Protocoles pour l'obtention Zygotic et embryons somatiques pour l'étude de la réglementation de développement précoce de l'embryon dans la légumineuse modèle Medicago truncatula

L’objectif général des procédures suivantes est de démontrer combien d’embryons de tula cargo peuvent être obtenus à différents stades de développement pour étudier la régulation génétique de l’embryogenèse chez les plantes, cela peut être accompli en reliant la morphologie des gousses avec les différents stades de développement de l’embryon zygotique, et en cultivant l’explan des feuilles pour obtenir des embryons somatiques aux différents stades. En fin de compte, la PCR quantitative et la bêta-glucuronidase peuvent être utilisées pour évaluer l’expression des gènes au cours de l’embryogenèse aux stades de développement spécifiques d’intérêt. Les avantages de ces techniques sont que le marquage des fleurs individuelles n’est pas nécessaire pour les expériences in vivo, et sont des procédures in vitro optimisées, fournissent des approches expérimentales complémentaires.

La démonstration visuelle de la procédure de culture est importante car elle permet de suivre de plus près les détails des manipulations. Wang fera la démonstration de la procédure in vivo, tandis que Kim Nolan fera la démonstration de la procédure in vitro. Pour faciliter le développement de l’embryon zygotique, percez la surface des téguments des graines d’une plante trinoculaire Monte cargo et faites tremper les graines pendant la nuit, entièrement recouvertes d’eau.

Le lendemain, semez trois graines dans chacun des pots de 10 à 15 centimètres de diamètre dans un terreau et transférez les pots dans une serre. Cultivez les plantes sous une photopériode de 14 heures avec une température jour-nuit de 23 à 19 degrés Celsius, en conservant les semis les plus sains après la germination afin qu’il y ait une plante par pot et en entourant les semis d’un treillis pour que les tiges des plantes grimpent lorsque les gousses apparaissent. Prélever aux stades appropriés décrits dans le tableau un et la figure un pour obtenir le stade de développement précoce de l’embryon souhaité.

Ensuite, utilisez des pinces pour isoler les les femelles des gousses. Alternativement, pour une microscopie plus raffinée, entièrement claire dans la solution Hoyer, les stades embryonnaires peuvent être confirmés en imageant les embryons sous un microscope composé standard. Ensuite, prélevez le nombre d’AMT requis pour l’expérience dans la région centrale de la gousse et stockez-les à la température appropriée pour l’analyse en aval du développement embryonnaire somatique.

Folioles de récolte in vitro de la dernière feuille de tate presque entièrement développée d’une tige allongée d’un cultivar de tran atula capable de former facilement des embryons en culture. Conservez les feuilles de tate sur du papier absorbant humide dans un pot de culture pour éviter la déshydratation. Ensuite, en travaillant dans une enceinte de biosécurité stérilisée aux UV, j’ai placé les feuilles dans la boule de maille d’un infuseur à thé de printemps en autoclave.

Un infuseur immergé à 70 % d’éthanol dans un bouchon à vis autoclave de 250 millilitres. Pot de culture en polycarbonate après 30 secondes, égouttez le tissu foliaire, puis plongez l’infuseur dans une solution d’eau de Javel diluée pendant 10 minutes. Avec des mouvements doux occasionnels, faites tourner doucement la casserole et égouttez l’excès d’eau.

Rincez ensuite l’infuseur. Une fois de plus dans de l’eau fraîche déminéralisée dans un nouveau pot. Maintenant, utilisez une pince stérile pour transférer les feuilles de l’infuseur à thé dans une culture fraîche, un pot d’eau distillée déminéralisée stérile vissez le capuchon stérile.

Rincez ensuite les feuilles par inversion et en tourbillonnant. Laissez ensuite les feuillets flotter sur l’eau stérile pour plaquer les implants. Coupez les bords des feuillets stérilisés individuels à l’aide d’une technique stérile.

Ensuite, coupez le rectangle restant en deux ou trois, huit à 10 par trois à cinq millimètres avec la veine médiane au centre de chaque plaque d’explan X. Six x explants par gélose milieu de culture solidifié de neuf centimètres de diamètre. Boîtes de Pétri avec le sceau ABA vers le bas pour maintenir l’orientation habituelle des feuilles.

Ensuite, scellez les boîtes de Pétri avec du perfil et incubez les plaques dans l’obscurité à 28 degrés Celsius dans une pièce à température contrôlée. Après trois semaines, utilisez une spatule stérile en acier inoxydable et une pince pour sous-cultiver le trou différenciateur explants sur un milieu frais. Les premiers embryons devraient être observés dans environ quatre semaines car un callosité se produit et le cal dépasse la taille du plus grand explan montré ici.

Transférez seulement 50 % du cal individuel lors de la sous-culture dans un milieu frais. Enfin, à l’aide d’un stéréomicroscope, recueillir les différents stades embryonnaires sur une période d’incubation de quatre à huit semaines, en traitant les explants en fonction des objectifs expérimentaux. Après la récolte d’embryons zygotiques, comme cela vient d’être démontré en aval dans C, deux hybridations ou d’autres stratégies appropriées peuvent être employées d’un intérêt particulier, comme le démontrent ces images, la distinction du SSIS et de Spencer peut être observée en suivant les plans X plaqués.

En quelques semaines, quatre à huit embryons somatiques à des stades discrets peuvent être localisés et cueillis pour une analyse immédiate. Par exemple, ces données illustrent comment les embryons au stade précoce de l’oléine présentent l’expression d’un type de gène de l’éoine Tula de medicago, mais pas d’un autre. Un avantage particulier du système embryonnaire somatique est que la transformation du cal peut être effectuée sans régénérer une plante entière.

En effet, comme démontré ici. La bêta-glucuronidase peut être utilisée pour visualiser l’expression des gènes aux différents stades de l’embryogenèse. Après avoir regardé la vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de sélectionner et de débrancher le pod pour obtenir Andres.

Vous devez également avoir une bonne compréhension de la façon de préparer et de mettre en plaque un plan stérile pour l’embryogenèse somatique après leur développement. Ces techniques ont permis d’étudier la régulation de la transcription des premiers stades de l’embryogenèse en relation avec la croissance embryonnaire, le développement et le stockage des nutriments.