Analyse génétique accrue des simples bioparticules droits récupérés par micromanipulation simplifié du Forensic Evidence 'Touch ADN'

L’objectif global de cette procédure est de récupérer des cellules individuelles ou agglomérées appelées bioparticules présumées à partir de preuves ADN tactiles médico-légales et d’obtenir un profil ADN du donneur. Lors de la perpétration d’un crime violent, un petit nombre de cellules sont transférées d’un individu à un autre, par exemple lorsqu’un agresseur saisit le poignet d’une victime. Afin de récupérer d’abord le petit nombre de cellules, utilisez un film de gel à faible adhérence fixé à une lame de microscope pour échantillonner la zone de contact.

La deuxième étape consiste à colorer les bioparticules transférées pour faciliter la visualisation au microscope. Ensuite, isolez les bioparticules du film de gel à l’aide de la micromanipulation. Prélevez l’adhésif soluble dans l’eau à la pointe d’une aiguille en tungstène et utilisez-le pour éliminer les bioparticules d’intérêt de la surface du film de gel.

La dernière étape consiste à transférer soigneusement les bioparticules collectées individuellement dans un mélange d’amplification PCR au fond de l’ADN Une collection PCR à des méthodes de typage d’ADN améliorées sont utilisées pour obtenir un profil ADN du donneur de traces d’ADN. D’accord, dans mon laboratoire, nous nous concentrons sur l’analyse génétique des petits nombres de cellules qui sont transférées lors de la perpétration d’un crime violent contre la personne entre un individu et un autre individu, ou entre un individu et un objet. Les méthodes traditionnelles ne parviennent souvent pas à récupérer le profil ADN d’un si petit nombre de cellules.

Ici, nous avons développé une méthode simplifiée pour la récupération physique et l’analyse génétique d’un si petit nombre de cellules, qu’il s’agisse de cellules individuelles ou d’agglomérats de cellules qui peuvent être incorporés dans n’importe quel laboratoire médico-légal. Katie Fairish, une étudiante diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, préparez le film de gel qui sera utilisé pour collecter les bioparticules.

Coupez le film de gel à la taille souhaitée et appropriée pour la lame de microscope en verre utilisée comme support solide. Par exemple, pour une lame de verre de trois pouces sur un pouce, utilisez la taille du film de gel de deux pouces sur 0,75 pouce. Retirez le support blanc du film de gel et fixez le film de gel à la lame de microscope en appuyant fermement pour assurer une fixation complète.

Notez qu’il y a une couche protectrice supérieure transparente qui ne doit pas être retirée pour permettre l’application d’une pression le long du morceau de film de gel sans contaminer la surface du film de gel ; les lames de film de gel préparées avec la couche protectrice attachée peuvent être stockées à température ambiante jusqu’à ce que nécessaire. Lorsque vous êtes prêt à utiliser le film de gel, utilisez une pince à épiler stérile pour retirer la couche protectrice supérieure transparente. Placez la surface du film de gel en contact direct avec un objet ou une surface touchée souhaitée.

Par exemple, la peau humaine du poignet. Appliquez une petite pression pour assurer un transfert efficace des bioparticules vers le film de gel. N’appliquez pas trop de pression car la lame de verre pourrait se briser, plusieurs échantillons du même objet ou de la surface peuvent être collectés sur le même morceau de film de gel. De la même manière, les bioparticules peuvent être collectées à partir d’objets et de vêtements tels qu’un col de chemise.

Pour confirmer le transfert de bioparticules sur le film de gel, examinez la lame au microscope stéréoscopique à l’aide d’un éclairage trans ou épi. Un grossissement d’environ 20 x est idéal pour visualiser de plus grandes zones du film de gel, tandis qu’un grossissement d’environ 200 x est idéal pour visualiser des bioparticules individuelles. Conservez la lame d’échantillon de film de gel à température ambiante dans une boîte de lames couverte.

Jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour la coloration et/ou la collecte de bioparticules, les bioparticules peuvent être colorées pour faciliter la visualisation. Pour ce faire, placez d’abord la lame d’échantillon de film de gel préparée comme indiqué précédemment sur un support de coloration de diapositive au-dessus d’un évier. À l’aide d’une pipette de transfert jetable, couvrez toute la surface du film de gel avec une coloration bleu trian, incubez à température ambiante pendant une à deux minutes.

Enlevez l’excès de teinture en inclinant la glissière pour permettre à la tache de s’écouler dans l’évier si nécessaire. La lame peut être rincée en l’inondant doucement avec de l’eau stérile à l’aide d’une pipette de transfert jetable. Une fois que la lame a été aérée et sèche, observez-la à l’aide d’un stéréomicroscope pour vous assurer d’une coloration correcte.

La lame tachée peut être stockée à température ambiante dans une boîte à lames couverte. Commencez cette procédure en plaçant le nombre approprié de tubes PCR de 0,2 millilitre dans un rack et en étiquetant les tubes de manière appropriée. Préparez un volume approprié de mélange d’amplification STR pour le nombre souhaité d’échantillons.

Vortex et master se mélangent bien et centrifugent brièvement dans un chemin PI de mini centrifugeuse. 3,5 microlitres d’amplification. Mélangez dans chaque tube de 0,2 millilitre et bouchez chaque tube sans serrer.

Placez un morceau de ruban adhésif double face directement sur un bloc de verre. Il sera utilisé pour maintenir le tube de 0,2 millilitre en place pendant le prélèvement de l’échantillon. Placez un autre morceau de ruban adhésif double face sur une lame de microscope en verre propre.

Placez ensuite un morceau de ruban adhésif soluble dans l’eau sur le ruban adhésif double face. Fixez le ruban en position en appliquant une pression sur toute la longueur du ruban. La couche supérieure blanche protectrice peut alors être retirée.

Placez ensuite le premier tube de 0,2 millilitre sur le ruban adhésif double face sur le bloc de verre. Mettez ce tube de côté jusqu’à ce que l’échantillon soit prélevé. Placez la diapositive de ruban adhésif soluble dans l’eau sous le microscope tout en regardant à faible grossissement.

Utilisez la pointe d’une aiguille pour gratter doucement la surface du ruban afin de recueillir la petite quantité ou la boule d’adhésif à l’extrémité de l’aiguille. La taille de la boule d’adhésif dépendra du nombre de bioparticules à collecter soigneusement. Retirez les langues.

Placez l’aiguille avec de l’adhésif sous le microscope sans déranger la pointe de l’aiguille. Placez l’aiguille dans un support si nécessaire. L’aspect le plus critique de la procédure est la collecte et le transfert des bioparticules.

Pour assurer le succès, les techniques doivent être pratiquées jusqu’à ce que l’analyste les maîtrise. Placez un échantillon de film de gel préalablement préparé sur la platine du microscope à l’aide d’un bloc de verre pour soutenir la lame. Ajustez la mise au point et le grossissement jusqu’à ce que les bioparticules puissent être facilement visualisées.

Identifiez les bioparticules qui seront collectées. Récupérez l’aiguille de tungstène avec la bille adhésive et placez l’aiguille sur la surface du film de gel où se trouvent les bioparticules d’intérêt. Appuyez sur la pointe de l’aiguille pour qu’elle soit en contact avec la bioparticule.

Soulevez l’aiguille pour vous assurer que la bioparticule a été recueillie. Répétez ce processus jusqu’à ce que le nombre souhaité de bioparticules ait été collecté. Placez un tube PCR de 0,2 millilitre préparé sur la platine du microscope.

Ajustez le grossissement de manière à ce que le bas du tube contenant le mixage d’amplification soit net. Pendant l’observation au microscope, insérez soigneusement l’aiguille de tungstène dans le tube PCR de 0,2 millilitre jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille soit dans le mélange d’amplification. Maintenez l’aiguille dans le mélange d’amplification jusqu’à ce que l’adhésif se dissolve et que la libération de bioparticules dans la solution soit observée.

Retirez l’aiguille. Placez le tube de 0,2 millilitre à la verticale et bouchonnez-le sans serrer. Nettoyez l’aiguille en tungstène avec une lingette imbibée d’alcool préalablement humidifiée et répétez cette procédure de prélèvement pour des échantillons supplémentaires.

Pour commencer le protocole d’amplification amélioré pour le profilage autosomique STR des bioparticules collectées, ajoutez 1,5 microlitre de tampon de lyse à chaque tube de 0,2 millilitre contenant un mélange d’amplification et les bioparticules ferment hermétiquement les couvercles des tubes. Placez les échantillons dans le thermocycleur et amplifiez-les en utilisant les conditions de cyclage décrites dans le texte du protocole lorsque l’amplification est terminée. Stockez les produits d’amplification à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être détectés par électrophorèse capillaire.

Aucune image représentative de bioparticules individuelles dans un échantillon de col de chemise n’est montrée. Les bioparticules collectées sont encerclées. Les cercles rouges indiquent qu’un profil a été récupéré.

Le pourcentage de récupération de l’allèle est inclus. Les cercles noirs indiquent qu’un profil n’a pas été récupéré. De même, ces images sont des bioparticules agglomérées dans un échantillon de col de chemise

Sa précision a été déterminée par comparaison avec un profil de référence. Les numéros d’allèles sont désignés sous chaque pic à chaque locus. L’axe x représente la taille du fragment et l’axe Y représente l’intensité du signal.

Ce profil est de haute qualité avec des hauteurs de pic inter locus raisonnablement équilibrées et aucune chute allélique. Ce profil suivant est un profil STR complet obtenu à partir de l’un des échantillons de bioparticules agglomérées du col de la chemise. Enfin, cette figure montre un exemple de profilage ADN infructueux d’une seule bioparticule avec une récupération de 3 % d’allèles.

Cette méthode devrait favoriser la récupération de profils d’ADN de source unique auprès des agresseurs dans les cas d’agression physique. Il n’a pas échappé à notre attention que cette méthode élimine également certains des problèmes associés à l’interprétation et à la déconvolution des profils d’ADN mixtes.