Électrofilées nanofibres échafaudages avec des gradations dans l'organisation fibre

Cette technique de fabrication permet de produire des échafaudages en nanofibres avec un gradient dans l’organisation des fibres. L’organisation graduée offre une utilité accrue des échafaudages en nanofibres dans le domaine biomédical. L’électrofilage offre la possibilité de produire des échafaudages en fibres à l’échelle nanométrique avec de grandes surfaces.

La fabrication a lieu en combinant un polymère avec un solvant volatil, puis en déplaçant cette solution à un rythme constant à travers une seringue avec une haute tension appliquée, charge la solution et allonge le polymère lorsqu’il est libéré de la pointe de l’aiguille. Le résultat est une fibre polymère sèche à l’échelle nanométrique qui peut être collectée de plusieurs façons pour diverses applications. Dans ce protocole, nous avons filé un polymère polycaprolactone sur un collecteur d’espace pour former un substrat de fibre aligné de manière alliée.

Ensuite, nous avons utilisé un masque se déplaçant progressivement pour couvrir ce substrat pendant que des fibres PCL aléatoires étaient déposées. Bonjour, je m’appelle Carl Kalala. Du laboratoire du Dr.Xing.

Nous sommes au Département des sciences pharmaceutiques et au programme de médecine régénérative Holland du Centre médical de l’Université du Nebraska. Aujourd’hui, nous allons montrer le protocole de fabrication d’un échafaudage en nanofibres avec un gradient organisationnel. De plus, nous montrerons les applications biomédicales de ces échafaudages par le biais de la nanoencapsulation et de l’ensemencement de cellules souches.

Tout d’abord, assurez-vous de porter un équipement de sécurité approprié lorsque vous traitez des produits chimiques potentiellement dangereux. A, la première étape de cette procédure consiste à préparer une solution de polycaprolactone ou PCL à une concentration approximative de 100 milligrammes par millilitre. Dissoudre la polycaprolactone dans un mélange de chlorométhane et de diméthyle pour amide dans un rapport de quatre à un volume sur volume pour chaque solvant respectif avec une concentration globale de 10 % poids par volume pour le mélange de solution jusqu’à ce que la solution soit translucide et homogène avec une viscosité appropriée.

Ajoutez la solution PCL dans une seringue de cinq millilitres avec une aiguille émoussée de calibre 21. Placez-le en position d’électro-rotation verticale avec le collecteur directement sous le sol du pousse-seringue. Le collecteur s’assure que le collecteur est mis à la terre individuellement sans contact avec les autres équipements de laboratoire.

Pour un dépôt efficace des fibres, réglez la pompe à seringue sur un débit relativement élevé afin d’amorcer l’aiguille pour l’électro-filage. Faites fonctionner la pompe jusqu’à ce que les gouttelettes qui se forment à l’extrémité de l’aiguille soient immédiatement remplacées. Une fois retiré, pour l’électro-filage, réglez la pompe à 0,5 millilitre par heure.

Réglez l’opérateur de tension à 12 kilovolts. Attention car cette haute tension peut être très dangereuse pour éviter toute proximité. Avec la pointe de l’aiguille, nous utilisons une extension non conductrice pour gérer les blocages potentiels ou les fibres étrangères qui peuvent se produire sur la pointe de l’aiguille ou au niveau du collecteur.

Les fibres devraient commencer à apparaître dans l’espace sur le collecteur. Continuez l’électro-filage jusqu’à ce qu’un tapis de fibres relativement épais ait été fabriqué. Sur l’espace du collecteur, appliquez de la colle sur les bords d’une petite plaque de verre.

Les dimensions de la plaque doivent être légèrement plus petites que celles du collecteur d’espace avec les fibres alignées, afin que l’échafaudage soit efficacement retiré. Retirez toutes les fibres étrangères qui pourraient s’être accumulées à l’avant du collecteur. Placez ensuite le collecteur sur le verre de sorte que le tapis de fibres soit en contact complet avec la plaque.

Tamponnez, l’échafaudage légèrement pour vous assurer que les fibres entrent directement en contact avec la colle. Laissez l’échafaudage reposer jusqu’à ce que la colle soit sèche. Une fois la colle sèche, coupez soigneusement les bords collés de l’échafaudage, de sorte qu’une section du tapis aligné reste immobilisée sur la plaque de verre.

Le résultat devrait ressembler à ceci avec l’échafaudage en fibre immobilisé sur trois côtés pour le dépôt secondaire. Si l’encapsulation chimique est souhaitée, ajoutez Kumar et six. Ajouter une concentration de 1 % poids par poids à la solution PCL Mélanger jusqu’à ce que la solution soit homogène et présente une couleur vert fluorescent pour la préparation du dégradé.

Positionnez le deuxième pousse-seringue perpendiculairement à la première pompe et au collecteur. Fixez un masque en plastique au deuxième tire-seringue et positionnez-le à environ deux millimètres au-dessus du collecteur. Préparez l’aiguille à l’aide d’un débit élevé.

Lorsque les fibres commencent à se déposer au-dessus du collecteur, réglez la pompe à seringue horizontale pour tirer à neuf millilitres par heure ou à une vitesse de déplacement approximative d’un millimètre par minute. Au fur et à mesure que l’expérience progresse, d’autres fibres aléatoires devraient être visibles sur l’échafaudage aligné. Des colorants tels que Kumar et six améliorent considérablement cette représentation visuelle en dégradé.

Au fur et à mesure que le dépôt de fibres progresse, les fibres nana commenceront à se déposer en dehors de la plage souhaitée du collecteur. Retirez ces fibres à l’aide d’une tige non conductrice afin qu’elles n’interfèrent pas avec l’échafaudage de fibres et que les électros tournent jusqu’à ce que le masque se soit presque complètement détaché du collecteur. Assurez-vous de laisser une petite quantité de l’échafaudage en fibre aligné sous le masque.

L’échafaudage fini doit avoir des parties constitutives alignées et aléatoires distinctes visualisées ici avec le dépôt aléatoire vert et les fibres alignées blanches, Un changement progressif de l’alignement aléatoire à l’alignement uniaxial des fibres devrait être évident dans la zone intermédiaire de l’échafaudage. Effectuez une culture cellulaire standard avec des cellules souches dérivées d’une dépose. Ensuite, j’ai vu les cellules sur les échafaudages de fibres et incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures.

Après deux heures d’incubation, appliquez plus de culture cellulaire sur les échafaudages de fibres jusqu’à ce qu’ils soient suffisamment recouverts dans le milieu. Ensuite, incubez deux échantillons à 37 degrés Celsius pendant trois et sept jours respectivement. Il s’agit d’images de microscope électronique à balayage prises par incréments de deux millimètres.

Sur l’échafaudage. Il y a une nette progression des fibres alignées aux fibres aléatoires sur l’échafaudage. Les modèles de transfert rapide de quatre ans réaffirment cette progression, car le modèle à zéro millimètre indique un alignement, et le motif à six millimètres indique une orientation aléatoire à partir de la culture de cellules souches.

Deux séries d’images microscopiques fluorescentes ont été prises. Ils indiquent tous deux des orientations cellulaires différentes, qui sont médiées par la position des cellules assises. Sur l’échafaudage de l’alliance.

70 % des cellules apparaissent à moins de 20 degrés de l’axe de fabrication, contre seulement 20 % des cellules dans la partie aléatoire de l’échafaudage. La formation d’un gradient chimique par nano-encapsulation est examinée par des images microscopiques fluorescentes. Le graphique de l’intensité de la fluorescence montre une croissance linéaire indiquant un changement progressif de la concentration chimique à travers l’échafaudage.

Pour promouvoir la différenciation ostéoblastique pour l’ingénierie tissulaire, notre objectif final est de développer une construction tissulaire, qui combinera une classe unique d’échafaudages avec des gradations doubles dans l’organisation structurelle et le contenu minéral. Cette combinaison peut recréer entièrement le site d’insertion natif du tendon à l’os. L’incorporation d’un ensemencement de cellules souches dérivées du tenon D devrait permettre une meilleure réparation des blessures de la coiffe des rotateurs.

Aujourd’hui, nous avons présenté le protocole pour la production d’un échafaudage en nanofibres avec un gradient dans la structure organisationnelle et expliqué ses applications biomédicales potentielles. La partie la plus critique de ce protocole est le dépôt secondaire aléatoire sur l’échafaudage aligné pour créer le gradient organisationnel lors de la préparation du gradient, surveillez attentivement la pointe de l’aiguille et le collecteur pour éliminer les boules à l’extrémité de l’aiguille ou les fibres étrangères au niveau du collecteur pour assurer un échafaudage uniforme.