Name: Tumeur primaire et MEF cellule disolement pour étudier métastases pulmonaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Découvrez l'isolation de cellules tumorales primaires et de fibroblastes embryonnaires de souris pour étudier la tumorigenèse du cancer du sein et les métastases pulmonaires chez les modèles murins transgéniques.

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Nous tenons à remercier le NIH, le LACaTS et la fondation de la clinique Ochsner pour leur soutien financier.

Toutes les expériences de souris ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Institutional Animal Care et utilisation comités (IACUC) de LSU School of Medicine. Tous les instruments doivent être stérilisés à l&#39;autoclave avant la dissection. 1. Préparation des cellules primaires de tumeurs mammaires de souris <ol><li> Utiliser un modèle de souris qui a été génétiquement modifié avec la souris tumeur mammaire Virus Polyome Moyen T-Antigen (de la souris MMTV-PyMT transgénique), qui développent spontanément des tumeurs comme décrit précédemment 6. </li><li> Sacrifiez souris avec l&#39;isoflurane (99,9%) et pulvériser 75% d&#39;éthanol pour assurer un environnement stérile (figure 1A). </li><li> Ouvrir la peau à partir de la zone de l&#39;orifice urétral pour le cou avec des ciseaux. Epingler la peau vers le bas pour permettre un accès facile pour les organes (Figure 1B). </li><li> Isoler la tumeur mammaire du sein et laver avec de froid phosphate stérile saline tamponnée (PBS) (pH 7,4) (figure 1C). </li><li> Transférer la tumeurune plaque de culture tissulaire de 10 cm stérile et couper avec des ciseaux et une lame de rasoir stérile à 1 mm environ trois morceaux. Les étapes suivantes devraient être effectuées dans une hotte à flux laminaire stérile. </li><li> Incuber le tissu tumoral hachée avec de la collagénase dissous dans un milieu de DMEM exempt de sérum à une concentration finale de 1 mg / ml sur une bascule pendant 2 heures à 37 ° C. Centrifuger la suspension de tissu de la tumeur pendant 3 min à 200 x g. NOTE: L&#39;incubation de la collagénase est essentiel pour la dissociation enzymatique du tissu. </li><li> Jeter le surnageant et laver le précipité trois fois avec du PBS (pH 7,4) par centrifugation pendant 3 minutes à 200 x g. Après le lavage final, décanter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le tissu avec 2 ml de trypsine EDTA pendant 5 min à 37 ° C tout en déplaçant en nutation. Centrifuger la suspension pendant 3 min à 200 xg et répéter les lavages. </li><li> Remettre en suspension le culot de tissus dans un milieu de croissance normal (DMEM, 10% de FBS, 2 x pen / strep) sur une plaque de 10 cm. Changementles médias tous les jours pour les 3 prochains jours. des cellules de culture jusqu&#39;à ce que le nombre de cellules désiré soit obtenu. REMARQUE: Environ 1x10 7 cellules sera isolé de cette procédure. D&#39;autres modèles de tumorigenèse mammaire de la souris, telles que MMTV-Neu, donnent un rendement plus faible de cellules par rapport à MMTV-PyMT. Lors de l&#39;utilisation des modèles qui produisent un rendement plus faible, il est avantageux de commencer avec un plus grand cellules tumorales et de culture plus longues. </li></ol> 2. Souris Lung Extraction de visualiser métastases pulmonaires <ol><li> Avant l&#39;extraction du poumon, le foie et supprimer le diaphragme. Déloger les côtes sans déranger les poumons. </li><li> Avec une belle paire de ciseaux, ouvrez la partie supérieure de la trachée, qui est plus proche de la veine jugulaire. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un cathéter, injecter un agent tel que 1 ml de Z-fixage ou l&#39;encre de Chine à travers la trachée pour remplir les poumons (Figure 2A). Incluez le Z-fix Poumons dans de la paraffine. </li><li> De-tache les poumons injectés avec l&#39;encre de Chine dans la solution de Fekete(100 ml 70% d&#39;alcool, 10 ml de formaline à 10% tamponnée et 5 ml d&#39;acide acétique glacial) pendant 5 min. Définir les nodules tumoraux dans des sites secondaires avec a ≥ 0,5 mm de diamètre, déterminer que les nodules métastases. NOTE: En raison de l&#39;obstruction des bronches et des bronchioles par la tumeur, nodules tumoraux ne peuvent pas absorber 15% d&#39;encre de Chine, et donc le tissu pulmonaire normale seront en noir et nodules tumoraux seront de couleur blanche 7. Cela permettra la visualisation des nodules tumoraux individuels (Figure 2B). </li></ol> 3. Préparation de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) à partir embryons de souris <ol><li> Sacrifiez souris enceintes avec l&#39;isoflurane (99,9%) et pulvériser 75% d&#39;éthanol pour assurer un environnement stérile. </li><li> Ouvrir la peau à partir de la zone de l&#39;orifice urétral pour le cou avec des ciseaux et isoler les embryons de l&#39;utérus. </li><li> Veillez à ne pas déranger les embryons lors de l&#39;ouverture de la peau. </li><li> Retirez les cornes utérines et les rincer à ste froidrile PBS (pH 7,4). </li><li> Séparer l&#39;embryon de son placenta très soigneusement et placer des embryons dans une plaque de 10 cm contenant PBS glacé (pH 7,4). </li><li> Retirer la tête, le foie et l&#39;intestin de l&#39;embryon et placer la partie restante dans une plaque de culture tissulaire de 12 puits contenant du PBS (pH 7,4). </li><li> Transférer le corps de l&#39;embryon à un autre 12 plaque puits contenant la trypsine EDTA et les couper en petits morceaux (~ 1 mm 3) à l&#39;aide d&#39;une lame de rasoir et les ciseaux stérile. Incuber le matériau haché avec 5 ml de trypsine EDTA pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Inactiver la trypsine par addition de 1 ml de sérum bovin fœtal (FBS) pour les embryons hachées. Centrifugeuse la suspension à 200 vitesse de g pendant 10 min, retirez avec précaution le surnageant, remettre en suspension le culot avec 1 ml de milieu de DMEM chaud et transférer tout le contenu dans un plat de 10 cm contenant 10 ml de DMEM (avec 20% de FBS et 2X pénicilline / streptomycine ). </li><li> Changer le support chaque jour pendant deux jours. Culture des cellules jusqu&#39;à ce que la cellule souhaitéenombre est atteint. </li></ol>

<ol><li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Natur%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).</li>
<li>Poste, G., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Natur%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of cancer metastasis.</a> Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).</li>
<li>Wan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Metastasis+Moving+New+Biological+Insights+into+the+Clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic.</a> Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).</li>
<li>Bergers, G., Benjamin, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenesis+and+the+angiogenic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumorigenesis and the angiogenic switch.</a> Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).</li>
<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mouse+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Maximizing mouse cancer models.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).</li>
<li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene%3A+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).</li>
<li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+Identification+of+Experimental+Pulmonary+Metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases.</a> J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).</li>
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<li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Re%22%5BJournal%5D)">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Re. 8 (4), 212(2006).</li>
<li>Veer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+predicts+clinical+outcome+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer.</a> Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs ont aucune divulgation.

Ce protocole est destiné à isoler des cellules primaires à partir d&#39;une tumeur de souris frais. Les lysats préparés à partir de ce procédé sont utiles pour les protéines, l&#39;ADN et analyse de l&#39;ARN. Les cellules cancéreuses de la tumeur primaire du sein métastasent souvent vers le cerveau, les poumons et les os 1. Inclus est une technique pour extraire le poumon pour la détection des métastases. La coloration du poumon avec une tache d&#39;encre permettra la visualisation des nodules tumoraux comme...

Les métastases sont la dernière étape de la progression du cancer du sein 1. Il implique une série d’étapes au cours desquelles les cellules malignes sont libérées de la tumeur primaire et disséminées vers d’autres organes 2. Les cellules doivent être capables d’intravaser, de survivre en circulation, d’extravaser vers des organes éloignés et de survivre dans ce nouveau système d’organes 3. Chaque étape de la tumorigenèse est étroitement contrôlée par les cellules à travers divers changements génétiques et épigénétiques 4. Pour étudier les mécanismes de la tumorigenèse du cancer du sein, des systèmes modèles murins ont été utilisés en raison de leur courte durée de vie, de leur petite taille et de leur temps de reproduction rapide. Certains des principaux avantages de l’utilisation de modèles murins dans la recherche sur le cancer sont les similitudes moléculaires et physiologiques qu’ils partagent avec les humains 5. 
Les lignées cellulaires de souris et humaines établies ont été largement utilisées dans la recherche sur le cancer du sein. Bien que nous puissions obtenir des informations sur les étapes des métastases en utilisant ces cellules, des modèles animaux génétiquement manipulés avec des suppresseurs de tumeurs / oncogènes donneront beaucoup plus d’informations sur le développement tumoral et les métastases à partir du stade embryonnaire. Ainsi, avec ces modèles murins, nous pouvons obtenir une régulation génétique et développementale de la croissance tumorale. De plus, le microenvironnement tumoral joue également un rôle important dans l’expression des gènes des cellules tumorales et il peut être difficile d’imiter le même scénario avec des études utilisant des lignées cellulaires établies. Les tumeurs mammaires humaines primaires peuvent également être utilisées pour étudier la tumorigenèse mammaire de souris. Le principal inconvénient de l’utilisation de tumeurs mammaires isolées est que cette tumeur nouvellement implantée n’a pas le système vasculaire et le tissu lymphatique de la souris. Alors que les systèmes de modèles génétiques de souris pour l’étude de la tumorigenèse mammaire nous permettront de surveiller les étapes des métastases, d’analyser le microenvironnement tumoral et d’accéder à l’ensemble du corps 5.
L’objectif global de ce protocole est d’étudier la tumorigenèse mammaire chez la souris. On sait que les cancers du sein métastasent généralement au cerveau, aux poumons et aux os. Ce protocole permet d’isoler les cellules tumorales mammaires primaires, ainsi que d’étudier les métastases du cancer du sein au poumon. De plus, un autre protocole d’analyse des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) de l’embryon de souris est inclus. Ensemble, ces techniques sont utiles pour étudier la tumorigenèse mammaire de souris.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td>Magasin à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA</td><td>Life&nbsp ; technologies</td><td>25300-062</td><td>Stocker à &ndash ; 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Collagénase Type IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>Magasinez à &ndash ; 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>hyaluronidase</td><td>sigma-aldrich</td><td>H3506</td><td>Magasin à &ndash ; 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Life&nbsp ; technologies</td><td>15140-122</td><td>Magasin à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td>Magasin à &ndash ; 80 &deg ; C</td></tr><tr><td>Z-fix</td><td>ANATECH#</td><td>174</td><td>Boutique chez RT</td></tr><tr><td>India Ink</td><td>Yasutomo</td><td></td><td>Boutique chez RT</td></tr><tr><td>AERRANE (Isoflurane)</td><td>Baxter</td><td>NDC 10019-773-60</td><td>Boutique chez RT</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>EMD</td><td>AX0441-3</td><td>Boutique chez RT</td></tr></tbody></table>

tumeur primaire et mef cellule d&#39;isolement pour étudier métastases pulmonaires

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

Dans la tumorigenèse mammaire, le stade métastatique de la maladie constitue la plus grande menace pour l’individu atteint. Les cellules mammaires normales avec des génotypes modifiés possèdent maintenant la capacité d’envahir et de survivre dans d’autres tissus. Dans ce protocole, les tumeurs mammaires de souris sont retirées et des cellules primaires sont préparées à partir des tumeurs. Les cellules isolées de cette procédure sont ensuite disponibles pour des expériences de profilage génétique. Pour que les métastases réussissent, ces cellules doivent être capables d’intravaser, de survivre dans la circulation, d’extravaser vers des organes éloignés et de survivre dans ce nouveau système organique. Les poumons sont la cible typique des métastases du cancer du sein. Un ensemble de gènes a été découvert qui médie la sélectivité des métastases dans le poumon. Nous décrivons ici une méthode d’étude des métastases pulmonaires à partir d’un modèle de souris génétiquement modifié. De plus, un autre protocole d’analyse des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) de l’embryon de souris est inclus. Les cellules MEF du même type animal fournissent un indice de l’expression des gènes cellulaires non cancéreux. Ensemble, ces techniques sont utiles pour étudier la tumorigenèse mammaire de souris, ses mécanismes de signalisation associés et les voies des anomalies chez les embryons.

Le stade de progression de la tumeur à laquelle sacrifier l&#39;animal dépend de l&#39;étude particulière et des lignes directrices du IACUC. Dans la figure 1A, 100 aujourd&#39;hui âgé de souris C57BL / 6 avec la souris tumeur mammaire Virus Polyome Moyen T-Antigen (MMTV-PyMT) a été sacrifié à trois mois. La peau a été ouvert à partir de la zone de l&#39;orifice de l&#39;urètre à la nuque avec des ciseaux et de la peau a été clouée au sol pour permettre un accès facile à des organes comme le montre <str...

L’objectif de ce protocole est d’étudier la tumorigenèse mammaire. Avec cette technique, les tumeurs mammaires de souris sont retirées et des cellules primaires sont préparées à partir des tumeurs. Un protocole d’extraction pulmonaire est inclus pour l’étude des métastases pulmonaires. De plus, un autre protocole d’analyse des fibroblastes embryonnaires de souris à partir de l’embryon de souris est inclus.

Tumeur primaire et MEF cellule d&#39;isolement pour étudier métastases pulmonaires

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier l'agenèse tumorale du cancer du sein chez la souris. Premièrement, la préparation de cellules primaires issues de tumeurs mammaires de souris est démontrée. Ensuite, la méthode d'extraction du poumon de souris pour visualiser les métastases pulmonaires est présentée.Enfin, la préparation de fibroblastes embryonnaires de souris à partir d'embryons de souris est présentée en dernier lieu, car ces méthodes montrent que des souris transgéniques pour le virus du mammary tumor virus de la souris portant l'antigène intermédiaire T du polyoma peuvent être utilisées pour étudier l'histogenèse tumorale du cancer du sein. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le cancer du sein, elle peut également être appliquée à l'étude d'autres tumeurs solides. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car il est important d'isoler uniquement les tumeurs et non d'autres tissus lors des étapes de dissection tumorale. Commencez par utiliser des ciseaux pour ouvrir la peau depuis l'orifice urétral jusqu'au cou d'une souris transgénique portant l'antigène intermédiaire T du polyoma du virus du mammary tumor virus de la souris.Ensuite, fixez la peau et isolez la tumeur mammaire. Lavez la tumeur in situ avec du PBS froid et placez la tumeur dans une boîte de culture tissulaire stérile de 10 centimètres. Ensuite, transférez la boîte dans une hotte à flux laminaire stérile et utilisez une lame de rasoir stérile et des ciseaux pour découper la tumeur en morceaux d'un millimètre cube.Incuber les morceaux avec la collagénase sur un agitateur rotatif à 37 degrés Celsius. Après deux heures, centrifuger la suspension de tissu tumoral obtenue. Laver le culot trois fois supplémentaires dans du PBS Resus, puis suspendre le culot dans deux millilitres de trypsine-EDTA pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius avec agitation.Ensuite, lavez les cellules trois fois supplémentaires et resuspendez-les dans un milieu de croissance normal. Enfin, incubez les cellules dans une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres, en changeant le milieu tous les jours pendant les trois jours suivants jusqu'à l'obtention du nombre de cellules souhaité. Avant d'extraire le poumon, retirez le foie et le diaphragme et détachez les côtes.Ensuite, ouvrir la partie supérieure de la trachée, près de la veine jugulaire, et utiliser un cathéter pour injecter l'agent approprié par la trachée afin de remplir les poumons, retirer les poumons, puis, si l'on utilise Z fix, inclure le tissu dans du paraffine. Si l'on utilise de l'encre de Chine, laisser le tissu dans la solution inec pendant cinq minutes ; le tissu pulmonaire normal apparaîtra de couleur noire, tandis que les nodules tumoraux apparaîtront en blanc. Classer comme métastases tous les nodules tumoraux observés au niveau des sites secondaires dont le diamètre est supérieur ou égal à 0,5 millimètre, afin de générer des fibroblastes embryonnaires de souris.Tout d'abord, ouvrez la peau d'une souris gravide de l'orifice urétral jusqu'au cou, comme vient de l'être démontré, en prenant soin de ne pas perturber les embryons. Ensuite, retirez les cornes utérines et rincez-les dans du PBS stérile. Puis, séparez soigneusement les embryons du placenta, un par un.Placer chaque embryon dans une boîte de culture de 10 centimètres contenant du PBS glacé. Après avoir retiré la tête, le foie et l'intestin, rincer la partie restante de l'embryon dans un puits d'une plaque de culture tissulaire 12 puits contenant du PBS, puis découper le corps en morceaux d'un millimètre cube. Transférer dans un autre puits contenant cinq millilitres de trypsine-EDTA et incuber le tissu à 37 degrés Celsius.Après cinq minutes, ajouter un millilitre de SFB pour inhiber la digestion. Ensuite, centrifuger la suspension cellulaire obtenue et resuspendre le culot. Dans un millilitre de DMEM chaud, transférer finalement les cellules dans une boîte de culture de 10 centimètres contenant 10 millilitres de DMEM supplémenté en antibiotiques, et cultiver les cellules jusqu'à l'obtention du nombre cellulaire souhaité.Le stade de progression tumorale auquel sacrifier l'animal dépend de l'étude particulière et des directives du comité d'éthique I-A-C-U-C. Par exemple, cette souris FVB âgée de 100 jours, porteuse du virus du mammary tumor virus de la souris exprimant l'antigène T intermédiaire du polyomavirus, a été sacrifiée trois mois après l'isolement d'une tumeur, comme vient d'être démontré pour le sein de souris. Des cellules tumorales primaires ont été obtenues.Étant donné que de nombreux gènes interviennent dans la métastase du cancer du sein vers le poumon, les poumons ont également été prélevés, comme vient d'être démontré, afin d'étudier le processus métastatique. Les poumons ont ensuite été gonflés avec du Z fix et colorés à l'encre de Chine pour visualiser les nodules tumoraux. Ici, des fibroblastes embryonnaires de souris, isolés d'embryons de souris de souche FVB, sont présentés.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des cellules tumorales primaires de souris et des fibroblastes embryonnaires de souris, ainsi que comment extraire le poumon de souris. N’oubliez pas que le travail avec le fluor iso peut être extrêmement dangereux, c’est pourquoi des précautions, telles que de travailler sous une hotte chimique F, doivent toujours être prises pendant l’exécution de cette procédure.

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Découvrez l'isolation de cellules tumorales primaires et de fibroblastes embryonnaires de souris pour étudier la tumorigenèse du cancer du sein et les métastases pulmonaires chez les modèles murins transgéniques.

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