Name: Synchronisation de Caulobacter crescentus Des enquêtes sur le cycle cellulaire bactérienne (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Apprenez à synchroniser Caulobacter crescentus par centrifugation en gradient de densité pour étudier le cycle cellulaire bactérien. Cette méthode rapide isole les cellules swarmer en quantité suffisante pour les analyses biochimiques et la microscopie.

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Les auteurs remercient les membres du laboratoire Shapiro et Erin Schrader pour leurs commentaires sur le manuscrit. Les auteurs reconnaissent le soutien financier de la bourse postdoctorale F32 des NIH GM100732 à JMS et des subventions R01 GM51426 et R01 GM32506 des NIH à LS.

1. Synchrony à grande échelle - Optimal pour Western Blot, puces à ADN / ARN-Seq, et d&#39;autres essais intensifs Matériel <ol><li> De un congélateur actions ou une plaque, cultiver un 5 ml O / N de la culture de la souche NA1000 en secouant à 28 ° C dans un milieu PYE. </li><li> Inoculer 0,5 ml des cellules de l&#39;étape 1 dans 25 ml de M2G (tableaux 1-2) et agiter à 28 ° C jusqu&#39;à ce que la culture atteint une DO 600 entre 0,5 et 0,6. </li><li> Ensemencer les cellules dans 1 L de M2G et agiter à 28 ° C. </li><li> Une fois DO600 atteigne 0,5 à 0,6, de confirmer la présence de cellules en utilisant swarmer liquide monté microscopie de phase. Spot 1 pi de cellules sur une lame de verre, couvrir avec une lamelle, et l&#39;image par microscopie de phase. Confirmer la présence de cellules Grouillant en visualisant les cellules de natation rapidement dans la population. </li><li> Spin cellules pendant 15 min à 7 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-10. </li><li> Jeter le surnageant et ajouter 180 ml de M2 ​​froide (tableaux 1-2) et res doucementuspend toutes les cellules en utilisant une pipette sérologique. Jeter cellules faiblement granulés; ce sont des cellules predivisional et harcelées. </li><li> Ajouter 60 ml de solution de silice colloïdale froide (ne oubliez pas de mélanger la suspension de silice colloïdale avant d&#39;ajouter aux cellules) et bien mélanger la suspension cellulaire. </li><li> Verser la suspension de cellules dans 30 ml de huit tubes et centrifuger pendant 30 min à 6,4 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-20. NOTE: Il faut voir deux bandes distinctes; la bande de swarmer est la bande inférieure tandis que les cellules traquées / predivisional sont dans la fourchette supérieure (figure 1B). </li><li> Aspirer soigneusement la bande supérieure et enlever le liquide à ~ 1 cm au-dessus de la bande de swarmer (la bande inférieure). </li><li> (Critique) aide d&#39;une pipette Pasteur, retirez soigneusement la bande de swarmer et la placer dans un tube propre. Pour laver la silice colloïdale, en haut du tube hors M2 avec froid et essorage pendant 10 min à 6,4 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-20. </li><li> Eliminer délicatement le surnageant et remettre en suspension leles cellules dans 20 ml de M2 ​​froid et centrifugation pendant 10 min à 6,4 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-20. </li><li> La suspension de toutes les pastilles dans 30 ml de M2 froid et mesurer l&#39;OD 600 en utilisant un spectrophotomètre et vierge à l&#39;aide du milieu M2 froid. Enregistrer 1 pl pour l&#39;imagerie de phase pour vérifier swarmer cellules; 90-95% des cellules doit être swarmers. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 min à 6,4 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-20. Resuspendre les cellules dans 28 ° C M2G moyenne de sorte que le A 600 est ~ 0,3 à 0,4 et commencer agitation à 28 ° C. NOTE: Les rendements typiques sont entre 30 et 60 ml de swarmer culture cellulaire à partir de cellules non synchronisées 1L. </li><li> Commencez à prendre des points de temps (la culture de type sauvage prendra environ 135-140 minutes de diviser) 8,9. A chaque point de temps, de mesurer la DO 600. Vérifiez que la DO 600 après la division est d&#39;environ 2X la DO initiale 600. </li><li> Pour blot ou expression génique essais occidentaux, retirez aliquotes de 1 ml de la culture aux points de temps désirés, ralentit à la vitesse max dans une centrifugeuse de table pendant 30 sec, rapidement décanter ou aspirer le milieu, et le flash geler le culot cellulaire dans l&#39;azote liquide. Stocker les cellules à -80 ° C jusqu&#39;à l&#39;analyse en aval. </li></ol> 2. Synchrony à petite échelle - Optimal pour Microscopie <ol><li> De un congélateur actions ou une plaque, grandir à 5 ml O / N secouant la culture à 28 ° C dans M2G. </li><li> Diluer dans 15 ml de M2G (tableaux 1-2) et de croître jusqu&#39;à la mi-log (DO600 = 0,5-0,6). </li><li> Spin à 6,4 KXG pendant 10 min à 4 ° C dans un rotor JA-20, et de remettre en suspension dans 1 ml froides M2 (tableaux 1-2) et transférer dans un tube à centrifuger de 2 ml. </li><li> Centrifuger à 15 KXG pendant 3 min dans un tube de microcentrifugeuse pour sédimenter les cellules, aspirer le surnageant, le culot a mis sur de la glace, et remettre en suspension dans 900 ul de M2 ​​froid. </li><li> Ajouter 900 pi de PVP froid revêtu silice colloïdale et de spin pendant 20 min à 15 KXG à 4 ° C dans un microTube rocentrifuge. </li><li> (Critique) Aspirer ou une pipette du haut traqué / predivisional bande de cellules et de recueillir le fond swarmer bande dans un nouveau tube. </li><li> Laver les cellules deux fois swarmer dans 1 ml de M2 ​​froid tout en centrifugeant à 15 KXG pendant 3 min. </li><li> Avant l&#39;essorage final, déplacer les cellules dans un 1 ml tube à essai en verre pré-réfrigérés et mesurer la DO 600 de cellules par rapport à une ébauche de M2. </li><li> Reprendre le culot cellulaire final dans 28 ° C M2G à une DO entre 0,3 à 0,4 et secouez cellules / roll à 28 ° C. REMARQUE: Les rendements typiques sont comprises entre 2 et 4 ml de culture de cellules swarmer. </li><li> Pour les expériences de microscopie, au souhaitée points temporels lieu 1 pi de cellules sur un tampon agarose M2G pour l&#39;imagerie. </li></ol>

<ol><li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+design+of+bacterial+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">System-level design of bacterial cell cycle control.</a> FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).</li>
<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+and+conservation+pattern+of+whole-cell+control+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry.</a> J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).</li>
<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterial+cell-cycle+regulatory+network+operating+in+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space.</a> Science. 301, 1874-1877 (2003).</li>
<li>Ptacin, J. L., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiating+bacterial+mitosis%3A+understanding+the+mechanism+of+ParA-mediated+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation.</a> Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).</li>
<li>Evinger, M., Agabian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Envelope-associated+nucleoid+from+Caulobacter+crescentus+stalked+and+swarmer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells.</a> J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).</li>
<li>Tsai, J. W., Alley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+of+the+Caulobacter+McpA+chemoreceptor+is+cell+cycle+regulated+by+a+ClpX-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway.</a> J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).</li>
<li>Marks, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+laboratory+adaptation+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus.</a> J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).</li>
<li>Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetics of Caulobacter crescentus.</a> Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).</li>
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<li>Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+control+of+bacterial+DNA+replication+by+a+cell+cycle+regulatory+protein+that+binds+at+the+chromosome+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).</li>
<li>Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+directly+controlled+by+CtrA%2C+a+master+regulator+of+the+Caulobacter+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).</li>
<li>Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+by+an+essential+bacterial+two-component+signal+transduction+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein.</a> Cell. 84, 83-93 (1996).</li>
<li>Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization+of+Escherichia+coli+using+the+stringent+response%2C+with+fluorescence+labeling+assays+for+DNA+content+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication.</a> Methods. 48, 8-13 (2009).</li>
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<li>Abel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-modal+distribution+of+the+second+messenger+c-di-GMP+controls+cell+fate+and+asymmetry+during+the+caulobacter+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle.</a> PLoS Genet. 9, e1003744(2013).</li>
<li>Johnson, R. C., Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+spontaneously+derived+mutants+of+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus.</a> Genetics. 86, 25-32 (1977).</li>
<li>Britos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+response+to+carbon+starvation+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus.</a> PLoS One. 6, e18179(2011).</li>
<li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+logic+of+stringent+response+regulation+in+Caulobacter+crescentus%3A+starvation+signalling+in+an+oligotrophic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment.</a> Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le cycle cellulaire bactérien est un processus fondamental de la vie et est important pour l’étude de la croissance et comme cible pour les antibiotiques de prochaine génération. Ici, nous avons détaillé les procédures de synchronisation rapide de C. crescentus NA1000, un organisme modèle pour l’étude du cycle cellulaire bactérien et de la division cellulaire asymétrique. Cette méthode peut être modifiée par transfert Western, par profilage d’expression génique et par microscopie à fluorescence pour étudier la ...

Le cycle cellulaire bactérienne contrôle à la fois la replication du génome et la division des cellules filles. Surtout, comme la résistance aux antibiotiques est une menace croissante pour la santé publique, le cycle cellulaire bactérienne présente une cible inexploitée pour le développement antibiotique. Dans la bactérie Caulobacter crescentus, chaque cycle cellulaire conduit à une division asymétrique, pour donner deux cellules filles des différentes sorts (figure 1A) 1,2. Une cellule fille hérite un flagelle et mobiles tandis que l&#39;autre fille hérite d&#39;une tige et est sessiles. Circuit intégré génétique contrôle la progression du cycle cellulaire et sort de la cellule par régulation de la transcription, phospho-signalisation, et la protéolyse régulée 3. En outre, la réplication chromosomique des cellules filles et de rendement de la séparation simultanées qui contiennent exactement une copie du chromosome 4. Fait important, ces deux types de cellules peuvent être séparés rapidement par colloL&#39;Idéal particule de silice densité centrifugation dans la souche synchronisable NA1000 7.5 permettant l&#39;isolement des cellules swarmer du reste de la population avec des rendements élevés (figure 1B). Isolé swarmer cellules alors procéder de manière synchrone par division cellulaire asymétrique. Ici, nous détaillons le protocole utilisé pour synchroniser Caulobacter souche NA1000. Nous fournissons des protocoles et des conseils de dépannage communes pour deux petite et à grande échelle des synchronisations. Cette procédure expérimentale fournit un outil puissant pour interroger le contrôle spatio-temporelle du cycle cellulaire et Caulobacter destin cellulaire.

<table><tbody><tr><td>Silice colloïdale revêtue de PVP (Percoll)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4937</td><td></td></tr><tr><td>Silice colloïdale (Ludox AS-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>420840</td><td></td></tr><tr><td>JA10 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>JA20 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate ferreux Chelate Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0518</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Tubes à centrifuger</td><td>Corning</td><td>8445</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>0621-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

synchronisation de<em&gt; caulobacter crescentus</em&gt; des enquêtes sur le cycle cellulaire bactérienne

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Le cycle cellulaire est important pour la croissance, la réplication du génome et le développement dans toutes les cellules. Chez les bactéries, les études du cycle cellulaire se sont largement concentrées sur les cellules non synchronisées, ce qui rend difficile l’ordonnancement des événements temporels nécessaires à la progression du cycle cellulaire, à la réplication et à la division du génome. Caulobacter crescentus fournit un excellent système modèle pour le cycle cellulaire bactérien où les cellules peuvent être rapidement synchronisées dans un état G0 par centrifugation par densité. Des expériences de synchronisation du cycle cellulaire ont été utilisées pour établir les événements moléculaires régissant la réplication et la ségrégation des chromosomes, pour cartographier un réseau de régulation génétique contrôlant la progression du cycle cellulaire et pour identifier l’établissement de complexes de signalisation polaire nécessaires à la division cellulaire asymétrique. Nous fournissons ici un protocole détaillé pour la synchronisation rapide des cellules Caulobacter NA1000. La synchronisation peut être effectuée dans un format à grande échelle pour le profilage de l’expression génique et les tests par transfert Western, ainsi que dans un format à petite échelle pour les tests de microscopie ou FACS. La synchronisabilité rapide et les rendements cellulaires élevés de Caulobacter font de cet organisme un système modèle puissant pour l’étude du cycle cellulaire bactérien.

Synchronisation donne typiquement deux bandes de cellules (figure 1b): la bande de swarmer, qui a une densité plus élevée, et un / predivisional bande cellulaire pétiole de densité inférieure. Pour assurer des contrôles communs de synchronisation efficace comprennent la surveillance de l&#39;OD 600 et de mesurer les niveaux de protéines CTRA par western blot à des moments du cycle cellulaire distincts. La DO 600 devrait augmenter d&#39;environ deux fois au cours du cycle cellulaire...

La synchronisation des cellules bactériennes est essentielle pour l’étude du cycle et du développement des cellules bactériennes. Caulobacter crescentus est synchronisable par centrifugation de densité, ce qui en fait un outil rapide et puissant pour l’étude du cycle cellulaire bactérien. Nous fournissons ici un protocole détaillé pour la synchronisation des cellules Caulobacter.

Synchronisation de<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Des enquêtes sur le cycle cellulaire bactérienne

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules nageuses de Coob backer afin d'établir une culture cellulaire synchronisée. Cela est réalisé en cultivant d'abord une culture mixte de cellules Coob backer, puis en arrêtant brièvement la croissance en resuspendant les cellules dans un milieu froid. La deuxième étape consiste à séparer les cellules nageuses par centrifugation en gradient de densité différentielle.L'étape suivante consiste à resuspendre les cellules en essaim dans un milieu chaud, ce qui permet aux cellules d'entrer dans le cycle cellulaire. Enfin, les cellules en essaim isolées peuvent être suivies tout au long du cycle cellulaire à l'aide de tests biochimiques ou de microscopie. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes, telles que la machine à cellules filles, est que les cellules peuvent être isolées rapidement et en quantités suffisantes pour des études biochimiques.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, telles que quels facteurs contrôlent la ségrégation des chromosomes et le cycle de division cellulaire asymétrique. Pour commencer, inoculer cinq millilitres de milieu PYE avec des bactéries provenant d'une plaque de la souche colo backer CSIS, NA 1000. Faire croître la culture pendant la nuit à 28 degrés Celsius avec agitation ; le jour suivant, transférer 0,5 millilitre de la culture de nuit dans un flacon contenant 25 millilitres de milieu M deux G, et agiter le flacon à 28 degrés Celsius jusqu'à ce que la culture atteigne une densité optique comprise entre 0,5 et 0,6.Ensuite, diluez la culture dans un litre de milieu M deux G pour obtenir la densité optique initiale souhaitée et agitez le flacon à 28 degrés Celsius. Lorsque la densité optique de la culture atteint 0,5, pipetez un microlitre de la culture sur une lame, puis recouvrez le liquide avec une lamelle. Observez les cellules en microscopie de phase afin de confirmer la présence de cellules nageant rapidement en essaim. Transférez la culture dans un tube stérile pour centrifugeuse, puis centrifugez les cellules à 7 000 ×g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, jetez les cellules faiblement pelletées en versant le surnageant et ajoutez 180 millilitres de milieu M deux froid. Utilisez une pipette sérologique pour redisperser délicatement les cellules. Puis ajoutez 60 millilitres de solution colloïdale de silice froide à la suspension cellulaire et mélangez soigneusement.Verser la suspension cellulaire dans huit tubes de 30 millilitres et centrifuger à 6 400 ×g pendant 30 minutes. Régler à quatre degrés Celsius. Retirer délicatement les tubes de la centrifugeuse et examiner le tube à la recherche de deux bandes distinctes.La bande inférieure contient les cellules nageuses, tandis que les cellules prédivisionnaires se trouvent dans la bande supérieure. Ensuite, aspirez soigneusement la bande supérieure ainsi que le liquide jusqu'à environ un centimètre au-dessus de la bande inférieure. Utilisez une pipette Pasteur pour prélever la bande de cellules nageuses et transférez-la dans un tube propre.Remplissez le tube avec du milieu M deux froid, puis centrifugez le tube pour éliminer la silice colloïdale. Ensuite, jetez soigneusement le surnageant et resuspendez les cellules dans 20 millilitres de milieu M deux froid. Centrifugez à nouveau pour former un culot. Resuspendez les culots dans 30 millilitres de milieu M deux froid, puis mesurez la densité optique de la suspension.Placer un microlitre de la suspension cellulaire sur une lame de microscope et utiliser l'imagerie en contraste de phase pour rechercher les cellules en forme de nuée. Ensuite, centrifuger les cellules et les resuspendre dans du milieu M two G jusqu'à une densité optique comprise entre 0,3 et 0,4. Incuber la culture sous agitation à 28 degrés Celsius pour des analyses de type western blot ou d'expression génique.Prélèvez des aliquotes d'un millilitre toutes les 10 à 30 minutes pendant environ 140 minutes, jusqu'à ce que la densité optique de la culture ait doublé. Utilisez une centrifugeuse de table pour faire précipiter les cellules pendant 30 secondes, puis aspirez rapidement le surnageant. Congelez les culots cellulaires dans l'azote liquide et conservez-les à moins 80 degrés Celsius pour une synchronisation à petite échelle. Inoculez cinq millilitres de milieu M2G avec 1000 cellules NA et faites croître les cellules toute la nuit sous agitation à 28 degrés Celsius. Le jour suivant,Diluez la culture dans 15 millilitres de milieu M2G et faites croître les cellules jusqu'à ce que la densité optique soit comprise entre 0,5 et 0,6. Centrifugez les cellules, puis resuspendez-les dans un millilitre de milieu M2 froid. Transférez les cellules dans un tube microcentrifuge de deux millilitres, formez un culot par centrifugation et aspirez le surnageant.Ensuite, placez le tube sur de la glace et resuspendez le culot cellulaire dans 900 microlitres de milieu M deux froid. Ajoutez ensuite 900 microlitres de silice colloïdale recouverte de PVP froide, puis centrifugez le tube pendant 20 minutes. Aspirez soigneusement la bande supérieure de cellules prédivisionnaires, puis récupérez la bande inférieure de cellules nageuses dans un nouveau tube de microcentrifugation.Lavez les cellules nageuses deux fois dans un millilitre de milieu M2 froid en centrifugeant trois minutes entre chaque lavage, juste avant la dernière centrifugation. Placez la suspension cellulaire dans un tube à essai en verre de un millilitre prérefroidi et mesurez la densité optique des cellules. Transférez ensuite les cellules dans un tube microfuge et centrifugez après la centrifugation.Reese, suspendez le culot cellulaire final dans du milieu M deux G préchauffé à une densité optique comprise entre 0,3 et 0,4, et agitez les cellules à 28 degrés Celsius. Si une observation microscopique est souhaitée, déposez un microlitre de la culture sur un tampon M deux G à des temps appropriés. Une centrifugation en gradient de densité d'une culture asynchrone donne deux bandes de cellules.La bande inférieure contient des cellules nageuses, qui ont une densité plus élevée, et la bande supérieure contient des cellules stockées et prédivisionnelles, qui ont une densité plus faible. La densité optique de la culture augmente d'environ deux fois au cours du cycle cellulaire. Pendant cette période, les cellules nageuses se différencient en cellules stockées, puis les cellules stockées se répliquent et subissent une division cellulaire asymétrique.Chaque division produisant une nouvelle cellule nageuse et la cellule mère reconstituée, un immunotransfert (western blot) du régulateur maître du cycle cellulaire CTRA constitue un contrôle utile pour vérifier la synchronisation. CTRA bloque la réplication de l'ADN dans les cellules nageuses et est dégradé lors de la réplication de l'ADN. CTRA est ensuite synthétisé ultérieurement au cours du cycle cellulaire, empêchant la réinitiation de la réplication de l'ADN et activant la transcription de nombreux gènes du développement. Ce profil oscillatoire des niveaux de la protéine CTRA indique une synchronisation réussie.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment synchroniser des cellules de *Caulobacter crescentus* NA1000 afin d'étudier le cycle cellulaire bactérien. Cette procédure de synchronisation cellulaire peut être réalisée en une à deux heures si elle est effectuée correctement. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se souvenir de travailler rapidement.

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Source : Murata, K. et. al., Visualisation de la compaction de l’ADN chez les cyanobactéries par cryotomographie électronique à haute tension. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo démontre la culture synchrone de cyanobactéries dans des cycles lumière-obscurité pour étudier la compaction de l’ADN régulée par le rythme circadien. La microscopie à fluorescence révèle de l’ADN condensé à des moments définis, confirmant l’alignement du cycle cellulaire dans la population.

Synchronisation des cultures cyanobactériennes et compactage de l’ADN pilotés par des cycles lumière-obscurité

Comprendre la fonction des processus essentiels chez les bactéries est difficile. Microscopie à fluorescence avec des colorants spécifiques à la cible peut éclairer clé dans la progression de la croissance et cycle cellulaire des cellules microbiennes. Ici, Agrobacterium tumefaciens est utilisé comme une bactérie modèle pour mettre en évidence les méthodes d’imagerie de cellules vivantes pour la caractérisation des processus essentiels.

Vivre la microscopie de Fluorescence cellulaire afin d’observer les processus essentiels au cours de la croissance des cellules microbiennes

Les cellules bactériennes sont spatialement organisées. Pour suivre cet organisme au fil du temps dans des cellules de Myxococcus xanthus croissantes lentes, un set-up pour l’imagerie de cellules vivantes de fluorescence à haute résolution spatio-temporelle sur plusieurs générations a été développé. En utilisant cette méthode, la dynamique spatio-temporelle des protéines importantes pour la ségrégation des chromosomes et division cellulaire peut être déterminée.

Imagerie de cellules vivantes de fluorescence de Cell Cycle végétatif complet de la lente croissance sociale bactérie Myxococcus xanthus

Décrite ici est une méthode permettant d’analyser l’expression des gènes bactériens dans les tissus animaux au niveau cellulaire. Cette méthode fournit une ressource pour étudier la diversité phénotypique survenant dans une population bactérienne en réponse à l’environnement tissulaire lors d’une infection.

Une méthode axée sur la Fluorescence pour étudier la régulation des gènes bactériens dans les tissus infectés

Cet article fournit un guide étape par étape pour étudier la dynamique de localisation sous-cellulaire des protéines et pour surveiller les changements morphologiques à l'aide de la microscopie à haute résolution de fluorescence dans Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus.

Microscopie de fluorescence à cellules vivantes pour étudier la localisation des protéines subcellulaires et les changements de morphologie cellulaire chez les bactéries

Ce travail présente une méthode de microscopie qui permet l’imagerie en direct d’une seule cellule d’Escherichia coli pour l’analyse et la quantification du comportement stochastique des circuits génétiques synthétiques.

Mesure continue du bruit biologique chez Escherichia Coli à l’aide d’une microscopie en accéléré

De nombreuses bactéries utilisent la motilité entraînée par les flagelles pour naviguer dans leur environnement et coloniser un environnement favorable à la fois individuellement et collectivement. Démontré ici est l’utilisation de trois méthodes établies qui exploitent la motilité comme un outil de sélection pour identifier les composants / voies contribuant à la natation et la motilité de l’essaimage.

Étudier la motilité induite par flagelle chez Escherichia coli en appliquant trois techniques établies dans une série

La persistance des antibiotiques décrit la capacité de petites sous-populations au sein d’une population isogénique sensible à tolérer transitoirement de fortes doses d’antibiotiques bactéricides. Le présent protocole combine des approches pour caractériser le phénotype de persistance des antibiotiques aux niveaux moléculaire et cellulaire après exposition d’Escherichia coli à des doses létales d’ofloxacine.

Analyse de population et de cellules uniques de la persistance des antibiotiques chez Escherichia coli

L’un des défis de l’analyse des expériences de séries chronologiques synchronisées est que les expériences diffèrent souvent par la durée de récupération de la synchronie et la période du cycle cellulaire. Ainsi, les mesures de différentes expériences ne peuvent pas être analysées globalement ou facilement comparées. Ici, nous décrivons une méthode d’alignement des expériences pour permettre des comparaisons spécifiques à la phase.

Alignement de données de séries chronologiques synchronisées à l’aide du modèle de synchronisation de perte de cycle cellulaire caractérisant pour les comparaisons entre expériences

Apprenez à synchroniser Caulobacter crescentus par centrifugation en gradient de densité pour étudier le cycle cellulaire bactérien. Cette méthode rapide isole les cellules swarmer en quantité suffisante pour les analyses biochimiques et la microscopie.

Synchronisation de

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