de balayage et à la lumière de fond du stimulus pendant 20 à 30 secondes avant de présenter les stimuli lumineux ou d'appliquer des agents pharmacologiques. Commencez maintenant la présentation des stimuli arbitraires.

Les stimuli sont générés en modulant l'intensité des deux DEL au fil du temps, à l'aide d'une carte microprocesseur contrôlée par un logiciel personnalisé. Ensuite, commencez l'enregistrement simultané des deux canaux de fluorescence à l'aide du logiciel d'acquisition d'images respectif. Les enregistrements portaient sur les terminaisons synaptiques des photorécepteurs coniques dans les tranches de rétine.

Il s'agit d'un exemple de région enregistrée comportant sept terminaisons individuelles. La fluorescence a été enregistrée à l'aide de deux canaux, l'un pour le capteur libre citrine, et l'autre pour le donneur FRET ECFP. Voici les variations de fluorescence de la citrine et de l'ECFP induites par la lumière, enregistrées dans une seule région d'intérêt.

Et voici les réponses calciques d'une terminaison conique à une série d'éclairs lumineux intenses d'une durée d'une seconde, espacés d'intervalles de cinq secondes. Cette figure montre une analyse quantitative exemplaire des réponses calciques induites par la lumière dans les cônes. Et voici les réponses calciques induites par la lumière provenant d'une seule terminaison conique.

Cette figure illustre la détermination de la réponse moyenne au calcium. Le niveau de calcium au repos représente la ligne de base avant la stimulation lumineuse, et l'amplitude de la réponse est ra, correspondant à la surface comprise entre le niveau de calcium au repos et l'amplitude maximale, ainsi qu'entre la cinétique de début et de fin de la réponse. Cette procédure peut être étendue davantage.

Par exemple, les signaux calciques des photorécepteurs peuvent être modulés dans des conditions variées de stimulation pharmacologique ou intense afin d'étudier en détail l'adaptation ou différentes étapes de la phototransduction. Cette technique permet d'analyser la dynamique du calcium dans les photorécepteurs coniques dans des conditions physiologiques normales. Cela revêt une importance particulière pour comprendre la dégénérescence primaire et secondaire des photorécepteurs coniques dans les maladies humaines entraînant la cécité, telles que l'achromatopsie ou la rétinite pigmentaire.