Infection bactérienne systémique et défense immunitaire phénotypes Drosophila melanogaster

L’objectif global de cette procédure est d’administrer des infections bactériennes robustes et reproductibles à la drosophile, au melanogaster, puis de mesurer la gravité de l’infection et de quantifier la réponse immunitaire de l’hôte. Ceci est accompli en administrant d’abord l’infection bactérienne aux mouches à l’aide d’un nano-injecteur. La post-mortalité peut être suivie après l’infection au fil du temps, et la charge bactérienne systémique peut être déterminée à tout moment en homogénéisant les mouches infectées et en mesurant le nombre de bactéries présentes.

La défense immunitaire de l’hôte peut également être quantifiée en mesurant le niveau d’expression des gènes peptidiques antibactériens, ce qui permet de quantifier et de caractériser l’infection bactérienne. Chez la drosophile, melanogaster peut être utilisé pour tester comment les facteurs génétiques et environnementaux modifient la compétence immunitaire de la mouche. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunité des insectes, telles que la façon dont les facteurs génétiques et environnementaux de l’hôte influencent la capacité immunitaire ou comment les bactéries distinctes varient dans leur infection. Cinétique, Bien que nous utilisions cette méthode pour mesurer la défense immunitaire de Drosophila melanogaster contre l’infection bactérienne, elle peut également être appliquée à d’autres insectes et peut utiliser d’autres types d’agents pathogènes comme les virus ou les champignons.

Un problème courant que les gens rencontrent lorsqu’ils apprennent cette méthode pour la première fois est qu’elle peut causer trop de dommages aux mouches, ce qui peut entraîner une mortalité excessivement élevée, même chez les témoins. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle pour apprendre à infecter la mouche avec un minimum de dommages. Étant donné que notre espèce hôte, Oph melanogaster, est si petite, l’infection doit être faite au microscope, ce qui ajoute à la complexité initiale de la technique.

Cependant, nous pensons qu’une petite démonstration de la technique la rendra accessible même aux scientifiques qui n’ont qu’une expérience limitée avec les mouches. Pour commencer l’expérience, sélectionnez une seule colonie dans une plaque maîtresse préalablement préparée et inoculez une fiole de milieu stérile. Cultivez les bactéries pendant la nuit à 37 degrés Celsius jusqu’à la phase stationnaire.

Une fois que la culture a atteint la phase stationnaire, granulez doucement les cellules de 600 microlitres de la culture dans une centrifugeuse de table pendant trois minutes à 5 000 fois. G, puis jetez le Rena et le Resus. Suspendez les bactéries dans 1000 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate stérile ou PBS.

Ensuite, diluez les cellules remises en suspension dans du PBS stérile pour obtenir l’absorbance souhaitée de 600 nanomètres et utilisez cette suspension pour infecter les mouches. Préparez une aiguille en verre en tirant sur un capillaire en verre de silicate et utilisez une pince pour casser la pointe de l’aiguille afin de créer une ouverture de 50 micromètres de diamètre. Placez ensuite le joint torique du plafond et l’entretoise blanche avec la grande fossette tournée vers l’extérieur sur le piston métallique de l’injecteur.

Remplissez l’aiguille de verre d’huile minérale à l’aide d’une seringue avec une aiguille de calibre 30. Placez ensuite l’aiguille en verre remplie dans la pince et placez le plus grand joint torique autour de sa base, à un millimètre de l’extrémité émoussée de l’aiguille. Faites glisser l’aiguille sur le piston métallique et vissez doucement la pince jusqu’à ce qu’elle soit bien fixée.

Dissipez l’huile minérale de l’injecteur, en laissant un petit volume d’huile dans l’aiguille pour agir comme une barrière entre l’injecteur et la suspension bactérienne. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans l’huile minérale, la suspension bactérienne ou entre les deux liquides. Réglez ensuite l’injecteur sur le volume souhaité pour l’injection.

Insérez soigneusement la pointe de l’aiguille capillaire dans un tube de PBS stérile et appuyez sur le bouton de remplissage de l’injecteur pour remplir l’aiguille de l’injecteur afin de générer des contrôles de blessure. Injectez aux mouches anesthésiées du PBS stérile dans la partie antérieure de l’abdomen, sur la surface latérale ventrale, placez les mouches injectées dans des flacons frais avec un nouveau milieu et posez les flacons sur le côté pour éviter que les mouches ne se collent à la nourriture avant qu’elles ne se remettent de leur anesthésie. Ensuite, éjectez le milieu stérile restant de l’injecteur et remplissez la même aiguille avec la suspension bactérienne.

Répétez la procédure et injectez les mouches avec la suspension bactérienne. Alternativement, l’infection peut être transmise par une piqûre d’épingle septique. Pour préparer la goupille infectieuse, faites fondre l’extrémité d’une pointe de micro-pipette de 200 microlitres et insérez une goupille de mnuchin insecte de 0,15 millimètre dans le plastique fondu.

Laissez le plastique se solidifier de sorte que la goupille soit maintenue en place avec 0,5 centimètre de goupille s’étendant du plastique anesthésie les mouches avec du dioxyde de carbone et piquez les mouches dans la plaque pleurale sternale du thorax avec l’aiguille, en évitant les sites d’attache des ailes et des pattes. Retirez les mouches de la goupille à minutie à l’aide d’une pince molle. Assurez-vous de tremper la goupille dans la suspension bactérienne entre les piqûres de chaque mouche.

Placez les mouches piquées dans un flacon frais avec un nouveau milieu anti-mouches en posant le flacon sur le côté jusqu’à ce que toutes les mouches se soient remises de l’anesthésie. Placez un sous-ensemble des mouches infectées dans des micro-tubes de centrifugation individuels sur de la glace. Ajoutez 250 microlitres de PBS dans chaque tube et utilisez un pilon pour homogénéiser les mouches.

Ensuite, plaquez l’homogénat sur un aérateur LB à l’aide d’une plaqueuse en spirale. Alternativement plaquer l’homogénat par dilution en série. Transférez chaque homogénat de mouche sur la première rangée d’un 96.

Plaquez et remplissez chaque puits des rangées restantes avec 90 microlitres de PBS à l’aide d’une pipette multicanaux. Prenez 10 microlitres de la première rangée contenant de l’homogénat de mouches et distribuez l’homogénat dans la deuxième rangée. Poche-le de haut en bas au moins 10 fois pour bien mélanger l’homogénat.

Prenez ensuite 10 microlitres d’homogénat et transférez-le dans la rangée suivante. Répétez cette procédure en utilisant les rangées restantes en commençant par la rangée inférieure. À l’aide de la pipette multicanaux, prélever 10 microlitres de chaque puits et les déposer sur une plaque LB.

Assurez-vous que les échantillons sont distribués sous forme de points discrets qui ne se touchent pas. Répétez cette étape jusqu’à ce que tous les puits aient été échantillonnés dans chaque rangée, en les distribuant par ordre décroissant de dilution sur la plaque LB. Quelle que soit la méthode de placage utilisée, veillez à ne pas trop envahir les plaques afin que les colonies restent petites et discrètes.

Retirez la plaque de l’incubateur. Une fois que les bactéries expérimentales ont développé des colonies visibles, mais avant les colonies de drosophile, le microbiote intestinal devient visible environ 24 heures plus tard pour les plaques spiralées. Comptez les colonies qui se développent à l’aide d’un compteur de colonies automatisé qui peut estimer la charge bactérienne par millilitre d’homogénat en fonction du nombre et de la position des colonies sur la plaque.

Pour les plaques ponctuelles, comptez manuellement les colonies de chaque mouche à partir de la dilution contenant 30 à 300 colonies et calculez le nombre de bactéries par millilitre d’homogénat d’origine. Des mouches ont été injectées avec 50 nanolitres de suspensions bactériennes couvrant une gamme de densités optiques et immédiatement homogénéisées et la dose d’infection varie avec la densité optique de la suspension bactérienne utilisée pour l’injection. Les charges bactériennes initiales sont fortement corrélées avec la DO initiale injectée.

Ce protocole permet d’observer différents types d’infections. Les mouches ont été infectées par la providencia rei, qui peut provoquer une infection sublétale chronique qui persiste pendant 20 jours ou plus. Les mouches infectées par coli élimineront l’infection en six heures. Après l’infection.

L’induction du système immunitaire peut être estimée par l’isolement de l’ARN et le Q rtpcr R ultérieur de la transcription du peptide antibactérien de manière analogue, mais de manière moins quantitative, les mouches exprimant la GFP sous le contrôle du peptide antimicrobien. Les promoteurs de gènes peuvent être utilisés pour visualiser l’induction du système immunitaire Une fois maîtrisé. Cette technique peut permettre d’infecter des centaines de mouches par heure.

N’importe quel nombre de phénotypes pourrait être mesuré chez les mouches après qu’elles aient été infectées, y compris la capacité d’apprentissage de la fité, l’état métabolique ou pratiquement tout autre trait imaginable. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’administrer des infections bactériennes robustes et reproductibles à la drosophile, au melanogaster, et comment mesurer ensuite la gravité de l’infection et quantifier la réponse immunitaire de l’hôte. N’oubliez pas que certaines bactéries peuvent présenter des risques pour la santé humaine.

Assurez-vous que les procédures de biosécurité appropriées sont suivies et que des mesures de confinement adéquates sont en place pour empêcher les mouches infectées de s’échapper. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.