Name: Infection bactérienne systémique et défense immunitaire phénotypes Drosophila melanogaster (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Apprenez à infecter Drosophila melanogaster avec des bactéries et à quantifier la réponse immunitaire par charge bactérienne et expression de peptides antibactériens. Cette méthode permet d'étudier l'immunité innée.

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Nous tenons à remercier tout le laboratoire Lazzaro, et en particulier Susan Rottschaefer, pour leur aide dans la révision et le test de ces protocoles. C’est le produit de leur expertise cumulative. Les travaux dans le laboratoire Lazzaro sont soutenus par les subventions R01 AI083932 et R01 AI064950 des National Institutes of Health des États-Unis.

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Aucun des auteurs n’a d’intérêts concurrents ou conflictuels.

La procédure décrite ici donne l&#39;infection rigoureuse et de haute qualité de Drosophila melanogaster. Les exemples illustrés principalement axées sur l&#39;infection par Providencia rettgeri et E. coli, mais le protocole est très souple et peut être appliqué à diverses infections par des bactéries sur une plage de conditions d&#39;élevage de l&#39;hôte et de maintenance. Les détails d&#39;une approche expérimentale optimale dépendra de la bactérie utilisée pour l&#39;infection, le génotype de l&#39;hôte, et les conditions expérimentales générales. Il est fortement recommandé de test pilote de nouvelles conditions expérimentales avant de lancer des projets plus ambitieux. Un bon point de départ est de tester trois doses d&#39;infection sur une plage de 100 fois. Hautement pathogènes virulents sont souvent les mieux introduits à des doses infectieuses très faibles, de l&#39;ordre de 10 à 100 cellules bactériennes par la mouche. Les agents pathogènes les plus modérés peuvent être injectés à des doses plus élevées de près de 1000 bactéries par fly, et non pathogènes peuvent être injectés à des doses aussi élevées que 10 000 bactéries par volée. Il est souvent intéressant de définir les cinétiques de nouvelles infections par le suivi de la charge d&#39;agents pathogènes, la mortalité de l&#39;hôte, et l&#39;activité du système immunitaire au cours d&#39;une série chronologique longitudinal. Parce que la mesure de la charge de l&#39;agent pathogène et l&#39;expression des gènes de l&#39;hôte sont destructrices des dosages, il est nécessaire d&#39;infecter vol distinctes dès le début de l&#39;expérience pour chaque point dans le temps qui doit être mesuré. Lorsque vous décidez d&#39;utiliser piqûre ou une injection à base de micro-capillaire, il est important de noter qu&#39;il ya des avantages et des limites de chaque approche. injection capillaire présente un volume de liquide dans la volée, ce qui à la fois augmente légèrement la pression de turgescence et introduit des sels ou d&#39;autres molécules qui sont en suspension ou dissous dans le véhicule. injection capillaire nécessite également l&#39;accès à un centre d&#39;injection ou l&#39;achat de l&#39;équipement nécessaire. Piqûre septique nécessite aucun équipement et introduit spécialemédias négligeables dans la volée, et est généralement plus efficace pour infecter un grand nombre de mouches. Cependant, les infections piqûre ne permettent pas un contrôle précis sur la dose infectieuse qui peut être atteint avec l&#39;injection capillaire. Le présent protocole axé sur un dispositif d&#39;injection qui régule mécaniquement le volume d&#39;injection, mais il ya également des systèmes d&#39;injection basé sur des impulsions discrètes de l&#39;air sous pression. 20,21 Ce sont généralement plus coûteux que l&#39;appareil présenté ici et nécessitent un étalonnage de l&#39;impulsion de l&#39;air à chaque aiguille afin d&#39;assurer les volumes d&#39;injection cohérentes. Il ya un débat considérable, mais très peu de données sur la façon dont les mouches deviennent infection systémique avec des bactéries à l&#39;état sauvage. Certains chercheurs avancent que la majorité des infections naturelles se produisent lorsque la drosophile ingérer des bactéries pathogènes et les bactéries sont ensuite en mesure d&#39;échapper à l&#39;intestin pour établir une infection systémique. Toutefois, il existe très few bactéries connues pour être capable de traverser l&#39;intestin de D. melanogaster, et ceux qui ont cette capacité sont hautement létale aux mouches 22,23. Une théorie alternative est ce qui vole régulièrement subir des blessures cuticulaires travers évasion de tentatives de prédation échoué ou attaque par des acariens ectoparasites. Cette hypothèse est soutenue par la collecte fréquente de D. sauvage melanogaster portant des taches de mélanisation qui sont indicatifs des plaies cicatrisées (observations non publiées). Les acariens ont été montrés pour transmettre des infections bactériennes chez la drosophile et 24 blessures laissées par les acariens peuvent être secondairement infecté par des bactéries dans les abeilles 25. Toutefois, la fréquence de la nature de l&#39;infection acariens ou autrement entraîné opportuniste de D. melanogaster travers violations de la cuticule est pas connue. Le protocole décrit ici permet l&#39;introduction de bactéries directement dans l&#39;hémolymphe par injection quantitative qui contourne toutes les barrières épithéliales ou immu comportementalesnité. Des procédés pour l&#39;alimentation des bactéries pathogènes à D. melanogaster ont été décrits dans Vodovar et al. 22 et Nehme et al. 23. Beaucoup de bactéries entomopathogènes posent peu ou pas de risque pour la santé humaine, ce qui permet aux chercheurs de travailler avec eux confortablement. En outre, très peu de bactéries ont la capacité d&#39;infecter la drosophile au contact sans intervention expérimentale, de sorte que le risque de &quot;épidémie&quot; propagation de l&#39;infection bactérienne par un laboratoire par des surfaces contaminées ou échappés vol est généralement très faible. Néanmoins, il est conseillé de veiller à ce que des mesures de confinement adéquates sont en place pour empêcher les mouches infectées de fuir et de reprendre tout vol échappé. Le laboratoire doit être équipé à un niveau de sécurité biologique en rapport avec celle des agents pathogènes utilisés, et les meilleures pratiques standard en microbiologie devrait être utilisé. Le infecti expérimentalela méthode décrite ici permet infections de Drosophila melanogaster avec toute dose de toute bactérie arbitraire. Une fois que l&#39;infection a été établie, il est simple de mesurer la cinétique de prolifération bactérienne ou dégagement, de suivre la mortalité de l&#39;hôte, et de doser l&#39;induction du système immunitaire de l&#39;hôte. Mouches infectées peuvent facilement être soumis à d&#39;autres tests phénotypiques, y compris les tests des fonctions physiologiques qui peuvent être de forme ou façonnés par l&#39;infection. Les procédures décrites sont peu coûteux, exigent relativement peu d&#39;équipement spécialisé, et sont faciles à apprendre, ce qui les rend prête pour une utilisation dans divers projets à travers une largeur de laboratoires de recherche et d&#39;enseignement.

La mouche des fruits Drosophila melanogaster est l&#39;un des organismes modèles de choix pour l&#39;étude de la fonction et l&#39;évolution de la défense immunitaire. Drosophila sont peu coûteux et facile à l&#39;arrière, sont extrêmement sensibles à la manipulation expérimentale, et sont soutenus par une communauté scientifique approfondie qui a développé un large gamme d&#39;outils de recherche. De nombreux aspects de l&#39;immunité innée sont conservées entre les insectes et les mammifères, y compris la transduction du signal médiée par les récepteurs Toll-like et NF-kB facteurs de transcription de la famille, la signalisation JAK / STAT, et les réponses de la voie JNK. 1,2 La fonction de ces gènes et les voies pouvez être interrogé dans D. melanogaster en utilisant des mutations ou ARNi passes rabattues qui augmentent ou voie de diminution des activités 3 - 6. En outre, la drosophile peut être utilisée pour étudier les conséquences physiologiques de l&#39;infection et la maladie, y compris dans le contexte de la théorie de l&#39;histoire de la vie évolutive 7.- 9 Toutes ces études, toutefois, dépendent de la capacité d&#39;infecter de manière fiable mouches expérimentales dans des conditions de traitement définies. La procédure décrite ici présente un cadre méthodologique pour la prestation des infections bactériennes robustes et reproductibles à Drosophila melanogaster et ensuite mesurer gravité de l&#39;infection et de quantifier la réponse immunitaire de l&#39;hôte. Drosophila peut être naturellement infectés expérimentalement et par une grande variété de parasites et d&#39;agents pathogènes, y compris les bactéries, les champignons, les virus, les nématodes et les guêpes parasites. Le protocole actuel est axé sur la prestation de l&#39;infection bactérienne systémique. Beaucoup de bactéries différentes peuvent être utilisés pour infecter des mouches, et le choix de l&#39;expérimentateur devraient être fondées sur les questions scientifiques précises posées. Par exemple, des isolats cliniques humains peuvent être utilisés pour étudier les mécanismes de virulence bactériennes 10, ou écologiquement isolats pertinents peuvent être prefererd pour l&#39;étude de l&#39;évolution. 11 Certaines bactéries sont pathogènes compétentes de D. melanogaster, la prolifération lors de l&#39;infection et causant la maladie ou la mort de l&#39;hôte. D&#39;autres bactéries sont gérées efficacement par le système immunitaire de l&#39;hôte et effacés en quelques jours. Dans cette démonstration, Providencia rettgeri sera utilisé comme un agent pathogène qui peut provoquer la prolifération de l&#39;hôte et la mortalité persiste dans des hôtes survivantes. Escherichia coli est utilisé comme un non-pathogène qui est interceptée par le système immunitaire de l&#39;hôte. L&#39;infection est établie par l&#39;introduction de bactéries directement dans la cavité du corps de la mouche. Cette approche contourne les barrières épithéliales et les comportements de protection, permettant l&#39;étude de l&#39;infection systémique quel que soit le mode naturel de transmission. Il existe deux méthodes principales pour établir expérimentalement l&#39;infection systémique. Dans la première, et un nanoinjector tiré aiguilles capillaires en verre sont utilisés pour injecter un nombre précis debactéries dans la volée. Cette méthode a l&#39;avantage de permettre une large gamme dynamique de doses d&#39;infection et d&#39;être quantitativement hautement reproductible. La seconde approche est de fournir une infection par une piqûre septique. Cette approche a l&#39;avantage d&#39;être rapide et ne nécessitant aucun équipement spécial. Une fois que les infections sont établis, il devient possible de mesurer la charge systémique d&#39;agents pathogènes, la mortalité de l&#39;hôte, et l&#39;activité immunitaire du système inductible. Bien entendu, un certain nombre de phénotypes supplémentaires pourrait éventuellement être mesurée D. infectée melanogaster, y compris post-infection fécondité 12, la capacité d&#39;apprentissage 13, état ​​métabolique 14, ou quasiment tout autre trait qui peut être imaginé.

<table><tbody><tr><td>L’incubateur</td><td>Powers Scientific, Inc</td><td>DROS52SD</td><td></td></tr><tr><td>Paintbrush</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Flypads FlyStuff</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas</td><td>CD FG50</td><td></td></tr><tr><td>Mélange d’élevage de drosophiles&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bouteilles à fond carré de 6 oz, polypropylène</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Nosterile Extra Large Cotton Balls</td><td>Fisher brand</td><td>22-456-882</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Vials polystyrène</td><td>VWR international</td><td>89092-720</td><td></td></tr><tr><td>Nosterile Large Cotton Balls</td><td>marque Fisher</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de 2 L</td><td>VWR international</td><td>89000-370</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri avec couvercles transparents, faîte surélevée ; 100 x 15 mm ;</td><td>VWR international</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Boucle d’innoculation</td><td>VWR international</td><td>80094-488</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Pipettes Clapet en différentes tailles 0.1 & micro ; l à 2 &micro ; l, 2 & micro ; l à 20 &micro ; l, 20 & micro ; l à 200 &micro ; l, 100 & micro ; l à 1 000 & micro ; l</td><td>Rainin</td><td>PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de micropipette (tailles assorties)</td><td>VWR international</td><td>30128-376 53503-810 16466-008</td><td></td></tr><tr><td>Base de bouillon Luria, Miller</td><td>Difco</td><td>241420</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de culture jetables Verre borosilicaté</td><td>VWR international</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>S-500 Orbital Agitateur</td><td>VWR international</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>VWR international</td><td>37001-300</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 10X</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 Spectrophotomètre</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes semi-microvolume</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur capillaire vertical</td><td>Kopf Needle Extracteur</td><td></td><td></td>de pipette</tr><tr><td>3.5'' Capillaires en verre de remplacement pour Nanojet II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Pinces</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Seringue</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale, Blanc, léger</td><td>Macron Produits chimiques fins</td><td>6358-10</td><td></td></tr><tr><td>Broches Minutein</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml&nbsp ; Tubes de microcentrifugation ; Rite du sceau</td><td>USA Scientific Inc.</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Pilon motorisé ; Agitateur de laboratoire Talboys</td><td>Troemner</td><td>103</td><td></td></tr><tr><td>Talboys Homogénéisateur à haut débit</td><td>OPS Diagnostics</td><td>930145</td><td></td></tr><tr><td>5/32'' Billes de broyage</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 156-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>Scientific indurstries inc.</td><td>G560</td><td></td></tr><tr><td>Pipette multicanaux (10 &mu ; l - 300 &mu ; l)</td><td>Sartorius</td><td>730360</td><td></td></tr><tr><td>WASP2 Whitley Automated Spiral Plater</td><td>Microbiology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProtoCOL automated colony counter / plate counter/ plate reader&nbsp ;</td><td>Microbiologie International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>tubes qPCR ; Bandelettes à profil bas de 0,2 ml à 8 tubes</td><td>Bio-Rad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>bouchons qPCR ; Bandelettes Optiques Plates À 8 Capuchons</td><td>Bio-Rad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNase Sans RNase</td><td>Promega</td><td>m610a</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Transcriptase Inverse</td><td>Promega</td><td>m170b</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1240</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; SsoAdvanced SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5260</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Système de détection PCR en temps réel</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5200</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Inhibiteur de ribonucléase</td><td>Promega</td><td>N2115</td><td></td></tr></tbody></table>

infection bactérienne systémique et défense immunitaire phénotypes<em&gt; drosophila melanogaster</em

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

La mouche Drosophila melanogaster est l&#39;un des organismes modèles de choix pour l&#39;étude de la fonction et l&#39;évolution de la défense immunitaire. De nombreux aspects de l&#39;immunité innée sont conservées entre les insectes et les mammifères, et depuis la drosophile peut facilement être manipulé génétiquement et expérimentalement, ils sont puissants pour étudier la fonction du système immunitaire et les conséquences physiologiques de la maladie. La procédure démontré ici permet l&#39;infection des mouches par l&#39;introduction de bactéries directement dans la cavité du corps, en contournant les barrières épithéliales et des formes plus passives de défense et permet de se concentrer sur l&#39;infection systémique. La procédure comprend les protocoles pour mesurer les taux de mortalité de l&#39;hôte, la charge systémique de l&#39;agent pathogène, et le degré d&#39;induction du système immunitaire de l&#39;hôte. Cette procédure d&#39;infection est peu coûteux, robuste et quantitativement reproductible, et peut être utilisé dans des études fonctionnelles de la génétique, l&#39;histoire évolutive de vie et la physiologie.

Cette section montre les résultats qui peuvent être obtenus après une infection bactérienne de Drosophila melanogaster. La figure 1 montre que la dose d&#39;infection varie en fonction de la densité optique de la suspension bactérienne utilisée pour l&#39;injection, et en ce que la dose délivrée peut être estimée de manière fiable par homogénéisation et le placage vole immédiatement après l&#39;injection . Comme illustré sur la figure 2, les différents agents pathogènes peuvent causer différents niveaux de mortalité hôte (Figure 2A) et de la mortalité de l&#39;hôte peut être dépendante de la dose (figure 2B). Surtout, ce protocole permet à différents types d&#39;infections à atteindre: Providencia rettgeri peut provoquer une infection chronique, sous-létale qui persiste pendant 20 jours ou plus (figure 3A). Cependant, d&#39;autres bactéries comme Escerichia coli seront principalement effacés par la mouche de l&#39;hôte dans les six heures post-infection (figure 3B). Induction des sys immunitairessystème peut être estimée par l&#39;isolement de l&#39;ARN et ultérieur qRT-PCR de transcrits de peptides antibactériens (Figure 4A et B). De manière analogue, mais moins quantitativement, les mouches exprimant la GFP sous le contrôle de promoteurs de gènes de peptide antimicrobien peut être utilisé pour visualiser l&#39;induction du système immunitaire (figure 4C). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig1.jpg" /> . Figure 1: Détermination de la dose infectieuse mouches ont été injectés avec 50 nl de suspensions bactériennes couvrant une gamme de densités optiques (de 0,0001 à 0,05). Les mouches ont été immédiatement homogénéisé et étalées pour déterminer le nombre de bactéries introduite par l&#39;injection. La charge bactérienne initiale fortement corrélé avec la DO initiale injecté (r 2 = 0,96) <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig2.jpg" /> <strong&gt; Figure 2:. La survie après injection avec bactéries pathogènes Cinq à sept jours vieux mâles ont été injectés avec 50 nl soit suspension bactérienne ou milieux stériles et surveillé pour la survie. (A) de type sauvage vol ont été injectés avec environ 5.000 bactéries à partir de l&#39;un des trois espèces différentes. Le taux de mortalité de l&#39;hôte dépend fortement des espèces bactériennes utilisées pour l&#39;infection. (B) de type sauvage vol ont été injectés avec trois doses différentes de Enterococcous faecalis - 50, 500 et 5000 bactéries par mouche. Les mouches meurent plus rapidement lorsqu&#39;ils sont infectés par des doses supérieures infectieuses (C) Un mutant du système immunitaire et sa ligne de contrôle isogénique de type sauvage ont été injectés avec environ 500 Burkholderia cepacia. Une comparaison par paires Log-Rank montre que la mouche de type sauvage survit à l&#39;infection nettement mieux que le mutant (χ 2 = 59,02, df = 1, p &lt;0,0001). Figure 3: la charge bactérienne. Après l&#39;injection mouches ont été injectés avec environ (A) 5000 P. rettgeri (B) 3400 E. coli. Charge bactérienne a été déterminé immédiatement après l&#39;injection et à différents points de temps ultérieurs. Chaque point de données représente la charge bactérienne d&#39;une seule mouche. E. coli est rapidement effacé à partir d&#39;hôtes contesté, alors que P. rettgeri persiste pour le reste de la vie de l&#39;hôte ,. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig4.jpg" /> Figure 4: L&#39;induction de l&#39;expression du gène immunitaire après injection. (A) Les mouches ont été injectés avec 50 nl de P. PBS rettgeri ou stériles soit dans l&#39;abdomen ou le thorax, ou ont été laissés de côté non manipulée de CO <sub&gt; 2 anesthésie. Six heures après l&#39;infection, les mouches ont été recueillis pour l&#39;isolement de l&#39;ARN et l&#39;expression du gène Diptericin A a été déterminée par qRT-PCR. (A) Les niveaux d&#39;expression sont représentées graphiquement comme le rapport de Diptericin Une transcription pour la transcription de rp49 et échelonnés de façon que le contrôle du CO 2 est défini comme ayant un niveau de 1. d&#39;expression Les barres représentent la moyenne et l&#39;erreur standard des rapports de chaque condition (n = 4). Niveaux (B) d&#39;expression sont représentées graphiquement comme un 2 ΔΔCT à la valeur moyenne C T de CO 2 Aesthesia vol de contrôle utilisés comme condition non induit standard. Les barres représentent la moyenne et l&#39;erreur type de ΔΔC T de chaque état ​​(n = 4). Bien qu&#39;il n&#39;y ait pas de différence dans la transcription en raison de l&#39;induction site d&#39;injection, la comparaison des panneaux A et B montre comment la méthode ΔΔC T peut potentiellement surestimer les niveaux d&#39;induction. (C) Mouches exprimant la GFP sous le contrôle du Diptericin Un promoteur ont été injectés avec 50 nl de P. rettgeri (OD = 0,1) et ensuite imagé 7 jours plus tard. Le panneau de la GFP montre l&#39;expression de GFP dans le corps de la graisse abdominale de vol infectés, ce qui indique une activation de la Diptericin Un promoteur en vol bactéries infectées mais pas les contrôles injectés médias. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Gène </td><td> Vers L&#39;Avant </td><td> Inverse </td></tr><tr><td> rp49 (également appelé rpl32) </td><td> 5 &#39;AGGCCCAAGATCGTGAAGAA 3&#39; </td><td> 5 &#39;GACGCACTCTGTTGTCGATACC 3&#39; </td></tr><tr><td> Un Diptericin </td><td> 5 &#39;GCGGCGATGGTTTTGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;CGCTGGTCCACACCTTCTG 3&#39; </td></tr><tr><td> Drosomicine </td><td> 5 &#39;CTGCCTGTCCGGAAGATACAA 3 &#39; </td><td> 5 &#39;TCCCTCCTCCTTGCACACA 3&#39; </td></tr><tr><td> Defensin </td><td> 5 &#39;GAGGATCATGTCCTGGTGCAT 3&#39; </td><td> 5 &#39;TCGCTTCTGGCGGCTATG 3&#39; </td></tr><tr><td> Un attacine </td><td> 5 &#39;CGTTTGGATCTGACCAAGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;AAAGTTCCGCCAGGTGTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Metchnikowan </td><td> 5 &#39;AACTTAATCTTGGAGCGATTTTTCTG 3&#39; </td><td> 5 &#39;ACGGCCTCGTATCGAAAATG 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Amorces pour qRT-PCR.

Drosophila melanogaster est un organisme modèle exceptionnel pour l’étude du système immunitaire inné et des conséquences physiologiques des infections et des maladies. Ce protocole décrit comment administrer des infections bactériennes robustes et quantitativement reproductibles à D. melanogaster, et comment mesurer par la suite la gravité de l’infection et quantifier la réponse immunitaire de l’hôte.

Infection bactérienne systémique et défense immunitaire phénotypes<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

L’objectif global de cette procédure est d’administrer des infections bactériennes robustes et reproductibles à la drosophile, au melanogaster, puis de mesurer la gravité de l’infection et de quantifier la réponse immunitaire de l’hôte. Ceci est accompli en administrant d’abord l’infection bactérienne aux mouches à l’aide d’un nano-injecteur. La post-mortalité peut être suivie après l’infection au fil du temps, et la charge bactérienne systémique peut être déterminée à tout moment en homogénéisant les mouches infectées et en mesurant le nombre de bactéries présentes.La défense immunitaire de l’hôte peut également être quantifiée en mesurant le niveau d’expression des gènes peptidiques antibactériens, ce qui permet de quantifier et de caractériser l’infection bactérienne. Chez la drosophile, melanogaster peut être utilisé pour tester comment les facteurs génétiques et environnementaux modifient la compétence immunitaire de la mouche. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunité des insectes, telles que la façon dont les facteurs génétiques et environnementaux de l’hôte influencent la capacité immunitaire ou comment les bactéries distinctes varient dans leur infection. Cinétique, Bien que nous utilisions cette méthode pour mesurer la défense immunitaire de Drosophila melanogaster contre l’infection bactérienne, elle peut également être appliquée à d’autres insectes et peut utiliser d’autres types d’agents pathogènes comme les virus ou les champignons.Un problème courant que les gens rencontrent lorsqu’ils apprennent cette méthode pour la première fois est qu’elle peut causer trop de dommages aux mouches, ce qui peut entraîner une mortalité excessivement élevée, même chez les témoins. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle pour apprendre à infecter la mouche avec un minimum de dommages. Étant donné que notre espèce hôte, Oph melanogaster, est si petite, l’infection doit être faite au microscope, ce qui ajoute à la complexité initiale de la technique.Cependant, nous pensons qu’une petite démonstration de la technique la rendra accessible même aux scientifiques qui n’ont qu’une expérience limitée avec les mouches. Pour commencer l’expérience, sélectionnez une seule colonie dans une plaque maîtresse préalablement préparée et inoculez une fiole de milieu stérile. Cultivez les bactéries pendant la nuit à 37 degrés Celsius jusqu’à la phase stationnaire.Une fois que la culture a atteint la phase stationnaire, granulez doucement les cellules de 600 microlitres de la culture dans une centrifugeuse de table pendant trois minutes à 5 000 fois. G, puis jetez le Rena et le Resus. Suspendez les bactéries dans 1000 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate stérile ou PBS.Ensuite, diluez les cellules remises en suspension dans du PBS stérile pour obtenir l’absorbance souhaitée de 600 nanomètres et utilisez cette suspension pour infecter les mouches. Préparez une aiguille en verre en tirant sur un capillaire en verre de silicate et utilisez une pince pour casser la pointe de l’aiguille afin de créer une ouverture de 50 micromètres de diamètre. Placez ensuite le joint torique du plafond et l’entretoise blanche avec la grande fossette tournée vers l’extérieur sur le piston métallique de l’injecteur.Remplissez l’aiguille de verre d’huile minérale à l’aide d’une seringue avec une aiguille de calibre 30. Placez ensuite l’aiguille en verre remplie dans la pince et placez le plus grand joint torique autour de sa base, à un millimètre de l’extrémité émoussée de l’aiguille. Faites glisser l’aiguille sur le piston métallique et vissez doucement la pince jusqu’à ce qu’elle soit bien fixée.Dissipez l’huile minérale de l’injecteur, en laissant un petit volume d’huile dans l’aiguille pour agir comme une barrière entre l’injecteur et la suspension bactérienne. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans l’huile minérale, la suspension bactérienne ou entre les deux liquides. Réglez ensuite l’injecteur sur le volume souhaité pour l’injection.Insérez soigneusement la pointe de l’aiguille capillaire dans un tube de PBS stérile et appuyez sur le bouton de remplissage de l’injecteur pour remplir l’aiguille de l’injecteur afin de générer des contrôles de blessure. Injectez aux mouches anesthésiées du PBS stérile dans la partie antérieure de l’abdomen, sur la surface latérale ventrale, placez les mouches injectées dans des flacons frais avec un nouveau milieu et posez les flacons sur le côté pour éviter que les mouches ne se collent à la nourriture avant qu’elles ne se remettent de leur anesthésie. Ensuite, éjectez le milieu stérile restant de l’injecteur et remplissez la même aiguille avec la suspension bactérienne.Répétez la procédure et injectez les mouches avec la suspension bactérienne. Alternativement, l’infection peut être transmise par une piqûre d’épingle septique. Pour préparer la goupille infectieuse, faites fondre l’extrémité d’une pointe de micro-pipette de 200 microlitres et insérez une goupille de mnuchin insecte de 0,15 millimètre dans le plastique fondu.Laissez le plastique se solidifier de sorte que la goupille soit maintenue en place avec 0,5 centimètre de goupille s’étendant du plastique anesthésie les mouches avec du dioxyde de carbone et piquez les mouches dans la plaque pleurale sternale du thorax avec l’aiguille, en évitant les sites d’attache des ailes et des pattes. Retirez les mouches de la goupille à minutie à l’aide d’une pince molle. Assurez-vous de tremper la goupille dans la suspension bactérienne entre les piqûres de chaque mouche.Placez les mouches piquées dans un flacon frais avec un nouveau milieu anti-mouches en posant le flacon sur le côté jusqu’à ce que toutes les mouches se soient remises de l’anesthésie. Placez un sous-ensemble des mouches infectées dans des micro-tubes de centrifugation individuels sur de la glace. Ajoutez 250 microlitres de PBS dans chaque tube et utilisez un pilon pour homogénéiser les mouches.Ensuite, plaquez l’homogénat sur un aérateur LB à l’aide d’une plaqueuse en spirale. Alternativement plaquer l’homogénat par dilution en série. Transférez chaque homogénat de mouche sur la première rangée d’un 96.Plaquez et remplissez chaque puits des rangées restantes avec 90 microlitres de PBS à l’aide d’une pipette multicanaux. Prenez 10 microlitres de la première rangée contenant de l’homogénat de mouches et distribuez l’homogénat dans la deuxième rangée. Poche-le de haut en bas au moins 10 fois pour bien mélanger l’homogénat.Prenez ensuite 10 microlitres d’homogénat et transférez-le dans la rangée suivante. Répétez cette procédure en utilisant les rangées restantes en commençant par la rangée inférieure. À l’aide de la pipette multicanaux, prélever 10 microlitres de chaque puits et les déposer sur une plaque LB.Assurez-vous que les échantillons sont distribués sous forme de points discrets qui ne se touchent pas. Répétez cette étape jusqu’à ce que tous les puits aient été échantillonnés dans chaque rangée, en les distribuant par ordre décroissant de dilution sur la plaque LB. Quelle que soit la méthode de placage utilisée, veillez à ne pas trop envahir les plaques afin que les colonies restent petites et discrètes.Retirez la plaque de l’incubateur. Une fois que les bactéries expérimentales ont développé des colonies visibles, mais avant les colonies de drosophile, le microbiote intestinal devient visible environ 24 heures plus tard pour les plaques spiralées. Comptez les colonies qui se développent à l’aide d’un compteur de colonies automatisé qui peut estimer la charge bactérienne par millilitre d’homogénat en fonction du nombre et de la position des colonies sur la plaque.Pour les plaques ponctuelles, comptez manuellement les colonies de chaque mouche à partir de la dilution contenant 30 à 300 colonies et calculez le nombre de bactéries par millilitre d’homogénat d’origine. Des mouches ont été injectées avec 50 nanolitres de suspensions bactériennes couvrant une gamme de densités optiques et immédiatement homogénéisées et la dose d’infection varie avec la densité optique de la suspension bactérienne utilisée pour l’injection. Les charges bactériennes initiales sont fortement corrélées avec la DO initiale injectée.Ce protocole permet d’observer différents types d’infections. Les mouches ont été infectées par la providencia rei, qui peut provoquer une infection sublétale chronique qui persiste pendant 20 jours ou plus. Les mouches infectées par coli élimineront l’infection en six heures. Après l’infection.L’induction du système immunitaire peut être estimée par l’isolement de l’ARN et le Q rtpcr R ultérieur de la transcription du peptide antibactérien de manière analogue, mais de manière moins quantitative, les mouches exprimant la GFP sous le contrôle du peptide antimicrobien. Les promoteurs de gènes peuvent être utilisés pour visualiser l’induction du système immunitaire Une fois maîtrisé. Cette technique peut permettre d’infecter des centaines de mouches par heure.N’importe quel nombre de phénotypes pourrait être mesuré chez les mouches après qu’elles aient été infectées, y compris la capacité d’apprentissage de la fité, l’état métabolique ou pratiquement tout autre trait imaginable. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’administrer des infections bactériennes robustes et reproductibles à la drosophile, au melanogaster, et comment mesurer ensuite la gravité de l’infection et quantifier la réponse immunitaire de l’hôte. N’oubliez pas que certaines bactéries peuvent présenter des risques pour la santé humaine.Assurez-vous que les procédures de biosécurité appropriées sont suivies et que des mesures de confinement adéquates sont en place pour empêcher les mouches infectées de s’échapper. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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Dans cette vidéo, nous démontrons une technique de mesure de la charge bactérienne d’E. coli après l’injection d’E. coli dans le thorax de Drosophila melanogaster.

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L&#39;élevage du Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sous axéniques et gnotobiotique Conditions

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