Synchronisation de Caulobacter crescentus Des enquêtes sur le cycle cellulaire bactérienne

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules d’essaim de Coob Backer afin d’établir une culture cellulaire synchronisée. Ceci est accompli en cultivant d’abord une culture mixte de cellules de support coob, puis en arrêtant brièvement la croissance en suspendant les cellules dans un milieu froid. La deuxième étape consiste à séparer les cellules de l’essaim par centrifugation à densité différentielle.

L’étape suivante consiste à remettre en suspension les cellules de l’essaim dans un milieu chaud, ce qui permet aux cellules d’entrer dans le cycle cellulaire. Enfin, les cellules isolées de l’essaim peuvent être suivies tout au long du cycle cellulaire à l’aide d’analyses biochimiques ou de la microscopie. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes, telles que la machine à cellules bébés, est que les cellules peuvent être isolées rapidement et en grandes quantités suffisantes pour les études biochimiques.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, telles que ce qui contrôle la ségrégation des chromosomes et le cycle de division cellulaire asymétrique. Pour commencer, inoculez cinq millilitres de milieu PYE avec des bactéries d’une plaque de souche SCIS de soutien de la souche, NA 1000. Cultivez la culture pendant la nuit à 28 degrés Celsius en secouant le lendemain, transférez 0,5 millilitre de la culture de nuit dans un flacon contenant 25 millilitres de milieu M deux G, et agitez le ballon à 28 degrés Celsius jusqu’à ce que la culture atteigne une densité optique comprise entre 0,5 et 0,6.

Ensuite, diluez la culture dans un litre de milieu M deux G pour obtenir la densité optique de départ souhaitée et agitez le ballon à 28 degrés Celsius lorsque la densité optique de la culture atteint 0,5 pipetez un microlitre de la culture sur une lame, puis recouvrez le liquide avec une lamelle. Imagez les cellules par microscopie de phase pour confirmer la présence de cellules d’essaim nageant rapidement. Transférez la culture dans un tube à centrifuger stérile, puis faites tourner les cellules à 7 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, jetez les cellules légèrement granulées lorsque vous versez le surnageant et ajoutez 180 millilitres de milieu froid M deux. À l’aide d’une pipette sérologique, les cellules sont remises en suspension en douceur. Ajoutez ensuite 60 millilitres de solution froide de silice colloïdale à la suspension cellulaire et mélangez bien.

Versez la suspension cellulaire dans huit tubes de 30 millilitres et centrifugez-les à 6 400 fois G pendant 30 minutes. Réglez quatre degrés Celsius. Retirez délicatement les tubes de la centrifugeuse et vérifiez qu’il n’y a pas deux bandes distinctes.

La bande inférieure contient les cellules de l’essaim et les cellules pré-divisionnaires sont dans la bande supérieure. Ensuite, aspirez soigneusement la bande supérieure et le liquide jusqu’à environ un centimètre au-dessus de la bande inférieure. Utilisez une pipette à pasteur pour retirer la bande d’essaim et la transférer dans un tube propre.

Remplissez le tube avec du milieu froid M deux, puis centrifugez le tube pour éliminer la silice colloïdale. Ensuite, jetez soigneusement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 20 millilitres de centrifugeuse à milieu froid M. deux. Encore une fois, pour granuler les cellules, remettre les granulés en suspension dans 30 millilitres de milieu froid M, puis mesurer la densité optique de la suspension.

Placez un microlitre de suspension cellulaire sur une lame de microscope et utilisez l’imagerie de phase pour vérifier la présence de cellules d’essaim. Ensuite, centrifugez les cellules et remettez-les en suspension dans un milieu M deux G à une densité optique comprise entre 0,3 et 0,4. Incuber la culture en agitant à 28 degrés Celsius pour les tests de parcelle occidentale ou d’expression génique

Prélever des aliquotes d’un millilitre toutes les 10 à 30 minutes pendant environ 140 minutes jusqu’à ce que la densité optique de la culture double. Utilisez une centrifugeuse de table pour faire tourner les cellules pendant 30 secondes, puis aspirez rapidement le flash moyen. Congelez les pastilles de cellules dans de l’azote liquide et stockez-les à moins 80 degrés Celsius pour une synchronisation à petite échelle, inoculez cinq millilitres de milieu M deux G avec des cellules NA 1000 et cultivez les cellules pendant la nuit en secouant à 28 degrés Celsius le lendemain.

Diluer la culture dans 15 millilitres de milieu M deux G et faire croître les cellules jusqu’à ce que la densité optique soit comprise entre 0,5 et 0,6. Centrifuger les cellules puis les remettre en suspension dans un millilitre de milieu froid M. deux. Transférez les cellules dans un microtube à centrifuger de deux millilitres, granulez les cellules par centrifugation et aspirez le supplantant.

Placez ensuite le tube sur de la glace et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 900 microlitres de milieu froid M. Ensuite, ajoutez 900 microlitres de silice colloïdale enduite de PVP à froid et centrifugez le tube pendant 20 minutes. Aspirez soigneusement la bande cellulaire supérieure de pré-division, puis récupérez la bande d’essaim inférieure dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse.

Lavez les cellules de l’essaim deux fois dans un millilitre de milieu froid M deux tout en centrifugeant pendant trois minutes entre chaque lavage, juste avant l’essorage final. Placez la suspension cellulaire dans un tube à essai en verre d’un millilitre pré-refroidi et mesurez la densité optique des cellules. Transférez ensuite les cellules dans un tube de micro-fuge et centrifugez-les après centrifusion.

Reese, suspendez la pastille cellulaire finale dans un milieu préchauffé M deux G à une densité optique comprise entre 0,3 et 0,4 et secouez les cellules à 28 degrés Celsius. Si la microscopie est souhaitée, placez un microlitre de la culture sur un coussin aérodynamique M deux G aux points de temps appropriés. La centrifugation à densité différentielle d’une culture asynchrone produit deux bandes de cellules.

La bande inférieure contient des cellules d’essaim, qui ont une densité plus élevée, et la bande supérieure contient des cellules stockées et pré-divisionnaires, qui ont une densité plus faible. La densité optique de la culture augmente d’environ deux fois au cours du cycle cellulaire. Pendant ce temps, les cellules de l’essaim se différencient en cellules stockées, les cellules stockées se répliquent ensuite et subissent une division cellulaire asymétrique.

Chaque division produisant une nouvelle cellule d’essaim et la cellule mère stockée, un transfert Western pour le régulateur principal du cycle cellulaire CTRA est un contrôle utile pour vérifier la synchronisation, CTRA bloque la réplication de l’ADN dans les cellules d’essaim et est dégradée lors de la réplication de l’ADN. CTRA est ensuite synthétisé plus tard dans le cycle cellulaire, empêchant la réinitiation de la réplication de l’ADN et activant la transcription de nombreux gènes du développement. Ce modèle oscillant des niveaux de protéines CTRA indique une synchronisation réussie.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de synchroniser les cellules de rappel ou NA 1000 pour étudier le cycle cellulaire bactérien. Cette procédure de synchronisation des cellules peut être effectuée en une à deux heures si elle est effectuée correctement. Bien qu’il soit important d’effectuer cette procédure, il est important de ne pas oublier de travailler rapidement.