Name: Méthode EPA 1615. Mesure des entérovirus et Norovirus présence dans leau par la culture et RT-qPCR. Partie III. Détection de virus par RT-qPCR (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Découvrez la méthode EPA 1615 pour quantifier les entérovirus et norovirus dans l'eau par RT-qPCR. Cette technique utilise l'ultrafiltration centrifuge et la PCR en temps réel pour surveiller la qualité microbiologique des eaux.

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Les auteurs remercient le Dr Eric Rhodes pour la préparation des clones utilisés dans le développement du réactif de courbe standard, Brian McMinn pour son aide dans le traitement des échantillons, Larry Wymer pour l’analyse statistique, le Dr Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, pour avoir fourni le poliovirus Sabin sérotype 3 utilisé dans cette étude et le Dr H. W. Virgin, de l’Université de Washington, St. Louis, MO, pour le norovirus murin. Les auteurs remercient également Gretchen Sullivan pour son aide dans la préparation des réactifs de laboratoire, le Dr Mohammad Karim pour la propagation des stocks de norovirus murins, ainsi que les propriétaires de puits privés locaux et les services publics pour nous avoir permis de prélever des échantillons d’eau. Bien que ce travail ait été examiné par l’EPA et approuvé pour publication, il ne reflète pas nécessairement la politique officielle de l’Agence. La mention de noms commerciaux ou de produits commerciaux ne constitue pas une approbation ou une recommandation d’utilisation.

Remarque: Utilisez des feuilles de données pour suivre toutes les étapes du protocole; exemples de fiches de données sont donnés dans le matériel supplémentaire tableaux S2-S4. 1. Préparation courbe standard <ol><li> Préparer un stock de travail du réactif de la courbe standard (par exemple, Armored RNA EPA-1615) par dilution de la concentration fournie par le fabricant à une concentration de 2,5 x 10 8 particules / ml (2,5 x 10 8 GC / ml) en utilisant TSM tampon III. Diviser le stock de travail dans 250 ul aliquotes en utilisant 1,5 ml microtubes et conserver à -20 ° C. NOTE: Voir supplémentaire protocole de matériaux étape S1 pour obtenir des instructions sur les stocks de travail qui préparent de virus et les plasmides utilisés comme réactifs alternatifs de la courbe standard. </li><li> Décongeler une ou plusieurs des actions aliquotes de travail. Préparer cinq dilutions en série de 10 fois à l&#39;aide de 1,5 ml microtubes, donnant des concentrations de 2,5 x 10 7, 2,5 x 10 6, 2,5 x10 5, 2,5 x 10 4 et 2,5 x 10 3 GC / ml. <ol><li> Préparer la première dilution en ajoutant 25 ul de 2,5 x 10 8 GC / ml stock de travail à 225 pi de tampon TSM III. Mélanger pendant 5 à 15 secondes en utilisant un mélangeur vortex. </li><li> Préparer la dilution suivante en ajoutant 25 pi de la dilution à l&#39;étape 1.2.1 préparé à 225 ul de tampon TSM III. Mélanger à nouveau et continuer un processus similaire pour préparer les trois prochaines dilutions de 10 fois. </li></ol></li><li> Extraire l&#39;ARN à partir du stock de travail de la courbe standard et les cinq dilutions immédiatement suivant la procédure décrite dans la section 3. </li></ol> 2. Concentration tertiaire <ol><li> Préparer un concentrateur centrifuge (30.000 moléculaire de coupure de poids) pour chaque échantillon prélevé par l&#39;addition d&#39;au moins 10 ml de 1 x PBS, 0,2% de sérumalbumine bovine (BSA) à la chambre de mesure supérieure. Assurez-vous que la solution a rempli la chambre de concentration de canal mince, et puis maintenez O / N à 4 ° C. <ol><li&gt; Jeter le liquide. Rincer le concentrateur une fois avec au moins 10 ml d&#39;eau stérile de qualité réactif pour éliminer l&#39;excès de BSA, puis jetez l&#39;eau. </li></ol></li><li> Ajouter une quantité de concentré d&#39;eau secondaire de chaque échantillon d&#39;épreuve égale à S, le dosage Volume d&#39;échantillon dans concentrateurs centrifuges séparés. <ol><li> Calculer S en utilisant l&#39;équation 1, <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq1.jpg" /> Où D est le volume de l&#39;échantillon de l&#39;eau d&#39;origine titré, TSV est le volume de l&#39;échantillon total et FCSV est le concentré Volume d&#39;échantillon final. Voir matériaux supplémentaires S2 pour un exemple de calcul de S. </li></ol></li><li> Centrifugeuse de chaque échantillon d&#39;essai à 3,000-6,000 g à 4 ° C dans un seau rotor oscillant pendant 20 - 30 min. Vérifiez le volume de la chambre de concentration de canal mince. <ol><li> Si le volume est supérieur à 400 ul, centrifuger à nouveau pendant 20 minutes ou plus longtemps. Continuer centrifugation jusqu&#39;à l&#39;échantillon dans ee chambre de concentration de canal mince a été réduite à moins de 400 ul. Ne pas retirer le surnageant. </li></ol></li><li> Laver les côtés du concentrateur centrifuge avec 1 ml de phosphate de sodium 0,15 M, pH 7 à 7,5 stérile pour augmenter la récupération du virus. Centrifuger de nouveau à 3,000-6,000 xg et 4 ° C jusqu&#39;à ce que l&#39;échantillon a été réduit à moins de 400 ul. Répétez cette étape de lavage une fois supplémentaire. </li><li> En utilisant une micropipette 100 à 200 ul, soigneusement mesurer et transférer chaque échantillon concentré dans un tube de 1,5 ml (à savoir, transférer 200 pl dans le tube de microcentrifugeuse et ensuite mesurer le concentré restant en ajustant la micropipette jusqu&#39;à ce que le fluide restant peut être complètement établie dans la pointe de pipette). Ajouter phosphate de sodium 0,15 M, pH 7 à 7,5, pour ajuster le volume final à 400 ± 2 ul. </li><li> Extrait acide nucléique immédiatement en procédant à l&#39;étape 3. Maintenir des échantillons concentrés qui ne peuvent être processeD immédiatement à 4 ° C pendant pas plus de 24 h. </li></ol> 3. Isolement d&#39;acide nucléique <ol><li> Ajouter 200 ul de tampon d&#39;extraction préparé comme décrit dans l&#39;étape 3.3 et 200 pi de concentré tertiaire à partir de chaque échantillon d&#39;essai obtenu à l&#39;étape 2.5 ou dilution de la courbe étalon de l&#39;étape 1.3 pour séparer marqué tubes de 1,5 ml de microcentrifugation. Congeler restant concentrés tertiaires égale ou inférieure à -70 ° C. Extraire les acides nucléiques de l&#39;échantillon selon les instructions du nucléique extraction d&#39;acide kit pour le constructeur du protocole de filage pour des échantillons de sang avec les exceptions suivantes. </li><li> Ne pas ajouter de protéase pour les échantillons d&#39;eau ou d&#39;utiliser le tampon d&#39;extraction fourni avec le kit d&#39;extraction d&#39;acide nucléique. </li><li> Préparer tampon d&#39;extraction avec de l&#39;ARN de support <ol><li> Ajouter 310 pi de tampon de dilution de l&#39;ARN du vecteur dans une fiole contenant 310 ug d&#39;ARN de support. Mélangez pour dissoudre, puis diviser en 6 aliquotes contenant environ 50 pi. Conserver à -20° C. </li><li> Ajouter 28 ul d&#39;ARN de support décongelé par ml de tampon d&#39;extraction pour obtenir une concentration de l&#39;ARN du support de 0,027 ug / ul. Utilisez le tampon d&#39;extraction d&#39;ARN-porteuse modifiée à la place de celle fournie avec le kit d&#39;extraction. </li></ol></li><li> Préparer une solution mère de tampon d&#39;élution par addition de ribonucléase (RNase) inhibiteur à une concentration finale de 400 unités / ml dans le tampon d&#39;élution fourni avec le kit d&#39;extraction. <ol><li> Eluer l&#39;ARN à partir de l&#39;acide nucléique de liaison colonne de centrifugation en plaçant 50 yl de tampon d&#39;élution avec un inhibiteur de RNase dans la colonne. Attendre 1 min, puis centrifuger à 6000 g pendant 1 min à température ambiante. </li><li> Répétez l&#39;étape 3.4.1 et ensuite retirez et jetez la colonne. </li></ol></li><li> Préparer des aliquotes des extraits d&#39;ARN provenant de l&#39;étape 3.4.2. Préparer 6 aliquotes du stock de travail de courbe standard et chaque dilution de la courbe standard contenant au moins 15 pi de chacun. Préparer 4 parties aliquotes de tous les autres échantillons d&#39;ARN contenant au moins22 ul chacune. Stockez une aliquote de chaque échantillon et courbe standard contrôles à 4 ° C si elles peuvent être traitées par transcription inverse dans les 4 h; sinon, mémoriser toutes les aliquotes égales ou inférieures à -70 ° C. </li></ol> 4. transcription inverse (RT) <ol><li> Préparer 100 uM de solutions mères de chaque amorce oligonucléotidique et la sonde énumérés dans le tableau 1 par addition d&#39;un volume d&#39;eau qualité PCR à chaque flacon en utilisant une quantité (en microlitres) égale à dix fois le nombre de nanomoles (nmol) de l&#39;oligonucléotide présent dans le flacon (comme indiqué sur l&#39;étiquette du flacon ou dans la spécification la fiche du fabricant (par exemple, remettre en suspension une amorce contenant 36,3 nmol à 363 pi). mélanger pour dissoudre. <ol><li> Diluer les solutions 100 pm à 1:10 avec de l&#39;eau qualité PCR pour préparer 10 pm solutions de travail. </li></ol></li><li> Préparer RT Master Mix 1 et 2 dans une salle blanche en utilisant le guide dans le tableau 2. Pipette 16,5 pi de RT Master Mix une plaque PCR à chaque puits en utilisant une pipette multicanaux. </li><li> Thaw, si gelé, les extraits d&#39;acides nucléiques à partir de chaque échantillon de terrain et de laboratoire fortifiée matrice de l&#39;échantillon (LFSM;-à-dire, ensemencé échantillon de matrice d&#39;eau). <ol><li> Diluer chaque échantillon LFSM champ et 1: 5 et 1:25 dans un tampon d&#39;élution contenant 400 unités / ml d&#39;inhibiteur de RNase. </li><li> Thaw, si gelé, mais ne pas diluer Lab fortifié Blank (LFB;-à-dire, un contrôle de la qualité positive en utilisant de l&#39;eau de qualité réactif tête de série), Lab Blanc réactif (LRB;-à-dire, un contrôle de qualité négatif en utilisant l&#39;eau de qualité réactif), évaluation de la performance (PE ;-à-dire, des échantillons d&#39;eau de qualité de réactifs ensemencées utilisés pour évaluer la performance de laboratoire avant le début d&#39;une étude), test de performance (PT;-à-dire, des échantillons d&#39;eau ensemencés de qualité réactif avec des titres inconnus à un analyste qui sont utilisés pour évaluer la performance du laboratoire au cours d&#39;une étude ), NA lot contrôle d&#39;extraction négative, ou de l&#39;ARN extrait de l&#39;ensemble de la courbe standard. </li></ol&gt; </li><li> Placez 6,7 pi de l&#39;ARN à partir de chaque échantillon de test, de contrôle, et la courbe standard dans des puits de plaque PCR séparées, en utilisant des puits en triple pour les échantillons et les groupes témoins et des puits en double pour les courbes standard (voir Figure S1 pour un exemple de plaque RT). <ol><li> Placez 6,7 pi de tampon d&#39;élution dans des puits de plaques séparées de PCR pour les contrôles sans matrice (NTC). Inclure 2-8 NTC par plaque RT, à l&#39;aide de deux pour le premier échantillon, puis deux de plus pour chaque quatrième échantillon supplémentaire. </li><li> Distribuer l&#39;extraction négative et des contrôles tout au long de la plaque NTC. </li></ol></li><li> Sceller la plaque PCR avec une plaque résistante scellant de chaleur. Mélanger les échantillons pour les 5-10 secondes, puis centrifuger à ≥ 500 brièvement XG. </li><li> Incuber la plaque pendant 4 min à 99 ° C, puis refroidir rapidement à 4 ° C dans un thermocycleur. Nouveau Centrifugeuse à ≥ 500 brièvement XG. </li><li> Retirez délicatement le joint de plaque, puis ajouter 16,8 pi de RT Master Mix 2 à chaque puits. Seal de nouveau la plaque avec un scellant pour plaques résistant à la chaleur, suivie d&#39;un mélange et une brève centrifugation à ≥ 500 x g. </li><li> Placer la plaque dans un cycleur thermique et fonctionner pendant 15 min à 25 ° C, puis 60 min à 42 ° C, 5 min à 99 ° C, puis par un cycle C de maintien à 4 °. </li><li> Processus immédiatement ou dans les 8 heures par qPCR (étape 5), ou de stocker des échantillons à ou en dessous de -70 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils puissent être traités. Conserver les échantillons qui peuvent être traitées au sein de 8 h à 4 ° C. </li></ol> 5. temps réel PCR quantitative (qPCR) <ol><li> Déterminer la moyenne de l&#39;hépatite G Cq valeur pour chaque lot de l&#39;hépatite G réactif avant d&#39;exécuter les échantillons de test. <ol><li> Exécutez un test RT utilisant 10 répétitions préparés comme décrit pour les contrôles NTC (étape 4.1.1). Exécutez l&#39;hépatite G qPCR dosage tel que décrit ci-dessous (étapes 5.2 à 5.5.3). Calculer la valeur Cq moyenne des 10 répétitions. </li><li> Ajuster le hépatite G quantité de réactif dans une RT Master Mix (tableau 2), Si nécessaire, pour obtenir une valeur moyenne Cq entre 25 et 32 ​​unités. Compenser le montant levé ou abaissé en modifiant le volume d&#39;eau ajoutée pour maintenir le Master Mix RT 1 volume final à 16,5 pi par test. </li><li> Confirmez les réglages en répétant les étapes 5.1.1 à 5.1.2 et le changement Tableau 2 pour refléter les quantités ajustées. </li></ol></li><li> Préparer qPCR master mix dans une salle blanche en utilisant les guides dans le tableau 3 pour les entérovirus, les tableaux 4 et 5 pour de norovirus le I, le tableau 6 pour norovirus de génogroupe II, le tableau 7 pour les norovirus murin (norovirus de génogroupe V), et le tableau 8 pour l&#39;hépatite G. Mix chaque Master Mix, puis centrifuger à ≥ 500 brièvement XG. </li><li> Ajouter les master mix PCR aux puits appropriés d&#39;une plaque optique marqué de réaction, en utilisant 14 pi par puits et les plaques séparées pour chaque essai qPCR (voir Figure S2 </strong&gt; pour un agencement possible pour un essai PCR quantitative sur la base du schéma de la figure RT S1). </li><li> Décongeler la plaque RT de l&#39;étape 4.8 à TA, si gelé. Mélanger à l&#39;aide d&#39;un mélangeur de plaque et puis centrifuger à ≥ 500 brièvement XG. </li><li> Distribuer 6 ul de l&#39;ADNc approprié dans les puits appropriés de la plaque de réaction optique. Mélanger les échantillons dans le plateau de réaction optique et centrifuger à ≥ 500 brièvement XG. <ol><li> Exécutez l&#39;hépatite G qPCR test sur le terrain non dilué et dilué et échantillons LFSM avant d&#39;exécuter toutes les autres tests qPCR. Utilisez la plus faible dilution de champ ou un échantillon de LFSM qui est &lt;1 Cq valeur supérieure à la moyenne de l&#39;hépatite G Cq valeur pour les entérovirus et norovirus analyses qPCR. </li><li> Mettre en place le logiciel quantitative PCR du thermocycleur selon les instructions du fabricant. Identifier les échantillons de courbe standards et normes pour chaque dilution de la courbe standard, entrez les valeurs de copie génomique présentés dans le tableau 9. </li><li&gt; Exécuter la plaque dans le cycleur thermique de PCR quantitative pendant 10 min à 95 ° C, suivie de 45 cycles de 15 sec à 95 ° C et 1 min à 60 ° C. </li></ol></li><li> Déterminer si chaque courbe norme répond aux valeurs acceptables indiquées dans le tableau 10. Voir la section des matériaux supplémentaires S3 pour des exemples. <ol><li> Calculer l&#39;écart type global (StdDev) pour la courbe standard en utilisant l&#39;équation 2, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq2.jpg" /> où Cq est la valeur déclarée pour chaque réplique de courbe standard, CQ est la valeur moyenne pour chaque ensemble de répétitions, #Cq est le nombre total de valeurs Cq pour toutes les répétitions de commande standard qui ont des valeurs positives (c.-à-pas indéterminée), et # MST est le nombre de commandes standards qui ont des valeurs positives. </li><li> Si le logiciel de PCR quantitative de cycleur thermique ne calcule pas la pente pour chaque courbe standard, calculer la pente en utilisant l&#39;équation 3,60; <img alt="Équation 3" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq3.jpg" /> où Cq est la valeur moyenne des dilutions extrêmes utilisées et connectez-GC est le journal de la valeur de la copie génomique pour les dilutions extrêmes utilisées dans le tableau 9. </li><li> Calculer la valeur R 2 en utilisant l&#39;équation 4. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq4.jpg" /> où Cq est la moyenne de toutes les valeurs Cq et GC Connexion est la valeur moyenne GC journal pour chaque répétition. </li><li> Calculer l&#39;efficacité de l&#39;aide de l&#39;équation 5%: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq5.jpg" /></li></ol></li><li> Enregistrez les valeurs de GC calculées par le logiciel de cycleur thermique pour tous les échantillons à tester en fonction des courbes standards qui répondent aux critères spécifiés dans le tableau 10 et les valeurs de GC moyennes pour chaque échantillon. Relancez tous les échantillons avec des courbes standards qui ne répondent pas aux critères <strong&gt; Tableau 10 ou que des témoins négatifs (LRB, NA lot négative contrôle d&#39;extraction, ou NTC) sont positifs. Retraiter les échantillons qui ne respectent pas les critères ou qui ont des contrôles faux positifs lors de la reprise. </li><li> Déterminer la GC par litre (GC L) pour chaque échantillon de test en utilisant l&#39;équation 6: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq6.jpg" /> où GC est le nombre de copies génomiques moyen de l&#39;étape 5.7, le facteur «199» est le facteur de dilution total de la réduction de volume qui se produisent au cours de la concentration tertiaire, extraction d&#39;ARN et les étapes de RT-qPCR, DF est le facteur de dilution qui compense inhibition et D est le volume de l&#39;échantillon de l&#39;eau d&#39;origine dosés en litres. Voir section matériaux supplémentaires S4 pour un exemple de calcul de GC L. </li><li> Calculer la GC total de LFB et LRB échantillons en multipliant la valeur moyenne de l&#39;étape 5.5 de GC par 199 et en divisant par 0,3. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Études nationales à grande échelle de la contamination virale de source et les eaux potables nécessitent l&#39;utilisation de plusieurs laboratoires d&#39;analyse. Dans ces conditions, une méthode standard est nécessaire pour assurer que les données générées par les laboratoires multiples est comparable. Il existe de nombreuses méthodes moléculaires publiées pour la détection de virus, mais très peu de méthodes moléculaires standardisés. Méthode EPA 1615 est une méthode normalisée spécialement conçu pour la détection des entérovirus et norovirus dans les matrices d&#39;eau RT-qPCR par. Méthodes moléculaires standardisés sont disponibles pour la détection de virus dans les aliments (CEN / TS 15216-1 et ISO CEN / TS 15216-2 ISO; Avril 7, 2013) 16,17 et ont été appliquées à la détection de virus de l&#39;hépatite A et les norovirus au printemps l&#39;eau 16. Toutes les méthodes standard doivent inclure des contrôles de performance de qualité et des critères pour minimiser inter- et intra-laboratoire variation et les données faussement positifs dus à la contamination de laboratoire. Pour réduire encore de fausses données, EMéthode PA 1615 suit la direction de l&#39;EPA sur les méthodes moléculaires, 18 qui stipule la séparation de travail pendant le traitement et un moyen flux de travail. Il comprend une hépatite G 1,19 procédures de contrôle et de minimiser les faux résultats négatifs dus à des inhibiteurs de la RT-qPCR 15 interne. Il utilise des dosages quantitatifs et de volumes normalisés à la fois l&#39;eau et de l&#39;eau échantillonnée analysé afin que toutes les données de champ est exprimée en copies génomiques par litre du champ ou de boire de l&#39;eau échantillonnée. Bien que seul tube efficace (en une étape) dosages RT-PCR sont disponibles dans le commerce, le procédé utilise intentionnellement essais séparés. Ceci présente l&#39;inconvénient de réduire au minimum la quantité d&#39;échantillon qui peut être dosé dans chaque réaction, mais donne une plus grande souplesse dans l&#39;utilisation de plusieurs ensembles d&#39;amorces. Dosages RT-qPCR sont limitées par et seulement aussi bon que les amorces et les sondes utilisées et probablement pas de jeu d&#39;amorces permet de détecter toutes les variantes de virus au sein d&#39;un groupe. L&#39;ensemble entérovirus amorce a été choisi parce queil cible la région conservée 5&#39;-non codant, 20,21 détecte une grande variété de sérotypes d&#39;entérovirus, et les virus détectés par elle sont associés à des effets sur la santé de la consommation des eaux souterraines non traitées 1. Deux jeux d&#39;amorces sont utilisés pour la détection des norovirus de génogroupe I 22,23. Le premier a été choisi en raison de la forte corrélation entre les effets sur la santé chez les jeunes enfants et les virus détecté 1. La deuxième génogroupe I ensemble d&#39;amorces et l&#39;ensemble de amorce utilisée pour les norovirus de génogroupe II ont été choisis parce qu&#39;ils détectent la plus grande variété de souches 24,25. En dépit des avantages majeurs de procédures et RT-qPCR qPCR pour la détection de l&#39;ARN viral dans l&#39;eau, il existe plusieurs limitations. Tout d&#39;abord, les deux particules virales infectieuses et non infectieuses, y compris ceux inactivé par les désinfectants, peuvent être amplifiées par ces procédures. Les résultats de Borchardt suggèrent que ceci est moins problématique pour les eaux souterraines non traitées from aquifères semblables à ceux dans les communautés étudiées que pour les eaux de surface désinfectée 1. Pour les virus cultivables ce problème peut être surmonté en utilisant une PCR en combinaison avec 26,27 culture. Le problème a également été abordée par certains virus grâce à l&#39;utilisation de l&#39;acide nucléique agents de réticulation 28-30. Cette dernière approche est plus efficace pour les virus inactivés par l&#39;hypochlorite et pas efficaces pour ceux inactivé par UV. Une seconde limitation de ces procédures moléculaires est que le volume de l&#39;échantillon concentré qui peut être dosé typiquement beaucoup plus petite que celle utilisée pour les procédures de culture 6,31. Ce problème est souvent traitée par l&#39;une substitution d&#39;une procédure de polyéthylène à base de glycol à la concentration étalon secondaire par floculation organique, ce qui permet à l&#39;échantillon d&#39;être remis en suspension dans un plus petit volume, ou par l&#39;addition d&#39;une concentration de l&#39;échantillon tertiaire étape 6,32,33 . Méthode 1615 utilise centrifultrafiltration ugal pour fournir la concentration tertiaire. Ultrafiltration centrifuge élimine l&#39;eau et les composants de 30.000 Daltons moins en résultent à la fois la concentration de virus dans des échantillons d&#39;essai et une réduction en petits inhibiteurs de poids moléculaire des analyses moléculaires. Ces résultats tertiaires étape de concentration à un facteur de concentration globale de&gt; 10 5 pour tout virus qui était présent dans l&#39;eau en cours de test. Une troisième limite est la présence d&#39;inhibiteurs de procédures moléculaires dans des échantillons environnementaux. Bien que de nombreuses approches pour éliminer les inhibiteurs ont été développés, aucune approche est efficace pour toutes les matrices d&#39;eau et les types de virus 6,34,35, rendant l&#39;utilisation de contrôles internes visant à estimer le niveau d&#39;inhibition essentielle. Le réactif de l&#39;hépatite G utilisé dans ce procédé répond à ce besoin en fournissant un niveau constant de l&#39;ARN viral dans toutes les réactions et une analyse RT-PCR quantitative pour estimer inhibition. Quand le meilleur de til inhibiteur approches de suppression pour supprimer l&#39;inhibition sûr, les concentrés d&#39;échantillons peuvent être dilués dans la mesure où des concentrations de virus sont plus élevées que les concentrations inhibiteur 14,15. La procédure de courbe standard décrit ici a des avantages et une limitation majeure. Un avantage est que le réactif utilisé fournitures tous les composants nécessaires d&#39;un seul réactif, ce qui permet une commande unique pour être utilisé pour tous les tests. Ce réactif est particulièrement un avantage pour les dosages de norovirus. Particules de norovirus ne peuvent être obtenus auprès de personnes infectées qui rend très difficile d&#39;obtenir des particules virales pour une utilisation en tant que normes. Un avantage le plus important est qu&#39;il fournit un niveau d&#39;ARN pour tous les virus à ARN ciblés dans un réactif, comme ayant un niveau d&#39;ARN est essentielle pour une quantification précise de l&#39;ARN 36. Cependant, sa capacité à quantifier avec précision virus est limitée par le fait que les effets de matrice ne sont pas prises en compte. Cela signifie que la copie génomiquevaleurs numériques ne peuvent pas être considérés comme absolue et ne devraient être considérées en termes relatifs. Il est recommandé qu&#39;un nombre suffisant de courbe standard stock de travail aliquotes (étape 1.2) être prêt à couvrir des études complètes. Par exemple, chaque portion aliquote de 250 ul de réactif suffisante pour fournit des 6 plaques RT. Si l&#39;on sait qu&#39;une étude nécessitera une analyse de 500 échantillons, un minimum de 12 aliquotes serait nécessaire (500 échantillons / 7 échantillons par plaque RT / RT 6 plaques par aliquote). Méthode EPA 1615 est une méthode basée sur la performance. De nombreux fabricants font réactifs équivalentes à celles spécifiées dans le présent et ces réactifs peuvent être substitués tant que les critères de performance sont atteints. La courbe standard, qui sert aussi un contrôle RT-qPCR positif, est de valeur dans les problèmes de performance de dépannage. Les performances peuvent diminuer en raison de la dégradation de l&#39;ARN, la durée de vie de réactif, l&#39;échec des congélateurs, étalonnage de l&#39;instrument, et l&#39;erreur technique. Les problèmes de performances devraient être suspected si les courbes standards diffèrent de celui de la figure 4 ou si elles ne répondent pas aux spécifications de performance pour les courbes standard. Le test RT-qPCR est assez robuste; échec complet est probablement due à une mauvaise manipulation de l&#39;ARN ou une erreur technique (par exemple, un réactif manquant). Un grand soin doit être apporté à la manipulation des échantillons d&#39;ARN entre l&#39;extraction et l&#39;étape RT pour réduire la dégradation de l&#39;ARN à partir ribonucléases. Recouvrements de poliovirus à partir des eaux souterraines et de qualité réactif et murins recouvrements de norovirus dans les eaux souterraines ont rencontré le Méthode EPA 1615 les critères d&#39;acceptation de la performance (tableau 11) et sont similaires à ceux rapportés par d&#39;autres 33,37,38. Murins recouvrements de norovirus provenant d&#39;échantillons LFB étaient beaucoup plus faibles que celles du poliovirus et auraient pas atteint les critères d&#39;acceptation spécifiques poliovirus. Les raisons de la reprise de norovirus murin inférieure de l&#39;eau de qualité réactif sont inconnus. Comme pour les résultats des présentes, Karim et Colleagues signalé une reprise des norovirus GI.1 de 4% de l&#39;eau du robinet 39. Lee et al. 37 ont signalé des récupérations moyennes pour norovirus murin et GII.4 de norovirus humain de 18% et 26% de l&#39;eau distillée en utilisant des filtres à disques, respectivement. En utilisant des conditions similaires à Lee et ses collègues, Kim et Ko observé des récupérations de 46% et 43% pour ces virus, respectivement 38. Gibbons et al. 40 obtenus autour de récupération de 100% GII.4 de norovirus humains à partir d&#39;eau de mer, mais Kim et Ko 38 ont trouvé que l&#39;ajout de sel à l&#39;eau distillée à des concentrations similaires ou supérieures à l&#39;eau de mer considérablement réduit recouvrements du virus murin et a abouti dans environ une réduction de deux fois dans la récupération GII.4.

PCR quantitative (qPCR, voir matériaux supplémentaires pour les définitions des termes utilisés dans ce manuscrit) et la transcription inverse-qPCR (RT-qPCR) sont des outils précieux pour détecter et quantifier les virus entériques humains dans l&#39;environnement et les eaux potables, et en particulier pour de nombreux virus qui font reproduire ou ne pas reproduire mal dans les systèmes de culture cellulaire. Ces deux outils ont démontré que de nombreux types de virus sont présents dans les eaux environnementales et de boire à travers le monde 1-6. Leur utilisation couplée avec le séquençage des fragments génomiques amplifiés au cours des maladies enquêtes épidémiologiques a fourni des preuves pour la transmission du virus d&#39;origine hydrique, comme ils l&#39;ont montré que le virus trouvé dans l&#39;eau potable est identique à celui versé par les patients sur les éclosions 7-10. Les deux qPCR RT-qPCR et sont des outils utiles pour la santé publique. Par exemple, les données provenant d&#39;études menées par l&#39;Environmental Protection Agency (EPA) ont montré une forte relation soitindicateur mesures interpolation en qPCR et effets sur la santé dans les eaux récréatives. En conséquence, finales 2012 Critères de qualité des eaux de baignade de l&#39;EPA comprend une méthode qPCR pour la surveillance des plages de loisirs 11,12. Borchardt et ses collègues ont également constaté une forte relation entre la gastro-entérite aiguë dans les communautés en utilisant l&#39;eau souterraine non traitée et le virus dans les eaux souterraines, telle que mesurée par RT-qPCR 1. Le but de cet article est de décrire la composante test moléculaire de la méthode EPA 1,615 13,14. Ce test utilise RT-qPCR de fournir une estimation quantitative des entérovirus et des copies génomiques norovirus (GC) par litre sur la base du volume initial de l&#39;eau potable ou l&#39;environnement passé à travers un filtre électropositive. Un aperçu de la procédure moléculaire est montré dans la figure l&#39;article 1. Protocole 1 détaille les procédures pour la préparation de la courbe standard. Ces normes sont préparés à partir d&#39;un réactif qui contient un RNUne copie de la séquence cible pour tous les ensembles amorce / sonde. La section 2 décrit la procédure de concentration tertiaire. Section 3 donne une méthode d&#39;extraction d&#39;ARN à partir des échantillons d&#39;eau et de contrôle concentrées. L&#39;ARN de chaque échantillon de test est une transcription inverse en utilisant des essais en triple et des amorces aléatoires pour amorcer la transcription (section 4). L&#39;ADNc à partir de chaque réaction de transcription inverse est divisé en cinq dosages spécifiques du virus distincts qui sont analysés en triple par qPCR (section 5; figure 2). Le dosage utilise des amorces et des sondes à partir de la littérature scientifique (Tableau 1) qui sont conçus pour détecter de nombreux entérovirus et norovirus et un réactif contenant de l&#39;ARN de l&#39;hépatite G pour identifier les échantillons d&#39;essai qui sont des inhibiteurs de RT-qPCR 15.

<table><tbody><tr><td>Chambre tubulaire de 1,5 ml</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-3000</td><td></td></tr><tr><td>1 &deg ; C cool brick</td><td>Diversified Biotech</td><td>BRIK-2501</td><td></td></tr><tr><td>10x tampon PCR II et 25 mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>N8080130-20</td><td></td></tr> <tr><td>&deg ; C congélateur</td><td>VWR</td><td>97043-346</td><td>Doit être un congélateur à dégivrage manuel-70</td></tr> <tr><td>&deg ; C ou plus froid Thermo</td><td>Scientific</td><td>MBF700LSAO-E</td><td></td></tr><tr><td>Chambre à 96 puits</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-1000</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol absolu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>ARN blindé EPA-1615</td><td>Asuragen</td><td>Commande personnalisée</td><td>Utilisé pour quantifier le test RT-qPCR</td></tr><tr><td>ARN blindé Virus de l’hépatite G</td><td>Asuragen</td><td>42024</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab Series</td><td></td></tr><tr><td>Armoire de biosécurité</td><td>NuAir Approvisionnement en équipement de laboratoire</td><td>Labgard 437 ES</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Affymetrix</td><td>10856</td><td>Qualité cristalline ou supérieure</td></tr><tr><td>Tampon AVE</td><td>Qiagen Qiagen</td><td>1026956</td><td>Tampon de dilution de l’ARN porteur</td></tr><tr><td>Tampon AVL</td><td>Qiagen</td><td>19073</td><td>Extraction </td></tr><tr><td>tampon ARN porteur</td><td>Qiagen</td><td>Sans objet Utiliser</td><td>l’ARN porteur fourni avec le tampon AVL</td></tr><tr><td>Flacons de centrifugeuse</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-562-23 ou 05-562-26</td><td></td></tr><tr><td>Rotors de centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>339080, 336380</td><td></td></tr><tr><td>Coffre-fort réfrigérant</td><td>Diversified Biotech</td><td>CSF-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Promega</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler&reg ; 480 Probes Master kit</td><td>Roche Diagnostics</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifuger</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td>Utiliser des tubes sans ribonucléase ni désoxyribonucléase avec bouchons à pression</td></tr><tr><td>Microcide III</td><td>Fitzgerald</td><td>99R-103</td><td></td></tr><tr><td>Film Microseal 'A'</td><td>Bio-Rad</td><td>Laboratories HSA5001</td><td>Heat </td></tr><tr><td>film Microseal 'F'</td> résistant <td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSA1001</td><td>Résistant au congélateur</td></tr><tr><td>Mini-plaque fileuse</td><td>Labnet International</td><td>MPS1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipette multicanaux</td><td>Rainin</td><td>L8-20</td><td></td></tr><tr><td>Chambre multitube</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-5000</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de réaction optique</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>4314320</tr><tr><td>Mélange de nucléotides PCR</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td></td></tr><tr><td>Plaque PCR</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSS9601</td><td></td></tr><tr><td>Eau de qualité PCR</td><td>Roche</td><td>3315932001</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>U.S. Biological</td><td>D9820</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur à plaques</td><td>Scientific Industries</td><td>MicroPlate Genie</td><td></td></tr><tr><td>Prionex gélatine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0411</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Comprend les tampons AW1 (premier tampon de lavage), AW2 (deuxième tampon de lavage), AE (tampon d’élution) ; l’éthanol doit être ajouté aux tampons AW1 et AW2 avant utilisation ; Ne pas utiliser le tampon AL fourni avec le kit</td></tr><tr><td>Thermocycleur PCR quantitatif</td><td>Life Technologies</td><td>4351405</td><td></td></tr><tr><td>Amorce aléatoire</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir de réactifs</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-381-27E</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée</td><td>Beckman Coulter</td><td>367501</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de RNase</td><td>Promega</td><td>N2515 ou N2615</td><td></td></tr><tr><td>Colorant de référence ROX Life</td><td>Technologies</td><td>12223</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II ou III Transcriptase inverse</td><td>Life Technologies</td><td>18064-022 ou 18080044</td><td></td></tr><tr><td>Gants chirurgicaux</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-058-800</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Life Technologies</td><td>4314879</td><td></td></tr><tr><td>base Trisma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateurs centrifuges Vivaspin 20</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>VS2022</td><td></td></tr></tbody></table>

méthode epa 1615. mesure des entérovirus et norovirus présence dans l&#39;eau par la culture et rt-qpcr. partie iii. détection de virus par rt-qpcr

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

La méthode 1615 de l’EPA mesure les entérovirus et les norovirus présents dans l’environnement et les eaux potables. Cette méthode a été élaborée dans le but d’avoir une méthode normalisée à utiliser dans plusieurs laboratoires d’analyse pendant la période de surveillance 3 de la règle de surveillance des contaminants non réglementés. Nous présentons ici le protocole d’extraction de l’acide ribonucléique viral (ARN) à partir de concentrés d’échantillons d’eau et de mesure quantitative des concentrations d’entérovirus et de norovirus à l’aide de la PCR quantitative par transcription inverse (RT-qPCR). Les concentrations virales pour le test moléculaire sont calculées en termes de copies génomiques d’ARN viral par litre sur la base d’une courbe standard. La méthode utilise un certain nombre de contrôles de la qualité pour améliorer la qualité des données et réduire les variations entre les laboratoires et les laboratoires entiers. La méthode a été évaluée en examinant la récupération du virus à partir d’eaux souterraines et de réactifs ensemencées de poliovirus de type 3 et de norovirus murins comme substitut des norovirus humains. Le taux moyen de guérison du poliovirus était de 20 % dans les eaux souterraines et de 44 % dans l’eau de qualité réactif. Le taux moyen de récupération des norovirus murins avec le test RT-qPCR était de 30 % dans les eaux souterraines et de 4 % dans l’eau de qualité réactif.

Nous présentons ici une procédure de quantification des entérovirus et des norovirus dans les eaux environnementales et potables à l’aide de la transcription inverse-PCR quantitative. Le taux moyen de récupération du virus dans les eaux souterraines avec cette procédure normalisée de la méthode 1615 de l’EPA était de 20 % pour le poliovirus et de 30 % pour le norovirus murin.

Méthode EPA 1615. Mesure des entérovirus et Norovirus présence dans l&#39;eau par la culture et RT-qPCR. Partie III. Détection de virus par RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer la concentration d'entérovirus et de norovirus dans l'eau, en utilisant une réaction de polymérisation en chaîne quantitative par transcription inverse. Cela est réalisé par une concentration tertiaire de particules virales à partir d'échantillons d'eau concentrés, au moyen d'une ultrafiltration centrifuge. Ensuite, les réactifs de la courbe standard sont préparés comme décrit dans le protocole. Puis, l'extraction des acides nucléiques est effectuée à partir des concentrés viraux et de la courbe standard. Ensuite, l'ARN viral, dilué d'un facteur de un à cinq et d'un à vingt-cinq, est rétrotranscrit à l'aide d'amorces aléatoires et de la transcriptase inverse. Enfin, l'amplification de l'ADN complémentaire viral est réalisée à l'aide d'amorces et de sondes spécifiques au virus dans un thermocycleur en temps réel, suivie du calcul du nombre de copies génomiques des échantillons à partir de la courbe standard.Le principal avantage de la méthode EPA 1615 par rapport à d'autres méthodes normalisées comme l'ISO 15216 est qu'elle est spécifiquement conçue pour les échantillons d'eau et inclut un dosage des entérovirus. Cette méthode peut fournir aux évaluateurs des risques dans le domaine de la microbiologie environnementale l'état actuel des connaissances sur la détermination du risque lié aux virus présents dans les eaux potables et de loisirs. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés avec la standardisation intégrée à la procédure. La méthode est très détaillée et doit être suivie scrupuleusement. La démonstration visuelle de la méthode est essentielle, car même de légères variations peuvent entraîner des conséquences négatives. Pour la démonstration d'aujourd'hui, voici Nichole Brinkman, Jennifer Cashdollar, Shannon Griffin et moi-même, Shay Fout. Nous sommes tous membres du personnel qualifié du laboratoire national de recherche sur l'exposition de l'EPA à Cincinnati, Ohio. Après avoir préparé une courbe standard conformément au protocole indiqué dans le texte, préparez un concentrateur centrifuge pour chaque échantillon recueilli en ajoutant au moins 10 millilitres de PBS 1X et 2 % de BSA dans la chambre supérieure d'échantillonnage. Après une incubation nocturne, un lavage, puis l'ajout des échantillons comme décrit dans le protocole du texte, centrifuger chaque échantillon test dans un rotor à godets oscillants à 3000 à 6000 ×g et à quatre degrés Celsius pendant vingt à trente minutes.Une fois l'échantillon convenablement concentré et transféré dans un nouveau tube de microcentrifugeuse, ajouter du tampon phosphate de sodium 0,15 molaire pour ajuster le volume final à 400 microlitres plus ou moins deux microlitres. Pour extraire les acides nucléiques, ajouter 200 microlitres de tampon d'extraction pour un contrôle négatif d'extraction et 200 microlitres du concentré tertiaire pour chaque échantillon test ou dilution de la courbe standard, dans des tubes de microcentrifugeuse séparés, puis extraire l'ARN selon les modifications indiquées dans le protocole écrit des instructions du fabricant du kit d'extraction. Après avoir préparé les amorces et les sondes comme décrit dans le protocole, préparer les mélanges maîtres de transcription inverse un et deux dans une salle propre, comme indiqué ici.À l’aide d’une pipette multicanal, transférez 16,5 microlitres du mélange maître de RT1 dans les puits de chaque plaque PCR. Ensuite, à l’aide du tampon d’élution du kit d’extraction des acides nucléiques contenant 400 unités par millilitre d’inhibiteur de RNase, diluez le matrice d’échantillons de terrain et de laboratoire enrichis ou les échantillons LSFM au 1/5 et au 1/25. Transférez 6,7 microlitres des acides nucléiques provenant de chaque échantillon test, témoin et courbe étalon dans des puits distincts de la plaque PCR, en utilisant des puits en triple pour les échantillons test et les témoins, et des puits en double pour les courbes étalons.Ajoutez 6,7 microlitres de tampon d'élution dans les puits de contrôle sans matrice ou puits NTC. Incluez deux à huit NTC par plaque de RT, en utilisant deux pour le premier échantillon, puis deux ou plus tous les quatre échantillons supplémentaires, en répartissant les contrôles négatifs sur l'ensemble de la plaque. Utilisez le scellant de plaque résistant à la chaleur pour sceller la plaque PCR, en vous assurant que chaque puits est hermétiquement fermé. Ensuite, mélangez les échantillons pendant cinq à dix secondes avant de centrifuger brièvement à une force supérieure ou égale à 500 ×g.Dans un thermocycleur, incubez la plaque à 99 degrés Celsius pendant quatre minutes. Portez la plaque à quatre degrés Celsius, puis centrifugez brièvement une deuxième fois. Ensuite, retirez soigneusement le scellé de la plaque et ajoutez 16,8 microlitres du mélange maître RT2 dans chaque puits. Après avoir scellé la plaque et effectué un mélange et une centrifugation brefs, placez la plaque dans le thermocycleur et exécutez le programme suivant : 25 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis 42 degrés Celsius pendant 60 minutes, 99 degrés Celsius pendant cinq minutes, et enfin, maintenez à 4 degrés Celsius jusqu'à huit heures ou conservez les échantillons à moins 70 degrés Celsius pour une période plus longue.Dans une salle propre, préparez des mélanges maîtres de PCR quantitative en utilisant les guides pour l'entérovirus, le norovirus du génotype I, le norovirus du génotype II et l'hépatite G. Mélangez chaque mélange maître et centrifugez brièvement. Ensuite, comme illustré dans cet exemple, ajoutez 14 microlitres des mélanges maîtres de PCR dans les puits appropriés d'une plaque optique réactionnelle étiquetée, en utilisant des plaques séparées pour chaque test de qPCR. Distribuez six microlitres de l'ADNc approprié dans les puits correspondants. Puis mélangez les échantillons et centrifugez brièvement.Configurer le logiciel du thermocycleur comme décrit dans le protocole et effectuer le test de qPCR du virus G de l'hépatite sur la matrice d'échantillons de terrain et de laboratoire fortifiés non dilués et dilués, ou sur les échantillons LFSM, avant d'effectuer tous les autres tests de qPCR. Comparer la valeur Cq moyenne de chaque échantillon à la valeur Cq moyenne prédéterminée du virus G de l'hépatite pour chaque nouveau lot de réactif du virus G de l'hépatite. Utiliser la dilution la plus faible de l'échantillon de terrain ou de LDF dont la valeur est inférieure d'une unité Cq à la valeur Cq moyenne du virus G de l'hépatite pour les tests de qPCR des entérovirus et des norovirus.Configurer le logiciel du thermocycleur de PCR quantitative conformément aux instructions du fabricant. Identifier les échantillons de la courbe standard comme étant des étalons et, pour chaque dilution de la courbe standard, saisir les valeurs de copies génomiques indiquées ici. Exécuter la plaque à 95 degrés Celsius pendant dix minutes, suivies de 45 cycles de 15 secondes à 90 degrés Celsius et d'une minute à 60 degrés Celsius.Déterminez si chaque courbe standard répond aux valeurs acceptables indiquées dans ce tableau. Après avoir calculé l'écart type, la pente, le coefficient de détermination R² et le pourcentage d'efficacité selon les équations décrites dans le protocole, enregistrez les valeurs de copies génomiques ou GC calculées par le logiciel du thermocycleur pour tous les échantillons testés, en vous basant sur les courbes standard qui satisfont aux critères précisés dans ce tableau, ainsi que les valeurs moyennes de GC pour chaque échantillon. Déterminez le nombre de GC par litre pour chaque échantillon testé à l'aide de l'équation suivante, où GC représente le nombre moyen de copies génomiques précédemment calculé.Le facteur 199 est le facteur de dilution total pour les réactions volumétriques qui ont eu lieu lors des concentrations tertiaires, de l'extraction de l'ARN et des étapes de RT-qPCR. DF est le facteur de dilution qui compense l'inhibition et D est le volume de l'échantillon d'eau d'origine analysé, en litres.Enfin, calculez le rendement global de la matrice de contrôle enrichie en laboratoire (LFB) ou du blanc de réactif de laboratoire (LRB) en multipliant la valeur moyenne de rendement précédemment déterminée par 199, puis en divisant par 0,3. Dans l'ensemble, la récupération du virus a été déterminée à l'aide d'échantillons appariés de terrain LFSM d'eaux souterraines provenant au total de sept séries d'échantillons récupérés dans trois usines publiques de traitement et un puits privé. Les niveaux d'inoculation pour les échantillons LFSM étaient de trois millions de MPN de poliovirus de type trois et de cinq millions de PFU de norovirus murin.Le norovirus murin a été utilisé pour l'évaluation initiale en laboratoire unique de la méthode EPA 1615, car le réactif de la courbe standard n'était pas disponible à ce moment-là. Pour les échantillons d'eau souterraine, le taux de récupération moyen du poliovirus était de 20 % avec une erreur standard de 2 %, tandis que le taux de récupération moyen du norovirus murin était de 30 % avec une erreur standard de 3 %. L'échantillon régulier d'eau souterraine sur le terrain pour chaque LFSM ne présentait aucune détection d'entérovirus ou de norovirus. Les échantillons de blanc enrichi en laboratoire (LFB) ou de blanc de réactif en laboratoire (LRB) ont été mesurés à l'aide d'eau de qualité réactif ensemencée et non ensemencée.Le taux de récupération du poliovirus a été en moyenne de 44 % avec une erreur standard de 1 %, tandis que celui du norovirus murin a atteint en moyenne 4 % avec une erreur standard de 0,5 %. Ce graphique présente les courbes standards typiques pour l'entérovirus et le norovirus du génotype deux. La courbe du norovirus du génotype deux satisfait aux critères de la courbe standard avec une valeur R² de 0,9987, un écart-type global de 0,14 et une efficacité de 101 %. La courbe de l'entérovirus remplit les critères de performance de la courbe standard avec une valeur R² de 0,9874, un écart-type global de 0,58 et une efficacité de 103 %, mais elle présente une sensibilité environ 100 fois inférieure, et donc une limite de détection plus élevée que les courbes du norovirus.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment concentrer et détecter les entérovirus et norovirus présents dans l'eau à l'aide de la RT-qPCR. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ huit heures pour des échantillons à faible turbidité. Pour les échantillons présentant une turbidité plus élevée, un temps supplémentaire peut être nécessaire, en particulier lors de l'étape de concentration tertiaire.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de protéger les échantillons contre la contamination par les RNases avant la transcription inverse. N'oubliez pas que la PCR est une technique très puissante et utile. Des précautions telles que la séparation des postes de travail et l'utilisation de contrôles appropriés sont nécessaires afin de minimiser les résultats faussement positifs et faussement négatifs.

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Un One-Step RT-PCR pour la détection et l'identification génogroupe des isolats de norovirus dans les selles des enfants, qui utilise des amorces et des sondes TaqMan spécifiques au cadre de lecture ouvert 1 (ORF1)-ORF2 région de jonction, la région la plus conservée du génome de Norovirus est décrit. Un non-commerciale, rentable méthode d'extraction d'ARN est détaillé.

Détection et Genogrouping des norovirus dans les selles des enfants en Taqman en une seule étape de RT-PCR

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

La méthode EPA 1615 utilise un filtre électropositif pour concentrer les entérovirus et les norovirus dans l’environnement et les eaux potables. Ce manuscrit décrit la procédure de collecte d’échantillons pour les analyses de la méthode 1615.

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Nous présentons ici une procédure pour mesurer le nombre total de virus cultivables à l’aide de la lignée cellulaire rénale du singe vert de buffle. La procédure fournit un outil normalisé pour mesurer la présence de virus infectieux dans l’environnement et les eaux potables.

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Une méthodologie d’échantillonnage basée sur la macromousse a été développée et évaluée pour la détection et la quantification des norovirus sur les surfaces dures de l’environnement.

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Une approche a été développée pour identifier les conditions optimales de concentration virale pour des échantillons d’eau de petit volume à l’aide de pointes d’adénovirus humains. Les techniques décrites ici sont utilisées pour identifier les paramètres de concentration d’autres cibles virales et appliquées à l’expérimentation de concentration virale à grande échelle.

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l’eau de saignement de production (PBW) a été traitée avec des nanoparticules d’oxyde cuivrique (CuO-NPs) et la toxicité cellulaire a été évaluée dans des cellules humaines en culture. L’objectif de ce protocole était d’intégrer l’échantillon environnemental natif dans un format de culture cellulaire évaluant les changements de toxicité dus au traitement CuO-NP.

Suppression des éléments traces par Cupric nanoparticules d&#39;oxyde de Uranium<em&gt; In Situ</em&gt; Récupération de l&#39;eau de ressuage et son effet sur la viabilité cellulaire

Nous présentons le VacuSIP, une méthode simple, non intrusive et fiable pour un échantillonnage ponctuel propre et précis de l’eau. Le système a été mis au point et évalué pour la collecte simultanée de l’eau inhalée et expirée par les suspensions benthiques in situ, afin de mesurer proprement l’élimination et l’excrétion des composés particulaires et dissous.

VACUSIP, une méthode Inex améliorée pour<em&gt; In Situ</em&gt; Mesure des particules et composés dissous transformés par suspensivores actifs

Ce protocole diagnostique Tilapia lac Virus (TiLV) dans les tissus de tilapia à l’aide de méthodes de RT-PCR. L’ensemble de la méthode est décrite de la dissection des tissus à l’extraction d’ARN totale, suivie de la synthèse de cDNA et détection de TiLV par PCR classique ou PCR quantitative à l’aide d’ADN double brin contraignant un colorant fluorescent obligatoire.

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Une conception de microplots pour la recherche sur les traceurs de 15N est décrite pour tenir compte de multiples événements d’échantillonnage des plantes et des sols en saison. Des procédures de collecte et de traitement des échantillons de sol et d’usine, y compris les protocoles de broyage et de pesage, pour l’analyse de 15N sont mises de l’avant.

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Découvrez la méthode EPA 1615 pour quantifier les entérovirus et norovirus dans l'eau par RT-qPCR. Cette technique utilise l'ultrafiltration centrifuge et la PCR en temps réel pour surveiller la qualité microbiologique des eaux.

Méthode EPA 1615. Mesure des entérovirus et Norovirus présence dans leau par la culture et RT-qPCR. Partie III. Détection de virus par RT-qPCR (Vidéo) | JoVE Journal

Méthode EPA 1615. Mesure des entérovirus et Norovirus présence dans l'eau par la culture et RT-qPCR. Partie III. Détection de virus par RT-qPCR

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