Un pipeline rapide et fiable pour l'étude de cas analyse bactérienne transcriptome: Serine dépendant régulation des gènes dans Streptococcus pneumoniae

L’objectif général de cette procédure est de fournir une vue d’ensemble des changements transcriptomiques chez les bactéries subis dans une condition spécifique. Ceci est accompli en cultivant et en récoltant d’abord des cellules bactériennes dans des conditions spécifiques. Ensuite, l’ARN total est isolé à partir des cellules récoltées et l’ADNC est fabriqué à partir de l’ARN.

Ensuite, les CDNA sont marqués et hybridés avec des lames de micro-dosage fabriquées en interne. Enfin, la lame est lavée, après quoi les lames sont numérisées et analysées. En fin de compte, la puce est utilisée pour montrer les changements transcriptomiques dans les cellules bactériennes dans des conditions spécifiques.

Le principal avantage de la technologie des microréseaux d’ADN par rapport aux autres méthodes existantes d’étude de l’expression génique, comme la QPCR ou le transfert de Northern, est qu’elle fournit une vue d’ensemble de tous les changements transcriptomiques subis dans une condition spécifique. Il est rapide, fiable et relativement bon marché. Mohammed Sal et Airon Manzu, étudiants PSD de mon laboratoire en génétique moléculaire, feront la démonstration de la procédure Après la décongélation, les granules de cellules s s pmo, ED 39 et Resus en suspension dans 400 microlitres de te selon le protocole de texte, préparez ce qui suit dans des tubes à bouchon à vis sans ARN, 0,5 gramme de billes de verre, 50 microlitres de 10 % SDS 500 microlitres de phénol chloroforme préalablement préparés et les pastilles cellulaires en suspension.

Pour briser les cellules, placez les tubes dans un batteur à billes et homogénéisez-les deux fois pendant 60 secondes, chacun les plaçant sur de la glace pendant une minute entre les impulsions, puis centrifugez les échantillons à 10 000 G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Transférez la phase supérieure dans un tube frais, et à 500 microlitres de chloroforme i a, a et centrifugez pendant cinq minutes supplémentaires. Pipette de 500 microlitres de la phase supérieure vers des tubes frais.

Ajouter deux volumes de tampon de liaison à la lyse et mélanger par pipetage de haut en bas. Ensuite, à l’aide d’un kit d’isolement d’ARN, isolez l’ARN total en suivant le protocole du fabricant pour éliminer l’ADN contaminant de l’ARN. Ajoutez 100 microlitres de Da et incubez à 15 à 25 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes.

Utilisez le kit de l’ARN pour laver l’ARN nettoyé et l’élué dans un volume de 50 microlitres afin d’effectuer la réaction d’agenouillement dans des tubes PCR de 300 microlitres. Mélangez l’ARN total avec deux microlitres de monomères aléatoires et utilisez de l’eau sans nucléases si nécessaire pour porter le volume à 18 microlitres. Incuber le mélange à genoux à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ensuite, refroidissez les réactions à température ambiante pendant 10 minutes et faites-les tourner rapidement avant de placer les tubes sur de la glace pendant au moins une minute. Pour transcrire inverser CDNA, préparez le mélange de transcription inverse, combinez 18 microlitres du mélange avec 12 microlitres de mélange principal et incubez la réaction à 42 degrés Celsius pendant deux à 16 heures. Dégradez l’ARNm de la réaction en ajoutant trois microlitres de 2,5 molaires et un OH et placez-le à 37 degrés Celsius pendant environ 15 minutes.

Ajoutez ensuite 15 microlitres d’acide libre à deux tas molaires pour neutraliser le NAOH. Ensuite, après avoir utilisé des colonnes de nettoyage PCR pour purifier l’ADNC à l’aide d’un spectrophotomètre, mesurez la concentration d’ADNC pour marquer l’ADNC. Ajoutez cinq microlitres d’un colorant réactif moyen à 20 à 60 nanogrammes par microlitre d’ADN.

Placez le mélange à température ambiante sombre et incubée pendant 60 à 90 minutes avant d’utiliser les colonnes de nettoyage PR pour purifier le colorant marqué CDNA en éludant dans 50 microlitres de tampon d’évolution avec un spectrophotomètre, assurez-vous que la concentration de CDNA marqué est d’au moins 0,5 pico moles par microlitre dans un volume total de 50 microlitres. Après avoir préparé un tampon timide, selon le protocole de texte, préchauffez le tampon à 68 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Pour préparer l’échantillon, combinez des quantités égales de CDNA marqués, puis utilisez des concentrateurs sous vide à haute température pour réduire le volume à sept microlitres ou moins.

Pendant ce temps, pour nettoyer les lamelles de levage afin de réduire le signal de fond, utilisez du savon et beaucoup d’eau du robinet, puis de l’éthanol à 100 % après avoir séché les lamelles de levage, placez-en une sur une glissière avec la doublure en téflon blanc vers le bas. Ensuite, dissolvez les échantillons de colorant séché dans sept microlitres de H2O et incubez à 94 degrés Celsius pendant deux minutes. Ajoutez immédiatement 35 microlitres de tampon timide préchauffé, mélangez doucement et essorez à vitesse maximale pendant une minute.

Pour les précipités de granulés, préchauffez la sonde à 68 degrés Celsius pendant environ cinq minutes avant de la charger. Pour assembler la glissière et la glissière de levage, placez le support de glissière d’hybridation sur un bloc chauffant à 50 degrés Celsius. Placez les lames de microréseau d’ADN avec la lamelle de levage sur le support de lame d’hybridation chauffé et préchauffez la diapositive avec la lamelle de levage pendant une minute.

Ensuite, le plus rapidement possible, ajoutez 40 microlitres de la cible d’échantillon à la fin de la lame. Permettez au fluide de s’écouler entre les surfaces vitrées par capillarité. Retirez maintenant la cassette d’hybridation de préchauffage du four d’hybridation et fermez la machine.

Placez ensuite du papier filtre imbibé de trois millilitres de deux XSSC dans la cassette d’hybridation. Placez délicatement le support de diapositives d’hybridation avec les lames dans la cassette d’hybridation. Fermez la cassette d’hybridation et remettez-la dans le four d’hybridation et incubez pendant 16 à 18 heures.

Pour laver les lames, préparez de nouveaux tampons de lavage un, deux et trois, et placez-les à 30 degrés Celsius. Pour vous assurer que le SDS se dissout une fois l’incubation terminée, immergez doucement les lames le plus rapidement possible dans un tube Falcon rempli de 50 millilitres de tampon de lavage, jusqu’à ce que le verre repose au fond du tube. Une fois que le lève-personne a glissé, s’enfonce au fond du tube sans rayer le réseau, utilisez une pince à épiler pour retirer la glissière et placez-la dans le rack de la station de lavage.

Utilisez immédiatement 500 millilitres de tampon de lavage pour laver les lames pendant cinq minutes. Transférez ensuite les lames dans le tampon de lavage deux pendant 20 à 30 minutes avant de les transférer dans 500 millilitres de tampon de lavage trois pendant cinq minutes. Enfin, séchez les lames à 2000 tr/min pendant deux minutes avant d’effectuer l’analyse des microréseaux.

Selon le protocole textuel pour étudier l’impact de la L serine sur l’ensemble du transcriptome de la pneumonie à S, l’analyse de la souche D 39 de type sauvage de la souche D 39 cultivée dans le CDM avec 150 micromolaires de L Seine, par rapport à celle cultivée dans 10 millimolaires de l Seine dans le même milieu a été effectuée. Ce tableau répertorie les concentrations d’ARN total isolé de chaque culture, comme le montre cette figure. Après avoir retiré l’ADN, la qualité de l’ARN a été examinée.

Ces deux voies représentent l’ARN de 150 micromolaires de senne, et ces deux voies proviennent de cultures cultivées avec 10 millimolaires de senne. La présence de deux bandes claires indique un ARN de bonne qualité. Les concentrations de CDNA synthétisé à partir de l’ARN total sont enregistrées dans cette colonne et la moyenne des échantillons marqués au colorant réactif AM est répertoriée ici.

Cette figure présente une analyse par nuage de points du rapport moyen des matrices réactives de la FA, et les données ont été analysées plus en détail pour réduire le bruit. Ce tableau résume les résultats des études sur les microréseaux après l’application des critères de différence supérieure ou égale à deux et à une valeur P inférieure à 0,001. Comme on le voit ici, un certain nombre de gènes ont été exprimés différemment en présence d’un minimum de L sérine par rapport au maximum Après cette procédure.

D’autres méthodes telles que le beag, les tests d’électrocytes, le QPCR, le knockout et/ou la force d’expression peuvent être utilisées afin de répondre aux questions à venir après son développement. Cette technique a permis aux chercheurs VFR dans le domaine de la biologie moléculaire et cellulaire d’explorer les réseaux et les mécanismes de régulation de la RAM positive.