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L'objectif général de l'expérience suivante est de démontrer un protocole reproductible de formation de micro-lésions cardiaques induites par ESMO au sein du cœur de souris infectées. Ceci est réalisé en infectant des souris avec ESMO et en permettant le développement d'une bactériémie, ce qui donne aux bactéries accès à la vascularisation cardiaque où elles peuvent envahir le myocarde et former des lésions microscopiques. Ensuite, les cœurs sont soit inclus dans du paraffin et colorés de manière conventionnelle, soit fixés dans un composé OCT pour une coloration en immunofluorescence.

L'évaluation des coupes colorées peut révéler des micro-lésions cardiaques réparties de manière aléatoire dans le myocarde, des dépôts de collagène et des sections de myocarde en phase de convalescence, ainsi que des capsules pneumococciques au sein des micro-lésions cardiaques, illustrant ainsi la procédure. Armand Brown est-il étudiant diplômant dans mon laboratoire ? Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les effets cardiaques délétères de S. pneumoniae lors de maladies pneumococciques invasives chez la souris.

Il peut également être appliqué à des échantillons cardiaques provenant d'autres systèmes, tels que les primates non humains ou les humains. Commencez par cultiver la souche de sérotype quatre ESMO Tiger quatre dans un bouillon Todd Hewitt jusqu'à une densité optique de 0,5 à 620 nanomètres. Lorsque la densité correcte est atteinte, centrifugez la culture à 3 500 ×g pendant 10 minutes.

Ensuite, éliminer le surnageant à l’aide d’une ligne de vide et resuspendre les bactéries dans du PBS stérile à 10 000 unités formant colonies par millilitre. Anesthésier maintenant des souris valve C âgées de 10 à 12 semaines et confirmer leur état d’anesthésie à l’aide d’une légère pincée du orteil effectuée avec une pince à épiler émoussée, charger une seringue lotus avec la suspension bactérienne et fixer une aiguille de calibre 27 à 30. Saisir ensuite une souris anesthésiée par la peau du cou avec une main tout en injectant intrapéritonéalement 100 microlitres de suspension à l’aide de l’autre main, puis replacer chaque souris dans sa cage.

Les souris se réveillent généralement entre 30 et 40 secondes après l'injection. Il est essentiel de bien doser S pneumoniae, sans quoi les souris peuvent récupérer de l'infection ou évoluer trop rapidement vers une maladie pneumococcique invasive, empêchant ainsi le développement de lésions. Étant donné que chaque souche bactérienne présente des niveaux différents de virulence, plusieurs essais peuvent être nécessaires pour déterminer la dose appropriée.

Laisser l'infection évoluer pendant au moins 24 heures pour un stade précoce ou pendant 30 heures pour un stade avancé. Ensuite, euthanasier chaque souris infectée. Prélever d'abord un échantillon de sang, désinfecter la queue avec un coton-tige imbibé d'alcool et couper une section de deux à trois millimètres.

Prélevez deux microlitres de sang sur le site de la coupure. Diluez le sang successivement d’un facteur dix dans du PBS contenant de l’héparine sodique à une unité par millilitre. Ensemencez cinq niveaux de dilution sur des boîtes de gélose au sang au soja triptyque, puis incubez-les toute la nuit.

Le lendemain, effectuez le dénombrement des colonies. Procédez à la récolte du cœur comme décrit dans la section suivante. Sinon, 30 heures après l'infection.

Tenter de sauver la souris en administrant de l'ampicilline par voie intrapéritonéale dans 100 microlitres de sérum physiologique. Continuer à administrer l'ampicilline toutes les 12 heures pendant 36 heures et prélever les cœurs aux moments souhaités. Premièrement, récolter le cœur.

Immobilisez la souris euthanasiée en position dorsale sur une plateforme chirurgicale, puis vaporisez de l'éthanol à 70 % sur la poitrine et séchez délicatement. À l’aide de ciseaux et de forceps chirurgicaux, ouvrez la cavité thoracique. Retirez la cage thoracique et sectionnez le diaphragme afin d’exposer le cœur et les poumons.

Ensuite, coupez les vaisseaux sanguins reliés au cœur et utilisez une pince pour exciser délicatement le cœur sans provoquer d'ecchymoses. Rincez le cœur avec du PBS et placez-le dans une cassette de prélèvement tissulaire pour la section coronale. Transférez ensuite les cassettes dans une solution de formol tamponné à 10 % et, le jour suivant, envoyez-les pour l'inclusion en paraffine.

Au stades précoces, les lésions cardiaques peuvent être identifiées par leur changement d'apparence de couleur, et dans certains cas, par la présence de cellules immunitaires. Dans les lésions avancées, les cellules immunitaires seront absentes et de grande taille. Des lésions de type VA se trouvent à leur place.

À l'aide d'une section cardiaque de cinq microns sur des lames en verre chargées positivement, congeler d'abord les sections, puis les décongeler et les laisser sécher à l'air libre. Fixer les lames dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius. Ensuite, éliminer le fixateur par trois lavages au PBS, cinq minutes par lavage.

Perméabiliser ensuite le tissu avec du Triton X-100 à 0,2 % dans du PBS pendant 15 minutes. Éliminer le détergent par trois nouveaux lavages au PBS pur. Bloquer ensuite le tissu avec 10 % de sérum d'origine adéquate dans du PBS pendant une heure, après un rinçage au PBS, puis recouvrir la section d'antisérum pendant deux heures à 37 degrés Celsius.

Traitez les témoins négatifs avec un antisérum de lapin naïf. Étant donné que le tissu cardiaque absorbe facilement la coloration immunofluorescente XI, entraînant des niveaux de fond élevés, il sera probablement nécessaire d'optimiser la concentration et le temps d'incubation selon les types d'anticorps. Deux heures plus tard, éliminez l'antisérum par lavage au PBS. Remplacez ensuite la solution par un anticorps secondaire et laissez les lames incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Appliquez maintenant le DPI à cinq milligrammes par millilitre et lavez les lames au PBS.

Enfin, montez les lames au fluor, sauvegardez-les et imagez-les par microscopie confocale. Commencez par éliminer le paraffine et hydrater les sections tissulaires. Utilisez des bains de xylène suivis d'une série progressive de bains d'alcool.

Ensuite, plonger les sections dans de l'acide phosphomolybdique à 0,2 % pendant cinq minutes, puis rincer à l'eau pendant cinq minutes. Colorer ensuite avec le rouge cérique à 0,1 % et l'acide ricinoléique pendant deux heures. Laver alors les sections dans de l'acide chlorhydrique normal à 0,01 pendant trois minutes et rincer dans de l'éthanol à 70 % pendant une minute. Procéder maintenant à la déshydratation des sections en inversant la série de bains alcooliques, suivie de rinçages à l'xylène, monter au microscope optique et évaluer les lames.

Des souris ont développé une maladie pneumonococcique invasive suite à une inoculation avec le tigre. Quatre micro-lésions cardiaques de souche ont été observées dans les ventricules, et une augmentation de la taille et du nombre de lésions a été notée entre 24 et 30 heures après l'infection, afin de vérifier que S. pneumoniae se trouvait effectivement à l'intérieur des lésions. Des sections ont été colorées pour détecter le polysaccharide capsulaire de sérotype quatre produit par Tiger quatre.

Cela a confirmé la présence d'agrégats étroitement compacts et denses au sein des sites de microlésions. Une coloration au rouge picro-sirius a été réalisée sur des sections cardiaques de souris ayant bénéficié d'une thérapie de sauvetage à l'ampicilline ainsi que sur des témoins non infectés. Dans les expériences de sauvetage.

Il y a eu une augmentation spectaculaire de la présence et de l'intensité de la coloration, avec des bandes provenant de sites qui semblent être d'anciens foyers lésionnels dans les ventricules. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'infecter les souris avec une dose suffisante de S. pneumoniae afin que l'infection progresse pendant au moins 28 à 30 heures, permettant ainsi suffisamment de temps pour la formation d'une bactériémie et de micro-lésions cardiaques.