Dérivation des cardiomyocytes hautement purifiée de anthropiques cellules souches pluripotentes en utilisant de petits différenciation de Molecule-modulé et ultérieur glucose famine

L’objectif global de cette procédure est de générer une population purifiée de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Tout d’abord, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme sont cultivées dans une monocouche cellulaire jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à environ 85 %. Un composé à petite molécule qui active la voie de signalisation des cellules éoliennes est ensuite ajouté et les cellules sont incubées pendant deux jours pour induire la formation du mésoderme.

Ensuite, un composé à petite molécule qui inhibe la voie de signalisation des cellules éoliennes est ajouté aux cellules pour spécifier la différenciation du mésoderme cardiaque. Les cellules sont ensuite incubées pendant deux jours supplémentaires. Au septième jour, les cardiomyocytes différenciés battent la population cellulaire différenciée hétérogène et sont ensuite incubés dans un milieu de culture cellulaire à faible teneur en glucose pour purifier sélectivement les cardiomyocytes.

Enfin, les cellules sont inspectées visuellement au microscope optique et analysées par cytométrie en flux pour confirmer la production d’une population hautement purifiée de cardiomyocytes battants. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres protocoles de différenciation des cardiomyocytes qui utilisent de petites molécules est qu’elle utilise une étape supplémentaire de privation de glucose. Cela nous permet de purifier les cardiomyocytes, qui sont capables d’utiliser des sources d’énergie cellulaire autres que le glucose.

Les non-cardiomyocytes peuvent être éliminés sélectivement de cette population hétérogène de cellules différenciées. Les cardiomyocytes peuvent ensuite être utilisés à des fins en aval, telles que la modélisation in vitro de maladies ou la découverte de médicaments à haut débit. Préparez-vous pour cette expérience par Preco six plaques de puits avec une solution de matrice extracellulaire ou ECMS et décongélation, un flacon de cellules souches pluripotentes induites par l’homme congelées, ou HI PSC, comme décrit dans le texte d’accompagnement.

Après la centrifusion Resus, suspendre les cellules décongelées dans E eight avec un inhibiteur de roche. Transférez ensuite le contenu du flacon dans un puits d’une plaque à six puits précodée avec un ECMS. Placez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Après 24 heures, les cellules auront adhéré. Remplacez le milieu par un milieu E eight sans inhibiteur de roche. Continuez à cultiver les cellules et remplacez le milieu E eight tous les jours.

Lorsque les CSP HI atteignent 75 à 80 % de fluidité, il est temps de les adopter. Aspirez rapidement le milieu de culture. Les puits de lavage avec un millilitre de PBS stérile à température ambiante aspirent le PBS.

Ajoutez ensuite 500 microlitres d’EDTA de 0,5 millimolaire ou une autre solution de détachement cellulaire. Incuber pendant une à sept minutes à température ambiante à l’aide d’un microscope, le détachement cellulaire lorsque l’enroulement visible ou l’épaississement des colonies sur les bords est évident, aspirer la solution de détachement cellulaire. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu E eight complété par un inhibiteur de roche micromolaire 10 à l’aide d’une pipette P 1000 répétée de haut en bas pour détacher complètement les colonies H-I-P-S-C de la plaque, formant ainsi cinq à 10 amas de cellules.

Transférez ensuite la suspension dans un tube conique de 15 millilitres pour disperser davantage la grande cellule. Paquets, pipetez de haut en bas jusqu’à ce que des amas plus petits se soient formés, comme indiqué ici. Diluez ensuite les cellules de un à 12 en ajoutant 11 millilitres de milieu E huit avec inhibiteur de roche à la suspension de cellules d’un millilitre.

Ensuite, aspirez l’ECMS des plaques précodées. Plaques, et ajouter deux millilitres de cellules remises en suspension à chaque puits environ 100 000 cellules par puits d’un six puits est idéal pour distribuer les cellules uniformément autour du puits afin d’éviter l’agrégation de cellules au centre du puits. Placez la plaque dans l’incubateur pendant 24 heures.

Le lendemain, remplacez le milieu par du E eight qui ne contient pas d’inhibiteur de roche. Changez de milieu toutes les 24 heures jusqu’à ce que les cellules deviennent confluentes à 80 %. En règle générale, les cellules sont prêtes à passer à nouveau dans les trois à six jours suivant la dissociation avec EDTA ou une graine de solution de détachement Xcel, environ 100 000 CSP I humaines sur des plaques de culture à six puits enrobées d’ECMS pour la différenciation.

En suivant les mêmes étapes que celles utilisées pour les CSP HI, lorsque les cellules atteignent 85 % de fluidité, passez au R-P-M-I-B 27, milieu sans insuline, mais avec six micromolaires de l’inhibiteur bêta de GSK. CHIR 9 9 0 2 1. Incuber les cellules pendant 48 heures chaque jour, examiner les cellules au microscope.

Des quantités importantes de mort cellulaire peuvent être observées après 24 heures de traitement CHIR. Ceci est normal et couramment observé après deux jours de traitement. Le HIPS voit sa taille et son nombre augmenter et continue de se différencier vers un destin mésodermique.

Remplacez le milieu de culture contenant le CHIR par le milieu d’insuline R-P-M-I-B 27 et incubez jusqu’au troisième jour. Le troisième jour, changez le milieu en R-P-M-I-B 27 sans insuline. Avec cinq inhibiteurs de vent micromolaires, IWR un et incuber les cellules pendant 48 heures.

Le cinquième jour, examinez les cellules au microscope. Les cellules mésodermiques doivent être dirigées vers la lignée cardiaque et commencer à fusionner et à former des structures caractéristiques en forme de branchement. Changez le milieu pour R-P-M-I-B 27 sans insuline et incubez les cellules pendant 48 heures.

Le septième jour. Remplacez le milieu par du R-P-M-I-B 27 contenant de l’insuline tous les trois jours par la suite, remplacez par le même milieu entre le huitième et le 10e jour. Un battement spontané des cardiomyocytes sera observé après 10 jours de différenciation.

Plus de 50 % des zones cellulaires battent. Cependant, les feuilles cellulaires battantes peuvent être mélangées avec des non-cardiomyocytes au 10e jour, les structures de type branche seront très prononcées. Les cardiomyocytes différenciés en phase terminale ne proliféreront pas au-delà de ce point.

Au jour 10. Après la différenciation, changez le milieu dans chaque puits de la plaque à six puits en deux millilitres de milieu à faible teneur en glucose et maintenez les cellules dans ce milieu pendant trois jours jusqu’au 13e jour. Au jour 13, retournez les cellules dans le milieu R-P-M-I-B 27 avec de l’insuline ou éventuellement pour reflater les cellules, ce qui facilite la dissociation des non-cardiomyocytes pendant la privation de glucose.

Aspirez le milieu et lavez-le une fois avec du PBS. Ajoutez 500 microlitres d’enzyme de dissociation cellulaire et incubez les cellules pendant cinq minutes. Après cinq minutes de traitement enzymatique, utilisez un P 1000 pour disperser manuellement les cardiomyocytes dans une suspension de cellule unique En pipetant de haut en bas jusqu’à 30 fois après la dissociation des cellules, transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres.

Rempli de cinq millilitres de milieu R-P-M-I-B 27 avec de l’insuline pour diluer la centrifugeuse d’enzyme de dissociation cellulaire pendant quatre minutes à 200 G après l’aspiration de spin et jeter le surnageant. Ensuite, réensemencez les cellules dans deux millilitres de milieu R-P-M-I-B 27 et ensemencez-les sur une nouvelle plaque à six puits recouverte d’ECMS. Généralement, la survie cellulaire est augmentée avec la confluence pour une survie cellulaire optimale.

Réflater 2 millions de cellules par puits dans une boîte à six puits Pour les cellules, non replaquées. Le 14e jour, remplacez le milieu à deux millilitres de milieu à faible teneur en glucose pour une deuxième culture du cycle de privation de glucose. Les cellules dans cet état de faible glucose pendant trois jours de plus.

La plupart des non-cardiomyocytes mourront le 17e jour. Changez le milieu à deux millilitres de R-P-M-I-B 27 avec de l’insuline. Les cellules restantes seront hautement purifiées. Cardiomyocytes.

Ces cellules peuvent être utilisées pour l’analyse de l’expression génique, le criblage de médicaments, l’analyse métabolique et divers autres tests en aval pour examiner la pureté des cardiomyocytes après différenciation et purification par la méthode de privation de glucose. La microscopie par immunofluorescence d’une population non purifiée de cellules différenciées a révélé que, bien que de nombreuses cellules étaient positives pour le CTN T, en vert, de nombreuses cellules n’exprimaient pas le CTN T, ce qui suggère la présence de non-cardiomyocytes au jour 13. En revanche, après une privation de glucose de trois jours à partir du 10e jour, presque toutes les cellules étaient positives au CTNT au 13e jour, ce qui indique une purification réussie des cardiomyocytes après une privation de glucose.

Ces données ont été corroborées par l’analyse par cytométrie en flux. Comme indiqué en rouge, environ 50 % des cellules qui n’ont pas subi de privation de glucose étaient tn NT deux positives. Alors que 90 % des cellules privées de glucose étaient tn NT deux positives.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de différencier les cellules souches pluripotentes induites humaines en populations hautement purifiées de cardiomyocytes. Ces cellules purifiées peuvent être produites à haut débit pour une variété d’applications in vitro en aval. Lors de la culture de cellules souches pluripotentes, rappelez-vous qu’elles ne doivent pas être autorisées à atteindre une co-fluidité de cent pour cent avant de recevoir des messages.

Certaines lignées de cellules souches se différencient mieux lorsque la cofluence initiale des cellules souches pluripotentes est inférieure à 85 %. Enfin, certaines lignées de cellules souches peuvent répondre plus rapidement ou plus sévèrement à l’étape de privation de glucose. Surveillez toujours ces paramètres avant de travailler avec de nouvelles lignées de cellules souches.