Taches de sang séché - préparer et traiter pour utilisation dans les immunoessais et Techniques moléculaires

L’objectif global de cette procédure est de fournir un protocole normalisé pour la préparation et le traitement des gouttes de sang séché qui seront ensuite utilisées dans les immunoessais et les techniques moléculaires. Pour ce faire, on prélève d’abord du sang capillaire et on le transfère dans une carte filtrante. La deuxième étape consiste à sécher les taches de sang pendant la nuit et à obtenir des poinçons de six millimètres à partir des cercles de la carte filtrante.

Ensuite, l’image de sang séché des poinçons est obtenue par immersion dans un tampon sur un agitateur pendant au moins quatre heures. Les IET hémolytiques sont ensuite libérés des débris par centrifugation. La dernière étape consiste à analyser les IET autorisés pour les marqueurs sérologiques et moléculaires des infections par les virus de l’hépatite B, de l’hépatite C et de l’immunodéficience humaine à l’aide d’immunoessais et de techniques moléculaires disponibles dans le commerce.

L’idée d’utiliser des parcelles collectées sur une carte filtrante en cellulaire est née il y a un siècle. Néanmoins, les personnes qui utilisent cette méthode pour la première fois auront souvent du mal, même aujourd’hui, car l’ensemble de la phase pré-analytique, qui comprend la préparation et le traitement des gouttes de sang séché pour leur analyse finale, n’a pas été normalisée pour presque toutes les applications de test de gouttes de sang séché. Compte tenu de ce contexte, nous suggérons un protocole complet et normalisé étape par étape pour la préparation et le traitement des gouttes de sang séché qui seront ensuite utilisées dans les tests immunitaires et les techniques moléculaires.

La démonstration visuelle de cette méthodologie semble être cruciale comme plusieurs étapes comme le prélèvement du sang capillaire. C’est exact. Le transfert sur les cartes filtrantes ou la préparation de poinçons appropriés à partir de la foule ne sont pas faciles à apprendre, et par conséquent, les personnes qui utilisent la technique pour la première fois bénéficieront sans aucun doute d’une représentation visuelle.

Le sang capillaire sera prélevé sur le doigt de Nico par un technicien de notre laboratoire qui lui démontrera la procédure de traitement. Les taches de sang obtenues seront effectuées par le technicien ko, qui travaille déjà depuis de nombreuses années dans notre laboratoire de diagnostic biologique moléculaire pour la ponction cutanée. Mettez d’abord une paire de gants en caoutchouc latex jetables.

Avant la ponction cutanée, le patient doit se réchauffer les mains. Le doigt est massé et considérablement pour enrichir le flux sanguin vers le site de ponction supérieur. Nettoyez ensuite la peau du côté Palmer de la pointe de la phalange distale du troisième ou du quatrième doigt de la main non écrivaine avec un désinfectant approprié, percez la peau à l’aide d’une lancette de sécurité à usage unique.

Les doigts doivent être maintenus dans une position telle que la gravité facilite la collecte de sang sur le bout du doigt. Essuyez la première goutte de sang avec un tampon de gaze car il peut contenir un excès de liquide tissulaire. Après avoir massé à nouveau le doigt pour augmenter le flux sanguin au site de ponction, transférez la goutte suivante dans l’un des cercles d’une carte filtrante sans toucher la surface directement avec le bout du doigt.

Laissez la prochaine grosse goutte de sang capillaire se former sur le bout du doigt et recueillez-la dans le cercle suivant. Continuez cette procédure jusqu’à ce que tous les cercles nécessaires soient remplis ou que le flux sanguin s’arrête pendant le prélèvement. Laissez le sang s’imprégner dans la texture du filtre par les forces capillaires uniquement.

Ne pressez pas ou ne trayez pas excessivement le doigt si le flux sanguin n’est pas suffisant pour remplir tous les cercles requis de la carte filtrante. Si le flux sanguin s’arrête, placez un pansement sur le bout du doigt, effectuez une deuxième ponction cutanée sur un autre doigt si plus de sang est nécessaire pour l’examen afin de sécher les taches de sang, placez les cartes filtrantes sur une serviette en papier propre dans une enceinte de sécurité pour risque biologique et laissez-les sécher, de préférence toute la nuit à température ambiante. En l’absence de toute source de chaleur externe, lorsque le processus de séchage est terminé, les taches de sang ont une couleur brunâtre foncé uniforme et aucune zone rouge n’est plus visible pour le stockage.

Placez la carte en papier filtre dans un seul sac à fermeture éclair imperméable aux gaz contenant un à deux sachets déshydratants pour protéger les échantillons de l’humidité. Transférez ce sac dans un congélateur à une température de moins 20 degrés Celsius ou moins dès que possible. Si les congélateurs ne sont pas disponibles sur le terrain, le stockage à moins quatre degrés Celsius ou même à température ambiante est possible jusqu’à 14 jours.

Perforez un point avec un appareil à usage unique de six millimètres à partir de chaque cercle imbibé de sang du transfert de carte filtrante de grade 9 0 3, toutes les taches de sang séché perforées d’un seul patient à un puits des 12. Remplissez le puits d’une solution saline tamponnée au phosphate contenant 0,05 % entre 20 et 0,08 % d’azoture de sodium. Répétez ces étapes pour obtenir une deuxième série de gouttes de sang séché Eit afin d’effectuer des analyses moléculaires.

Ensuite, placez la plaque de culture cellulaire sur un agitateur de laboratoire et laissez les taches de sang séché éluer doucement pendant au moins quatre heures ou de préférence toute la nuit. Le lendemain, les taches sont presque exemptes de sang et des surnageants hémolytiques se sont formés. Transférez ces IET dans des microtubes à centrifuger, puis soumettez-les à une centrifugation pendant deux minutes à 10 500 fois G pour libérer.

Les surnageants de tous les débris qui s’étaient formés lors des EIT centrifugés d’Ellucian sont maintenant prêts à être utilisés pour les analyses prévues. La première série d’EITs est transférée dans des gobelets pour des tests sérologiques. La deuxième série est transférée sur des microtubes pour l’analyse PCR.

Examinez les TCE pour détecter les marqueurs du virus de l’hépatite B, du virus de l’hépatite C et de l’infection par le VIH à l’aide de tests disponibles dans le commerce et suivez attentivement les instructions du fabricant respectif. Enfin, les résultats des tests sérologiques sur l’analyseur entièrement automatisé sont affichés sur l’écran du système. L’efficacité du protocole suggéré pour la préparation et le traitement des gouttes de sang séché a d’abord été évaluée en analysant 1 762 paires couplées de gouttes de sang séché sérique en ce qui concerne les déterminations de l’antigène de surface du virus de l’hépatite B.

Le protocole de dosage a été modifié parce qu’avec une valeur seuil de 0,05 unité internationale par millilitre, 56,2 % des TCE étaient réactifs par rapport aux résultats obtenus par Sarah. Cela correspond à un taux de faux positifs de 14,7 % dans les tests de détection de l’antigène de surface du virus de l’hépatite B. L’analyse des caractéristiques de fonctionnement du récepteur des données a indiqué qu’une augmentation du seuil à 0,15 unité internationale par millilitre entraînerait une séparation idéale entre les antigènes de surface du virus de l’hépatite B positifs et les antigènes de surface négatifs du virus de l’hépatite B lors de l’étude de paires de gouttes de sang séché sérique pour la présence d’antigène de surface du virus de l’hépatite B. Seules deux divergences ont été obtenues.

Les deux Sarah faussement négatives provenaient de patients sous traitement antiviral. La détermination qualitative de H-B-V-D-N-A par PCR en temps réel à partir d’EITs dans le sang total a donné une sensibilité de 93 %. Seulement quatre résultats faussement négatifs anti-VHC ont été déterminés à partir de TCE de gouttes de sang séché.

Les C respectifs ont très probablement été prélevés sur des patients dont les infections avaient été résolues depuis longtemps. La sensibilité analytique de 100 % pour les déterminations de H-C-V-R-N-A à partir de TET de gouttes de sang séché a indiqué l’excellente sensibilité de l’approche d’amplification médiée par transcription isotherme, qui a été utilisée pour l’amplification H-C-V-R-N-A. La détection d’anticorps anti-VIH dans les taches de sang séché EITs avec un système entièrement automatisé a également permis d’obtenir une sensibilité analytique de 100 %Cette vidéo montre qu’il est aujourd’hui possible de détecter de manière fiable les marqueurs sérologiques et moléculaires des infections par l’hépatite B, l’hépatite C et le VIH dans toutes les taches de sang étroites, même lorsqu’un volume d’élution comparativement élevé est utilisé et que les modifications des protocoles d’essai établis pour les investigations sériques ou plasmatiques sont pas considérablement changé.

Cependant, les résultats communiqués ont également confirmé les limites inhérentes à la technique des taches de sang séché. Dans certains cas. Le protocole décrit a également été testé sur le terrain sur 534 utilisateurs actifs de drogues dans les villes allemandes de Berlin et d’Essen au cours de la phase pilote de l’étude sur les médicaments et les maladies infectieuses chroniques.

Les résultats obtenus ont conduit à une modification mineure de l’algorithme de test pour la phase principale de l’étude de médicament dans six autres grandes villes allemandes.