Tumeur primaire et MEF cellule d'isolement pour étudier métastases pulmonaires

L'objectif général de cette procédure est d'étudier l'agenèse tumorale du cancer du sein chez la souris. Premièrement, la préparation de cellules primaires issues de tumeurs mammaires de souris est démontrée. Ensuite, la méthode d'extraction du poumon de souris pour visualiser les métastases pulmonaires est présentée.

Enfin, la préparation de fibroblastes embryonnaires de souris à partir d'embryons de souris est présentée en dernier lieu, car ces méthodes montrent que des souris transgéniques pour le virus du mammary tumor virus de la souris portant l'antigène intermédiaire T du polyoma peuvent être utilisées pour étudier l'histogenèse tumorale du cancer du sein. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le cancer du sein, elle peut également être appliquée à l'étude d'autres tumeurs solides. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car il est important d'isoler uniquement les tumeurs et non d'autres tissus lors des étapes de dissection tumorale. Commencez par utiliser des ciseaux pour ouvrir la peau depuis l'orifice urétral jusqu'au cou d'une souris transgénique portant l'antigène intermédiaire T du polyoma du virus du mammary tumor virus de la souris.

Ensuite, fixez la peau et isolez la tumeur mammaire. Lavez la tumeur in situ avec du PBS froid et placez la tumeur dans une boîte de culture tissulaire stérile de 10 centimètres. Ensuite, transférez la boîte dans une hotte à flux laminaire stérile et utilisez une lame de rasoir stérile et des ciseaux pour découper la tumeur en morceaux d'un millimètre cube.

Incuber les morceaux avec la collagénase sur un agitateur rotatif à 37 degrés Celsius. Après deux heures, centrifuger la suspension de tissu tumoral obtenue. Laver le culot trois fois supplémentaires dans du PBS Resus, puis suspendre le culot dans deux millilitres de trypsine-EDTA pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius avec agitation.

Ensuite, lavez les cellules trois fois supplémentaires et resuspendez-les dans un milieu de croissance normal. Enfin, incubez les cellules dans une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres, en changeant le milieu tous les jours pendant les trois jours suivants jusqu'à l'obtention du nombre de cellules souhaité. Avant d'extraire le poumon, retirez le foie et le diaphragme et détachez les côtes.

Ensuite, ouvrir la partie supérieure de la trachée, près de la veine jugulaire, et utiliser un cathéter pour injecter l'agent approprié par la trachée afin de remplir les poumons, retirer les poumons, puis, si l'on utilise Z fix, inclure le tissu dans du paraffine. Si l'on utilise de l'encre de Chine, laisser le tissu dans la solution inec pendant cinq minutes ; le tissu pulmonaire normal apparaîtra de couleur noire, tandis que les nodules tumoraux apparaîtront en blanc. Classer comme métastases tous les nodules tumoraux observés au niveau des sites secondaires dont le diamètre est supérieur ou égal à 0,5 millimètre, afin de générer des fibroblastes embryonnaires de souris.

Tout d'abord, ouvrez la peau d'une souris gravide de l'orifice urétral jusqu'au cou, comme vient de l'être démontré, en prenant soin de ne pas perturber les embryons. Ensuite, retirez les cornes utérines et rincez-les dans du PBS stérile. Puis, séparez soigneusement les embryons du placenta, un par un.

Placer chaque embryon dans une boîte de culture de 10 centimètres contenant du PBS glacé. Après avoir retiré la tête, le foie et l'intestin, rincer la partie restante de l'embryon dans un puits d'une plaque de culture tissulaire 12 puits contenant du PBS, puis découper le corps en morceaux d'un millimètre cube. Transférer dans un autre puits contenant cinq millilitres de trypsine-EDTA et incuber le tissu à 37 degrés Celsius.

Après cinq minutes, ajouter un millilitre de SFB pour inhiber la digestion. Ensuite, centrifuger la suspension cellulaire obtenue et resuspendre le culot. Dans un millilitre de DMEM chaud, transférer finalement les cellules dans une boîte de culture de 10 centimètres contenant 10 millilitres de DMEM supplémenté en antibiotiques, et cultiver les cellules jusqu'à l'obtention du nombre cellulaire souhaité.

Le stade de progression tumorale auquel sacrifier l'animal dépend de l'étude particulière et des directives du comité d'éthique I-A-C-U-C. Par exemple, cette souris FVB âgée de 100 jours, porteuse du virus du mammary tumor virus de la souris exprimant l'antigène T intermédiaire du polyomavirus, a été sacrifiée trois mois après l'isolement d'une tumeur, comme vient d'être démontré pour le sein de souris. Des cellules tumorales primaires ont été obtenues.

Étant donné que de nombreux gènes interviennent dans la métastase du cancer du sein vers le poumon, les poumons ont également été prélevés, comme vient d'être démontré, afin d'étudier le processus métastatique. Les poumons ont ensuite été gonflés avec du Z fix et colorés à l'encre de Chine pour visualiser les nodules tumoraux. Ici, des fibroblastes embryonnaires de souris, isolés d'embryons de souris de souche FVB, sont présentés.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des cellules tumorales primaires de souris et des fibroblastes embryonnaires de souris, ainsi que comment extraire le poumon de souris. N’oubliez pas que le travail avec le fluor iso peut être extrêmement dangereux, c’est pourquoi des précautions, telles que de travailler sous une hotte chimique F, doivent toujours être prises pendant l’exécution de cette procédure.