Visualisation des Streptococcus pneumoniae Dans les microlésions cardiaques et le remodelage cardiaque ultérieur

L’objectif global de l’expérience suivante est de démontrer un protocole reproductible pour la formation de microlésions cardiaques ESMO dans le cœur de souris infectées. Ceci est réalisé en infectant les souris avec de l’ESMO et en permettant le développement de la bactériémie, donnant ainsi aux bactéries l’accès au système vasculaire cardiaque où elles peuvent envahir le myocarde et former des lésions microscopiques. Ensuite, les cœurs sont soit inclus en paraffine, soit fixés dans un composé OCT pour une coloration immunofluorescente.

L’évaluation des sections colorées peut montrer des microlésions cardiaques réparties de manière aléatoire sur le myocarde, des dépôts de collagène et des coupes cardiaques de convalescence et des capsules pneumococciques au sein de la microlésion cardiaque. Armand Brown est-il un étudiant diplômé dans mon laboratoire ? Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des effets néfastes cardiaques de la pneumonie à S lors d’une pneumococcie invasive chez la souris.

Il peut également être appliqué à des échantillons cardiaques provenant d’autres systèmes tels que les primates non humains ou les humains. Commencez par faire grandir la souche ESMO Sérotype quatre Tiger quatre dans un bouillon Todd Hewitt à une densité optique de 0,5 à 620 nanomètres. Lorsque la granule de densité est correcte, la culture est de 3 500 g pendant 10 minutes.

Ensuite, retirez le surnageant à l’aide d’une conduite à vide et remettez les bactéries en suspension avec du PBS stérile à raison de 10 000 unités formant colonies par millilitre. Maintenant, anesthésiées des souris de la valve C âgées de 10 à 12 semaines et confirmez leur état anesthésié avec un léger pincement des orteils d’une pince à épiler émoussée, une seringue de lotus avec la suspension bactérienne et fixez une aiguille de calibre 27 à 30. Ensuite, saisissez une souris anesthésiée par sa peau d’une main tandis qu’en injectant 100 microlitres de suspension par voie intrapéritonéale avec l’autre main, remettez chaque souris dans sa cage.

Les souris se réveillent généralement 30 à 40 secondes après l’injection. Il est essentiel d’obtenir la bonne dose de pneumonie S, sinon les souris peuvent se remettre d’une infection ou d’une pneumococcie invasive trop rapidement pour que des lésions se développent. Étant donné que chaque souche bactérienne a différents niveaux de lentille auriculaire, il peut falloir des essais et des erreurs pour identifier la bonne dose.

Laissez l’infection se poursuivre pendant au moins 24 heures jusqu’à un stade précoce ou jusqu’à 30 heures pour une infection à un stade avancé. Plus tard, euthanasiez chaque souris infectée. Tout d’abord, prélevez un échantillon de sang, désinfectez la queue avec un tampon imbibé d’alcool et coupez une section de deux à trois millimètres.

Prélevez deux microlitres de sang sur le site de coupe. Diluez en série le sang dix fois dans du PBS contenant de l’héparine sodique à raison d’une unité par millilitre. Plaquez cinq niveaux de dilutions sur des plaques triptyques de gélose au sang de soja et incubez-les pendant la nuit.

Le lendemain, faites le dénombrement des colonies. Procédez à la récolte du cœur comme décrit dans la section suivante. Alternativement, 30 heures après l’infection.

Tenter de sauver la souris en administrant de l’ampicilline interpéritonéale dans 100 microlitres de solution saline. Continuez à fournir de l’ampicilline toutes les 12 heures pendant 36 heures et collectez des cœurs aux points de temps souhaités. Tout d’abord, récoltez le cœur.

Immobilisez la souris euthanasiée en position couchée sur une plate-forme chirurgicale, vaporisez la poitrine avec de l’éthanol à 70 % et séchez-la en tapotant. À l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces, ouvrez la cavité thoracique. Retirez la cage thoracique et transectez le diaphragme pour exposer le cœur et les poumons.

Ensuite, coupez les vaisseaux sanguins reliés au cœur et utilisez des pinces pour exciser doucement le cœur sans ecchymoses. Rincez le cœur avec du PBS et placez-le dans une cassette de prélèvement d’échantillons de tissu pour la section coronale. Transférez ensuite les cassettes dans une solution de formol tamponnée à 10 % et, le lendemain, envoyez-les pour l’enrobage de paraffine.

Aux premiers stades, les lésions cardiaques peuvent être identifiées par leur changement d’apparence et, dans certains cas, la présence de cellules immunitaires. Dans les lésions avancées, les cellules immunitaires seront absentes et volumineuses. Des lésions de type VA se trouvent à leur place.

À l’aide d’une section cardiaque de cinq microns sur des lames de verre chargées positivement, congelez d’abord les sections, puis décongelez-les et laissez-les sécher à l’air. Fixez les lames dans une forme tamponnée à 10 % pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius. Retirez ensuite le fixateur avec trois lavages et PBS pendant cinq minutes par lavage.

Poursuivre par perméabilité du tissu avec 0,2 % de tritton X 100 dans du PBS pendant 15 minutes. Retirez le détergent avec trois autres lavages en PBS droit. Ensuite, bloquez le tissu avec 10 % de sérum de couche de PBS pendant une heure après un rinçage dans PBS, couvrez la section avec de l’antisérum pendant deux heures à 37 degrés Celsius.

Traiter les témoins négatifs avec un antisérum de lapin naïf Étant donné que le tissu cardiaque absorbe facilement la coloration immunofluorescente XI, ce qui entraîne des niveaux de fond élevés, la concentration pendant le temps d’incubation pour différents types d’anticorps devra probablement être optimisée Deux heures plus tard, lavez le sérum antis avec du PBS. Remplacez ensuite la solution par un anticorps secondaire et laissez les lames incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Appliquez maintenant le DPI à cinq milligrammes par millilitre et lavez les lames avec du PBS.

Enfin, montez les lames dans le sol, enregistrez-les et imagez-les avec la microscopie confocale. Commencez par retirer la paraffine et hydrater les sections de tissus. Utilisez des lavages au xylène suivis d’une série graduelle de lavages à l’alcool.

Ensuite, baignez les sections dans 0,2 % d’acide métique phospho pendant cinq minutes, suivi d’un rinçage à l’eau de cinq minutes de la tache suivante avec 0,1 % d’acide rouge et d’acide rouge grave pendant deux heures. Ensuite, lavez les sections avec de l’acide chlorhydrique normal 0,01 pendant trois minutes et rincez-les avec de l’éthanol à 70 % pendant une minute. Maintenant, déshydratez les sections en inversant la série de bains d’alcool gradués, suivie de lavages au xylène à l’aide d’un montage de microscopie optique et évaluez les lames.

Les souris ont développé une pneumocoque invasive à la suite d’un défi avec le tigre. Quatre microlésions cardiaques de souche ont été observées dans les ventricules et une augmentation de la taille et du nombre de lésions a été notée entre 24 et 30 heures après l’infection pour vérifier que la pneumonie se trouvait bien dans les lésions. Des coupes ont été colorées pour le polysaccharide capsulaire de sérotype quatre produit par Tiger four.

Cela a confirmé la présence d’agrégats denses et serrés à l’intérieur des sites de microlésions. Une coloration rouge grave a été réalisée sur des coupes cardiaques de souris qui avaient été sauvées avec de l’ampicilline et des témoins non infectés. Dans les sauvetages.

Il y avait une augmentation spectaculaire de la présence et de l’intensité de la tache, avec des bandes s’écoulant de ce qui semble être d’anciens sites de lésion dans les ventricules. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’infecter les souris avec une utilisation suffisante de la pneumonie S pour permettre à l’infection de se poursuivre pendant au moins 28 à 30 heures afin que la bactériémie et les microlésions cardiaques aient suffisamment de temps pour se former.