Name: Imagerie Montant du Drosophila Chambres doeufs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Apprenez l'imagerie verticale des chambres d'œufs de Drosophila melanogaster pour visualiser l'organisation cellulaire des pôles. Cette méthode combine coloration fluorescente et microscopie confocale pour révéler la morphologie de l'épithélium folliculaire.

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Nous apprécions l’aide des membres de la communauté des mouches, en particulier le Dr Denise Montell, le Dr Lynn Cooley et le Dr Pernille Rorth, pour les réactifs. Nous remercions Flybase, le Bloomington Drosophila Stock Center et la Developmental Studies Hybridoma Bank pour les informations et la fourniture de stocks de mouches et d’anticorps, respectivement. LM est soutenu par la bourse de formation du ministère de l’Éducation, la bourse de formation GAANN (Graduate Assistance in the Areas of National Need) (P200A120017) et par une subvention de l’initiative NIGMS pour maximiser le développement des étudiants (2 R25-GM55036). Une partie du travail de microscopie a été financée par la subvention DBI-0722569 de la NSF MRI et le Keith R. Porter Core Imaging Facility. La recherche a été soutenue en partie par une bourse NSF CAREER (1054422) et une bourse Basil O’Connor Starter Scholar de la Marche des dix sous, toutes deux décernées à MSG.

1. Dissection de ovarioles <ol><li> Transférer environ quinze 2-4 jours d&#39;âge mouches femelles et quelques hommes d&#39;une mouche des aliments frais flacon avec de la levure sèche active ajoutée. Utilisez le coton comme une prise pour les flacons, et ajouter quelques gouttes d&#39;eau au coton pour maintenir l&#39;humidité élevée. </li><li> Lieu flacon dans un incubateur à 25 ° pour 14-16 h pour maximiser le nombre de l&#39;étape 8-10 chambres d&#39;œufs. NOTE: Le temps d&#39;incubation varie selon la température et stade désiré. </li><li> Préparer les médias de dissection, 0,1 M KPO 4 et NP40 solutions au besoin pour le lendemain (voir Matériaux). </li><li> Anesthésier vol utilisant le CO 2, et le placer sous un microscope de dissection. Pipet quelques gouttes de médias de dissection dans chaque cavité dans la glissière de la dépression de verre. </li><li> Tenez pince dans chaque main à un angle d&#39;environ 30 ° vers le haut de table et orienter une mouche femelle avec les ailes vers le bas. Avec votre main non dominante, ramasser la femelle aide d&#39;une pince, son saisissant à la unenterior de l&#39;abdomen, près du thorax, et son plonger dans les médias de dissection dans la dépression coulisse (figure 1A encadré). </li><li> Avec l&#39;autre paire de pinces, saisir l&#39;exosquelette à la partie postérieure de l&#39;abdomen ventral et percer. Prenez les ovaires à l&#39;extrémité postérieure, puis de les sortir de l&#39;abdomen et le placer dans les médias frais de l&#39;autre côté de la glissière de la dépression. (Figure 1A encadré). Évitez de tirer en dehors de l&#39;intestin. Jeter la carcasse. </li><li> Répéter l&#39;opération avec les autres mouches femelles jusqu&#39;à ce que toutes les ovaires sont disséqués. Jeter les mâles. </li><li> Avec une paire de pinces, maintenez un ovaire à l&#39;extrémité postérieure (près des plus grandes salles d&#39;œufs), et avec l&#39;autre main utiliser une paire de pinces pour pincer l&#39;une des chambres les plus antérieures d&#39;œufs (de germarium). (Figure 1A). </li><li> Lentement mais sûrement, tirer une chaîne ovariole hors de la gaine ovaire. Continuer à disséquer ovarioles individuellement jusqu&#39;à ce que toutes les chambres d&#39;œufs souhaités sont removed. </li><li> Répétez les étapes 1.7 à 1.8 pour toutes les ovaires disséqués. </li><li> Une fois terminé, transférer ovarioles dans un tube de 0,6 ml à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert en plastique. </li><li> Laissez ovarioles se déposent au fond du tube, puis passez à fixation et de coloration étapes. </li></ol> 2. immunofluorescence (IF) Coloration des ovarioles <ol><li> Retirez délicatement les médias de dissection de ovarioles avec une pipette. Veillez à ne pas supprimer tous les ovarioles ou chambres d&#39;œufs. Laissez environ 50 pi de ovarioles et les médias de dissection. </li><li> Ajouter 50 ul de 16% de paraformaldéhyde à 150 ul de 0,1 M KPO 4 tampon dans un tube, et ajouter la solution à des chambres d&#39;oeuf pour les corriger. Incuber tout bascule pour 10 min. ATTENTION: paraformaldéhyde est toxique. </li><li> Retirer fixateur et rincer deux fois avec 0,5 ml de tampon de lavage de NP40. </li><li> Laver deux fois pendant 15 min chacune à la température ambiante. </li><li> Reportez-vous à la norme si le protocole 15 pour les étapes suivantes. <ol><li> Brièvement, après fixation, ajouteranticorps primaires aux dilutions appropriées et incuber O / N à 4 ° C. Laver à NP40 à plusieurs reprises, puis ajouter des anticorps secondaires (1: 200 dilutions). </li><li> Lavez plusieurs fois dans NP40, puis ajouter DAPI (1: 1000) pendant 10 min, puis répétez lavages. Une fois que si le protocole est complète, ajouter 200 ul de 50% de glycérol dans du PBS pour chambres d&#39;oeufs et laisser reposer à température ambiante pendant 2 h. </li><li> Retirer la solution, le remplacer par 70% de glycérol dans du PBS, et couvrir de papier d&#39;aluminium. Placez échantillon à 4 ᵒC jusqu&#39;au moment pour le montage. Pendant ce temps, passez à l&#39;étape 3. </li></ol></li></ol> 3. Préparation préalable de glycérine Jelly Diapositives <ol><li> Mesurer au moins 4 ml de glycérine gelée aide d&#39;une spatule et remplir un tube de culture de cellules de verre pour la marque à mi-chemin. Faire fondre la gelée de glycérine dans un bain d&#39;eau à 55 ° C pendant 30 min. </li><li> Verser une petite goutte de glycérol, environ 300 pi, de la solution de réserve sur deux lames de microscope. Utiliser un tissu, répartis glycérol dans une fine layer sur chacune des diapositives. Ceci fournit une base et permet de retirer facilement la glycérine gelée à l&#39;étape 5.6. </li><li> Coupez la pointe de d&#39;une pointe de pipette 1000 pi filtré. Utilisez copier pointe de la pipette pour transférer 1000-1500 ul de la glycérine chaude gelée lentement à chaque lame de microscope. Prenez soin d&#39;éviter les bulles. </li><li> Laissez diapositives glycérine gelée reposer pendant 5 min à température ambiante à définir. </li><li> Placez chaque diapositive glycérine gelée dans 60 mm × 15 mm plat de Pétri et couvrir d&#39;une pellicule plastique. Lieu à 4 ° CO / N. Eventuellement, magasin glycérine diapositives de gelée jusqu&#39;à 5 jours à 4 ° C. </li></ol> 4. Montage Chambers oeufs <ol><li> En utilisant des échantillons de l&#39;étape 2.5, pipette quelques gouttes 3 pi de chambres d&#39;œufs dans 70% de glycérol dans une diapositive de la gelée de glycérine. Continuer pipetage 3 gouttes ul jusqu&#39;à ce que toutes les chambres d&#39;oeufs sont sur cette diapositive. Assurez-vous que chaque goutte contient au moins dix chambres d&#39;œufs. Pendant ce temps, chauffer un tube de culture de glycérine gelée dans un bain-marie à 55 °. </li><li> Placer la lame de gelée de glycérine avec des chambres d&#39;oeuf sous un microscope à dissection. Ajuster le grossissement de telle sorte que seule une goutte de chambres d&#39;oeuf est dans le champ de vision (figure 1B). </li><li> En utilisant une aiguille de calibre 30 comme une cuillère, ramasser la chambre d&#39;œufs de stade désiré. Si nécessaire, les chambres d&#39;œufs souhaités séparée d&#39;une chaîne de ovariole utilisant l&#39;aiguille comme un couteau. </li><li> Pour éviter les débris qui peuvent interférer avec l&#39;imagerie, transférer la chambre de l&#39;œuf à la deuxième diapositive glycérine gelée, à la face antérieure gauche (figure 1E -1). Répéter jusqu&#39;à ce que il ya au moins sept chambres d&#39;oeuf alignés dans une colonne (figure 1C). </li><li> Former de nouvelles colonnes de sept jusqu&#39;à ce que toutes les chambres d&#39;oeuf désirées sont transférées à la seconde glissière de glycérine gelée. </li><li> Déchirez un petit morceau de tissu et la torsion. Utilisez cette option pour absorber l&#39;excès de PBS-glycérol des chambres d&#39;œufs en effleurant chacun. Prenez soin de ne pas supprimer les chambres d&#39;œufs. </li><li> Coupez lepointe d&#39;une pointe de pipette 200 pi filtré. Utilisez cette option pour transférer 150 pi de glycérine gelée pour couvrir toutes les colonnes de chambres d&#39;œufs. REMARQUE: La quantité de glycérine gelée nécessaire pour couvrir les colonnes est basé sur les étapes de la chambre d&#39;œufs et le nombre de colonnes. Montant peut être ajustée. </li><li> Laissez chambres d&#39;œufs montés reposer pendant 5 min à température ambiante jusqu&#39;à ce que la couche supérieure de la glycérine gelée est complètement solidifié (figure 1D). </li><li> Placer la lame de chambres d&#39;œufs montés dans une boîte de 60 mm × 15 mm de Pétri et couvrir d&#39;une pellicule plastique. Conserver à 4 ° CO / N pour permettre aux couches de gelée de glycérine pour solidifier ensemble (lieu dans l&#39;obscurité se il est préoccupé par photoblanchiment). </li></ol> 5. Préparation des Chambres oeufs for Imaging <ol><li> Placer les lames de chambres d&#39;oeufs montés sous un microscope à dissection. Ajuster le grossissement de telle sorte que seulement une colonne de chambres d&#39;oeuf est dans le champ de vision. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un angle de 45 ° scalpel miniature, couper un Straight ligne le long du côté droit de la première colonne de chambres d&#39;oeuf (à proximité de la face postérieure des chambres d&#39;oeuf). (Figure 1D-E) </li><li> Ensuite, couper au-dessus de la première chambre d&#39;oeuf en haut et en dessous de la dernière chambre de l&#39;oeuf dans la colonne. A ce stade, la colonne de chambres d&#39;oeuf doit être coupée sur trois côtés. </li><li> Utilisation d&#39;un microknife, tranche le long du côté gauche de la colonne, aussi près que possible de la face antérieure des chambres d&#39;oeufs (Figure 1E) -3. </li><li> Introduire à la pipette 100 pi de froid 1X PBT sur la colonne de coupe. </li><li> Utilisez une spatule à bords arrondis pour éliminer l&#39;excès de glycérine gelée autour de trois côtés de la colonne de chambres d&#39;œufs et jetez la coupe, en laissant le reste de la diapositive. </li><li> Insérer la spatule dans la coupe faite à la face antérieure de chambres d&#39;oeuf et séparer la colonne du bloc de glycérine gelée primaire. </li><li> Préparer les échantillons pour les deux inversées (5.8.1) ou verticale (5.8.2) microscopie. <ol><li> Pour microscope inversé: t Transfertil colonne de chambres d&#39;oeufs à une lamelle avec le côté antérieur de chambres d&#39;œufs vers le bas. Répéter les étapes 5.2 à 5.8 jusqu&#39;à ce que toutes les colonnes de la glycérine gelée ont été enlevés et monté. Ajouter quelques gouttes de 50% de PBS-glycérol sur chaque bloc de chambres d&#39;oeuf pour les empêcher de se dessécher. Chambres image d&#39;œufs directement sur la lamelle. </li><li> Pour microscope droit: Transférer la colonne de chambres d&#39;oeuf à une lame de microscope avec le côté antérieur vers le haut. Répéter les étapes 5.2 à 5.9 jusqu&#39;à ce que toutes les colonnes de la glycérine gelée ont été retirés et montés sur des lames de microscope. Ajouter quelques gouttes de 50% de PBS-glycérol sur chaque bloc de chambres d&#39;oeufs et des blocs de couverture avec un ½ lamelle # 1. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Nous décrivons ici une méthode pour monter et petite image, développer chambres d&#39;œufs dans une perspective de fin sur. Techniques communes pour les chambres imagerie d&#39;œufs sont optimisés pour des vues latérales et permettent principalement la visualisation précise des cellules folliculaires médio-latérale lorsqu&#39;ils sont colorés avec des anticorps fluorescents. L&#39;utilisation de piles ou Z-3-D reconstitutions aides à la visualisation de plusieurs plans focaux, mais est encore insuffisante pour la résolu...

Etude de Drosophila melanogaster a fourni de grandes connaissances dans la régulation génétique d&#39;un large éventail de phénomènes. En particulier, il ya eu des recherches approfondies sur le développement des œufs, parce oogenèse fournit un moyen souple pour enquêter sur de nombreux processus de développement différents, y compris les motifs des tissus, des changements de polarité cellulaire, la commutation du cycle cellulaire, et la réglementation de translation 1,2,3,4. Un événement important au cours de l&#39;ovogenèse morphogénétique est la spécification, l&#39;acquisition de la motilité et la migration d&#39;un ensemble de cellules appelées cellules frontalières (examinés dans cinq). Depuis la migration cellulaire est un élément clé de la morphogénèse des animaux, et parce que la régulation génétique de ce processus est bien conservé, des mécanismes déterminés mouches sont susceptibles d&#39;être importants dans d&#39;autres contextes. Ainsi, nous étudions le contrôle moléculaire de la migration cellulaire de frontière. Pour nos études, nous avons développé une nouvelle méthode pour observer les pôles antérieurs des œufs en développement,où les cellules se posent aux frontières, d&#39;examiner comment elles se développent en détail. Dans l&#39;ovaire, chambres d&#39;œufs à divers stades de développement existent le long des chaînes appelées ovarioles, qui sont entourées d&#39;une gaine mince (figure 1A). Chaque chambre de l&#39;œuf va se poursuivre pour former un œuf. Au cours de l&#39;ovogenèse, plusieurs types de cellules différents doivent se développer de manière coordonnée. Le D. chambre melanogaster d&#39;oeuf se compose de 16 cellules germinales, dont un ovocyte, entouré par une seule couche de l&#39;épithélium folliculaire 6. Un petit nombre de cellules spécialisées, appelées cellules polaires, se pose au antérieures et postérieures pôles de l&#39;épithélium. Les cellules de bordure 6-8 proviennent de l&#39;épithélium antérieur de la chambre d&#39;oeuf, induite par les cellules polaires 5,7. À la mi-ovogenèse (étape 9), les cellules de bordure se détachent de leurs voisins et migrent entre les cellules nourricières pour atteindre l&#39;ovocyte à la partie postérieure de la chambre d&#39;oeuf 5,7. Ce mouvement doit être accomplietandis que les mailles de bord restent dans un cluster polaires entourant deux cellules non-mobiles, ce qui rend ce type de migration cellulaire collective. Migration réussie de la grappe de cellules de la frontière assure le bon développement du micropyle de la coquille d&#39;oeuf, qui est nécessaire pour la fécondation. Les cellules polaires antérieures instruisent le destin des cellules de la frontière en activant une cascade de transduction du signal. Cellules sécrètent une cytokine polaires, non apparié (UPD), qui se lie à un récepteur transmembranaire, Domeless (DOME), sur les cellules de follicules voisin lors de l&#39;étape 8 de développement des ovocytes 8,9. La liaison de UPD provoque Janus tyrosine kinase (JAK) de phosphoryler le transducteur de signaux et activateur de la transcription (STAT) 8,10,11. STAT se déplace ensuite vers le noyau pour activer la transcription. Cellules frontaliers lents (SLBO) est un facteur de transcription qui est une cible transcriptionnelle directe de STAT et est également requis pour la migration des cellules de la frontière 12. Vues latérales de chambres d&#39;œufs indiquent tactivité de STAT chapeau est réglementée dans un gradient à travers l&#39;épithélium antérieure 8,11,13. Cellules folliculaires proches des cellules polaires ont les plus hauts niveaux de activé STAT, ainsi ils deviennent des cellules frontières et envahissent le tissu de la lignée germinale adjacente. Pour comprendre comment les cellules frontières sont spécifiées à l&#39;intérieur et se détachent de l&#39;épithélium, nous avons besoin d&#39;observer comment le tissu est organisé. Si nous considérons chambres d&#39;œufs dans une perspective antérieure sur, nous nous attendrions à symétrie radiale de l&#39;activité de STAT dans les cellules folliculaires qui entourent les cellules polaires. Une vue en bout serait également montrer avec plus de précision les différences de protéines membranaires et des interfaces cellule-cellule avant et pendant le détachement que de comparer les cellules dans différents plans focaux. Parce que les chambres d&#39;oeuf sont oblongues et fixées les unes aux autres par les cellules de la tige, ils se installent sur des lames latéralement, ce qui rend difficile l&#39;observation de l&#39;architecture antérieure. Ainsi, beaucoup d&#39;informations sur les cellules au niveau des pôles de la chambre d&#39;oeuf aété déduit de vues latérales. Bien que certaines informations peut être obtenue par algorithmiques reconstructions 3-D de sections optiques, diffusion de la lumière, de photoblanchiment, et les limites les plus pauvres de la résolution de l&#39;axe Z rendre cette information moins détaillée et fiable en l&#39;absence de techniques coûteuses comme la microscopie de super-résolution 14 . D&#39;autres types de formation d&#39;image sur la base de l&#39;article (par exemple, la microscopie électronique ou microtome découpe) exigent beaucoup de manipulation de tissus, y compris la déshydratation, ce qui augmente la probabilité pour les artefacts. Ainsi, nous avons développé une nouvelle méthode pour l&#39;image D. chambres melanogaster d&#39;œufs tandis que debout. Cette méthode a déjà fait ses preuves utiles à élucider comment les cellules mobiles sont voués (voir résultats représentatifs et Manning et al, en cours d&#39;examen), et est susceptible d&#39;être plus largement utile dans les études d&#39;autres aspects de l&#39;ovogenèse.

<table><tbody><tr><td>0,1 M Tampon phosphate de potassium (KPO4 Buffer)</td><td></td><td></td><td>Ajouter 3,1 g de NaH2PO4&bull ; H2O et 10,9 g de Na2HPO4 (anhydre) à H2O distillé pour obtenir un volume de 1 L. Le pH de la solution finale sera de 7,4. Ce tampon peut être stocké jusqu’à 1 mois à 4 °C.</td></tr><tr><td>Solution aqueuse de paraformaldéhyde à 16 %,</td><td>microscopie électronique de</td> qualité EM Sciences <td>15710</td><td>sans méthanol pour préserver la fluorescence GFP</td></tr><tr><td>Aiguille 30G x 1/2 pouce&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td>Biseau régulier</td></tr><tr><td>Levure sèche active</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>Pour engraisser les mouches femelles</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine Entreprise</td><td>de culture cellulaire</td><td>PAA A15-701</td><td>Utilisé dans NP40 Tampon de lavage</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td>Alliage Dumostar, pointe de biologie ; les pointes acérées sont essentielles pour la dissection de l’ovariole</td></tr><tr><td>DAPI (dichlorhydrate de 4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>5 mg/ml solution mère&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td>Ajouté au supplément moyen de dissection (10 %)&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tube de culture en verre</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td>14 ml</td></tr><tr><td>Lames de dépression en verre</td><td>VWR</td><td>470019-020</td><td>1,2 mm d’épaisseur, double cavité</td></tr><tr><td>Gelée de glycérine&nbsp ;</td><td>Microsocpy électronique Sciences</td><td>17998-10</td><td>Média de montage</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15760</td><td>70 % en PBS</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-500ML</td> <td>(interchangeable pour Nonidet P-40)&nbsp ; Utilisé dans le tampon de lavage NP40&nbsp ;</td></tr><tr><td>Stéréoscope fluorescent Leica&nbsp ;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal Leica SP5</td> Objectif sec <td>Leica Microsystems</td><td></td><td>40x/0.55NA.</td></tr><tr><td>Micro spatule&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>82027-518 Lame de</td> microscope <td>en acier inoxydable</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td>75x25x1 mm</td></tr><tr><td>NP40 Tampon</td><td></td><td></td> de lavage <td>50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0,5 % Ipegal, 1 mg/ml BSA et 0,02 % d’azoture de sodium</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>Ajouté au complément milieu de dissection (0.6X)</td></tr><tr><td>Pétridis- Polystérine, stérile</td><td>VWR</td><td>82050-548</td><td>60 W x 15 H mm</td></tr><tr><td>Tampon de phosphate salin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td>10 paquets de</td></tr><tr><td>poudre de phosphate de potassium dibasique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>Utilisé dans 0,1 M KPO4 Buffer&nbsp ;</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791-500G</td><td>Utilisé dans 0,1 M KPO4 Buffer&nbsp ;</td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>Schneider' s Insect Medium</td><td>Life Technologies</td><td> 11720018</td><td>Avec de la L-glutamine et</td></tr><tr><td>du bicarbonate de sodium Azoture de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>Utilisé dans la coloration par anticorps fluorescents</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de sodium Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>Utilisé dans le tampon de lavage NP40</td></tr><tr><td>TRIS-HCl</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70144</td><td>1 M TRIS-HCl, pH 7,4</td></tr><tr><td>Volocité Image 3D Logiciel d’analyse</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Pour le traitement des piles Z confocales</td></tr></tbody></table>

imagerie montant du<em&gt; drosophila</em&gt; chambres d&#39;oeufs

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

L’ovogenèse de Drosophila melanogaster offre un contexte idéal pour l’étude de divers processus de développement, car l’ovaire est d’architecture relativement simple, bien caractérisé et se prête à l’analyse génétique. Chaque chambre d’ovule est constituée de cellules germinales entourées d’une seule couche épithéliale de cellules folliculaires somatiques. Des sous-ensembles de cellules folliculaires subissent une différenciation au cours d’étapes spécifiques pour devenir plusieurs types de cellules différents. Les techniques standard permettent principalement une vue latérale des chambres d’ovules, et donc une vue limitée de l’organisation et de l’identité des cellules folliculaires. Le protocole d’imagerie verticale décrit une technique de montage qui permet une nouvelle vue verticale des chambres d’œufs avec un microscope confocal standard. Les échantillons sont d’abord montés entre deux couches de gelée de glycérine en position latérale (horizontale) sur une lame de microscope en verre. La gelée avec des chambres d’œufs enfermées est ensuite coupée en blocs, transférée sur une lamelle et retournée pour positionner les chambres d’œufs à la verticale. Les chambres d’œufs montées peuvent être imagées à l’aide d’un microscope confocal vertical ou inversé. Cette technique permet d’étudier la spécification, l’organisation, les marqueurs moléculaires et le développement des ovules avec de nouveaux détails et sous un nouvel angle.

La méthode d&#39;imagerie verticale nous a permis de voir directement l&#39;organisation des cellules de l&#39;épithélium folliculaire antérieure à l&#39;étape 8. Un marqueur général pour le destin des cellules du follicule, l&#39;Absent Eyes (EYA) protéine, ainsi que le marqueur d&#39;ADN nucléaire DAPI, a montré même l&#39;expression à travers ce champ de cellules, et ont montré que toutes les cellules ont pu être observés avec des intensités de coloration similaires (figure 2B &quot;). Les protéines ...

La méthode d’imagerie verticale décrite dans ce protocole permet de visualiser en détail les pôles d’un œuf de Drosophila melanogaster en développement. Cette vue d’ensemble offre une nouvelle perspective sur les arrangements et les morphologies de plusieurs types de cellules dans l’épithélium folliculaire.

Imagerie Montant du<em&gt; Drosophila</em&gt; Chambres d&#39;oeufs

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

L'objectif général de cette procédure est de permettre une imagerie à haute résolution des pôles des chambres œuf de drosophile. Cela est réalisé en disséquant d'abord les ovaires et en les marquant avec des anticorps fluorescents. La deuxième étape consiste à identifier et à séparer les chambres œuf d'intérêt.Les échantillons suivants sont orientés et alignés, puis inclus dans des blocs de gelée de glycérine. La dernière étape consiste à découper et à faire pivoter les blocs afin de monter les chambres à œufs avec l'axe longitudinal en position verticale. Enfin, une microscopie confocale est utilisée pour révéler l'organisation cellulaire et subcellulaire aux pôles de la chambre à œufs.L'épithélium, comme les arrangements des cellules de bordure, les méthodes existantes permettant d'observer des échantillons perpendiculairement au plan d'imagerie par sectionnement optique et reconstruction algorithmique en 3D peuvent provoquer un photoblanchiment et une diffusion de la lumière, et offrent une résolution moindre, ce qui donne des images moins précises. Le principal avantage de cette technique est qu'elle nous permet de monter les échantillons selon un nouvel angle et de les observer directement. Nous utilisons cette technique pour imager les pôles de chambres ovariennes en développement, ce qui a permis de mieux comprendre l'organisation des cellules folliculaires.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de préparation et de montage sont difficiles à apprendre, nécessitant une micro-manipulation des échantillons colorés et une réorientation des spécimens par rapport aux points de vue conventionnels. La procédure sera démontrée par Lathea Manning, étudiante diplômée dans mon laboratoire. Pour commencer l'expérience, prenez une lame en verre à cavité et ajoutez à l’aide d’une pipette plusieurs gouttes de milieu de dissection dans chaque cavité.Anesthésiez les mouches au dioxyde de carbone et placez-les sous un microscope stéréoscopique. Ensuite, orientez une mouche femelle avec les ailes vers le bas et la tête tournée vers la gauche. Tenez la pince dans chaque main selon un angle de 30 degrés par rapport au plan de la table, en utilisant la main non dominante.Prendre la drosophile à l'aide de pinces. Saisir la drosophile à l'avant de l'abdomen près du thorax et l'immerger dans le milieu de dissection. Dans la lame creuse, utiliser l'autre paire de pinces.Saisir l’exosquelette à la partie postérieure ventrale de l’abdomen et percer. Saisir les ovaires à l’extrémité postérieure, puis les extraire de l’abdomen et les placer dans le milieu frais de l’autre côté de la lame creuse. Ensuite, tenir un ovaire par l’extrémité postérieure près des plus grosses chambres ovariennes, et, de l’autre main, pincer lentement et régulièrement l’une des chambres ovariennes les plus antérieures ou le jamer.Extraire une chaîne folliculaire de la gaine ovarienne et poursuivre la dissection individuelle des follicules jusqu'à ce que toutes les chambres à œufs souhaitées soient retirées. Une fois la dissection terminée, utiliser une pipette plastique de transfert pour transférer le follicule dans un tube de 0,6 millilitre et laisser le follicule se déposer au fond du tube. À l'aide d'une pipette, retirer soigneusement autant que possible le milieu de dissection du follicule.Veillez à ne pas retirer d'ovules ou de follicules ovariens dans un nouveau tube. Ajoutez 50 microlitres de paraformaldéhyde à 16 % à 150 microlitres de tampon phosphate de potassium 0,1 molaire, puis ajoutez ce mélange aux follicules ovariens. Incubez-les sous agitation pendant 10 minutes. Après l'incubation, retirez le fixateur.Rincer deux fois avec du tampon NP-40, puis laver deux fois sur des aériens avec 0,5 millilitre de tampon NP-40 pendant 15 minutes chacun à température ambiante. Après la fixation et le lavage, ajouter les anticorps primaires et incuber l'oviale toute la nuit à quatre degrés Celsius ou pendant trois heures à température ambiante. Après l'incubation, laver les échantillons quatre fois pendant 20 minutes chacun avec 0,5 millilitre de tampon NP-40 à température ambiante.Ensuite, ajoutez les anticorps secondaires à une dilution de un à 200 et incubez l'ovial pendant trois heures ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, ajoutez le DPI à une dilution de un à 1000 et incubez l'ovial pendant 10 minutes. Lavez ensuite les échantillons quatre fois avec 0,5 millilitre de tampon de lavage NP 40 pendant 20 minutes par lavage à température ambiante.Une fois le protocole d'immunofluorescence ou IF terminé, ajoutez 200 microlitres de glycérol à 50 % dans du PBS aux chambres œufs et laissez-les reposer à température ambiante pendant deux heures, à l'abri de la lumière. Éliminez la solution, puis remplacez-la par du glycérol à 70 % dans du PBS et recouvrez le tube de papier d'aluminium. Conservez les échantillons à quatre degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être montés.Pour préparer l'échantillon de gelée de glycérine, prélever une aliquote de gelée de glycérine à l'aide d'une spatule afin de remplir à moitié un tube de culture en verre Pyrex de 15 millilitres, puis faire fondre la gelée de glycérine dans un bain-marie à 55 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pendant ce temps, déposer une goutte de 300 microlitres de glycérine provenant de la solution mère sur deux lames de microscope. À l'aide d'un mouchoir en papier, étaler la glycérine en une fine couche sur chacune des lames.Pour fournir une base permettant un retrait facile de la gelée de glycérine. Vérifiez que la gelée de glycérine est complètement fondue. Ensuite, coupez l'extrémité d'une pipette filtrante de 1000 microlitres et transférez lentement entre 1000 et 1 500 microlitres de gelée de glycérine tiède sur chaque lame de microscope, en prenant soin d'éviter la formation de bulles.Laisser reposer les lames de gelée de glycérine cinq minutes à température ambiante afin de fixer chaque gelée de glycérine. Placer chaque lame dans une boîte de Pétri de 60 millimètres de diamètre sur 15 millimètres de hauteur. Couvrir la boîte avec un film plastique et conserver les lames à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Prélèvez à la pipette plusieurs gouttes de trois microlitres de chambres à œufs provenant des échantillons préparés précédemment dans du glycérol à 70 %, et déposez-les sur une lame de gelée de glycérine. Continuez à pipeter des gouttes de trois microlitres jusqu'à ce que toutes les chambres à œufs soient placées sur la lame, en veillant à ce que chaque goutte contienne au moins 10 chambres à œufs. Ensuite, chauffez un tube de culture contenant de la gelée de glycérine dans un bain-marie à 55 degrés Celsius, placez une lame de gelée de glycérine avec les chambres à œufs sous un microscope stéréoscopique et réglez le grossissement de manière à ce qu'une seule goutte de chambres à œufs soit visible dans le champ d'observation.À l’aide d’une aiguille de calibre 30 servant de cuillère, prélevez la chambre à œufs du stade souhaité si nécessaire. Séparez les chambres à œufs souhaitées d’une chaîne ovarienne en utilisant l’aiguille comme un couteau afin d’éviter les débris pouvant interférer avec l’imagerie. Transférez la chambre à œufs sur la deuxième lame contenant du gel de glycérine.Répétez cette étape jusqu’à ce qu’au moins sept follicules soient alignés en colonne, avec leur côté antérieur tourné vers la gauche. Grattez les débris ou les follicules indésirables avec l’aiguille pour former de nouvelles colonnes de sept follicules, jusqu’à ce que tous les follicules souhaités soient transférés sur la deuxième lame de gelée de glycérine. Enroulez une petite pièce de Kimwipe, puis absorbez l’excès de PBS-glycérol des follicules en les touchant délicatement un par un. Veillez à ne pas retirer de follicules.Coupez l'extrémité d'une pipette de 200 microlitres munie d'un filtre et transférez 150 microlitres de gelée de glycérine afin de recouvrir l'ensemble des colonnes de chambres à œufs. Vérifiez au microscope que toutes les colonnes de chambres à œufs sont bien recouvertes. Laissez les chambres à œufs montées reposer cinq minutes à température ambiante jusqu'à ce que la couche supérieure de gelée de glycérine soit complètement solidifiée.Ensuite, placer une lame contenant des chambres à œufs montées dans une boîte de Pétri de 60 millimètres sur 15 millimètres et la recouvrir de film plastique. Conserver la boîte à quatre degrés Celsius pendant la nuit afin de permettre aux couches de gelée de glycérine de se solidifier ensemble à l’obscurité. Si une décoloration photochimique est possible, placer une lame contenant les chambres à œufs montées sous un microscope stéréoscopique.Régler un grossissement de manière à ce qu'une seule colonne de chambres à œufs soit dans le champ de vision. À l’aide d’un scalpel miniature à angle de 45 degrés, effectuer une incision droite le long du côté droit de la première colonne de chambres à œufs, près du côté postérieur des chambres à œufs.Ensuite, effectuez une incision au-dessus de la première chambre à œufs en haut et au-dessous de la dernière chambre à œufs dans la colonne, de sorte que les chambres à œufs soient désormais sectionnées sur trois côtés. Utilisez un micro-couteau pour découper le long du côté gauche de la colonne, en vous rapprochant au maximum du côté antérieur des chambres à œufs. Puis, ajoutez à l’aide d’une pipette 100 microlitres de XPBT froid sur la colonne sectionnée, à l’aide d’une spatule ronde.Retirez le gel de glycérine excédentaire autour des trois côtés de la colonne découpée de chambres à œufs et jetez l'excès. Insérez la spatule dans l'incision faite au niveau du côté antérieur des chambres à œufs et séparez la colonne du bloc principal de gel de glycérine pour la monter sur une lame et procéder à l'imagerie. La méthode d'imagerie en position droite permet une visualisation directe de l'organisation des cellules dans l'épithélium folliculaire antérieur au stade huit.Un marqueur général du sulfate des follicules, la protéine eyes absent ou IA, ainsi que le marqueur d'ADN nucléaire DPI montrent une expression uniforme dans ce champ cellulaire et démontrent que toutes les cellules peuvent être observées avec des intensités de coloration similaires. La vision conventionnelle d'une chambre ovarienne contraste avec celle obtenue par une reconstruction tridimensionnelle de la chambre ovarienne. L'encart montre l'axe tourné.L'axe des x est orienté vers le bas. L'axe des z est maintenant dirigé vers la gauche, et l'axe des y est orienté vers l'observateur. Les cellules individuelles sont floues en raison de la faible résolution selon l'axe des z.Ainsi, la nouvelle approche représente une amélioration significative en matière d'imagerie. La méthode d'imagerie en position droite permet de visualiser efficacement l'épithélium antérieur dans les chambres à œufs au stade neuf. À ce stade de développement, les cellules limitrophes se regroupent autour des cellules polaires.On observe ces agrégats compacts grâce à l'imagerie par endon. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment monter des échantillons afin d'obtenir de nouvelles perspectives d'observation. Nous avons utilisé cette technique pour imager les pôles de chambres à œufs en développement à des stades sélectionnés.Cette technique générale pourrait être utilisée pour d'autres stades de la drosophile, l'ovogenèse, ou pour d'autres types de petits tissus.

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