Génération de microparticules lymphocytaire et détection de leur effet pro-apoptotique sur les cellules épithéliales des voies aériennes

L’objectif général de cette procédure est d’illustrer la production in vitro de microparticules lymphocytaires ou LMP à partir d’une lignée cellulaire de lymphocytes T, et de démontrer leur effet pro-apoptotique sur les cellules épithéliales des voies respiratoires. Ceci est accompli en produisant d’abord les LMP. Ensuite, les PMT isolés sont caractérisés par l’analyse par télécopie.

Ensuite, les explants de tissu bronchique sont cultivés. Enfin, un traitement LMP sur explants bronchiques est effectué. En fin de compte, des examens histopathologiques tels que l’hémat, la toïne et l’éosine et la détection de la mort cellulaire à deux cellules NC sont utilisés pour montrer les lésions de la couche épithéliale bronchique induites par LMP et l’apoptose des cellules épithéliales.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’isolement des microparticules du sang périphérique humain est que nous sommes en mesure d’effectuer la génération à grande échelle de microparticules dérivées d’une lignée cellulaire à action in vitro. Généralement, les personnes novices dans cette méthode auront du mal car les étapes critiques de la culture explan de la bronchie ne sont pas faciles à préparer. Pour commencer la culture.

Les cellules CEMT sont réparties dans quatre flacons T 1 75 contenant chacun 150 millilitres de cellules fraîches, moyennes et incubées à 37 degrés Celsius jusqu’à une densité de 2 millions de cellules par millilitre. Recueillir les cellules de chaque fiole par centrifugation à 200 fois G pendant cinq minutes, puis les plier 300 fois 10 à six cellules en une nouvelle fiole T 1 75 contenant 150 millilitres de milieu frais. Pour maintenir la densité de 2 millions de cellules par millilitre, ajoutez 37,5 microlitres de mycine D d’actine au milieu à une concentration finale de 0,5 microgramme par millilitre et incubez à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

Transférez tout le milieu de culture dans des tubes coniques de 50 millilitres et faites tourner les cellules à 750 fois G pendant cinq minutes. Transférez ensuite le surnageant dans des tubes coniques de 50 millilitres et centrifugez-le à 1500 fois G pendant 15 minutes pour éliminer les gros fragments cellulaires. Ensuite, transférez le surnageant dans une bouteille de 250 millilitres et une ultra-centrifugeuse à 12 000 fois G pendant 50 minutes.

Ensuite, jetez le surnageant et récupérez les granulés. Utilisez 40 millilitres de PBS stérile pour laver les granulés enrichis en LMP dans un tube de 50 millilitres et centrifugez-les à 12 000 fois G pendant 50 minutes. Répétez cette étape deux fois.

Récupérez le surnageant du dernier lavage pour l’utiliser comme contrôle du véhicule avec un millilitre de PBS. Suspendez les granules et transférez-les dans une aliquote de microtube stérile de 1,5 millilitre et stockez les LMP isolés à moins 80 degrés Celsius. Pour caractériser les microparticules par analyse par télécopieur, commencez par préparer deux échantillons d’un tampon nexin, l’un avec du chlorure de calcium et l’autre sans calcium.

Dans un tube de fax, diluez un microlitre de LMP dans 44 microlitres d’un tampon nexin avec du chlorure de calcium. Préparez un autre tube à l’aide d’un tampon nexin sans chlorure de calcium. Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’un X et d’un V sci cinq dans chaque tube et mélangez bien incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 minutes.

Après l’incubation, utilisez 400 microlitres de liquide de gaine antigrippale. Pour arrêter les réactions, ajoutez 10 microlitres de billes de sept microns en suspension comme étalon interne dans chaque tube. Pour obtenir un comptage absolu, établissez des portes de taille relative, de FSCH et de granularité relative SSCH et un diagramme à points sur le cytomètre en flux.

En utilisant des billes fluorescentes calibrées d’un micromètre pour la première porte et en comptant les perles à sept micromètres. Pour la deuxième porte, analyser l’échantillon LMP sur un graphique F-S-C-H-S-S-C-H en utilisant les portes établies et le canal FL quatre pour le graphique à points d’annexine en acquérant un signal jusqu’à ce que 10 000 billes de comptage soient atteintes dans la marche deux, déterminer les événements positifs dans ex NV des LMP dans le tampon nexin contenant du chlorure de calcium et soustraire les événements LMP dans le tampon nexin sans chlorure de calcium. Calculez le nombre absolu de PMT à l’aide de l’équation suivante.

Utilise un scalpel Dumont, une pince à épiler super fine et des ciseaux chirurgicaux pour disséquer aseptiquement le tissu pulmonaire. Retirez délicatement le parenchyme et les vaisseaux sanguins. Disséquez davantage la bronche immergée dans le milieu de lavage des tissus et séparez les bronches d’un diamètre de un à 2,5 millimètres des tissus pulmonaires périphériques.

À l’aide d’un scalpel, coupez les tissus bronchiques en rangs bronchiques d’environ cinq millimètres d’épaisseur à l’aide d’un mouvement de ramassage à l’aide de la micro-pince à dissection stérile incurvée. Ramassez les fragments bronchiques et placez-les sur les zones rayées des plats préalablement préparés. Selon le protocole textuel, retirez le produit de lavage des tissus et incubez les fragments à température ambiante pendant environ cinq minutes pour leur permettre d’adhérer à la vaisselle.

Ajoutez 10 millilitres de milieu de cicatrisation complet dans chaque plat et placez-les dans une chambre d’incubation modulaire à atmosphère contrôlée avec un mélange gazeux à haute teneur en oxygène, rincez la chambre, puis placez-la dans un incubateur orbital de paillasse et secouez-la à 37 degrés Celsius pendant 24 heures à raison de 10 cycles par minute pour permettre au milieu de s’écouler par intermittence sur les fragments. Après l’incubation, observez l’explan tissulaire au microscope à contraste de phase et à lumière inversée. Sélectionnez l’explan bronchique avec un mouvement complet des cheveux fins et un épithélium bronchique vif pour un traitement ultérieur de la LMP.

Pour traiter les LMP, comptez l’explan bronchique qui vient d’être sélectionné et marquez chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits. Pour chaque explan, transférez 0,5 millilitre de milieu de culture complet dans un tube einor stérile. Ajoutez ensuite 25 microlitres de stock l et p par plan de traitement ou ajoutez 25 microlitres de véhicule de contrôle.

Pour le contrôle, les explants mélangent bien en tapotant doucement le tube. Transférez le milieu mélangé dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire marquée à 12 puits avec une micro-pince de dissection incurvée. Transférez chaque bronchique x explan sélectionné dans chaque puits de la plaque de culture tissulaire.

Poursuivre l’incubation dans une chambre d’incubation modulaire à atmosphère contrôlée à 37 degrés Celsius avec une légère agitation après 24 heures. Utilisez le PBS pour laver l’EXPLAN trois fois et procédez à la coloration de fixation h et e et au test tunnel. Selon le protocole textuel présenté ici, les LMP ont été caractérisés par une coloration nexin V par analyse par fax et contrôlés à l’aide de billes d’un micromètre où 97 % des mps étaient positifs à la science-fiction nexin V.

En règle générale, environ 2,5 milligrammes de LMP ont été obtenus en suivant ce protocole. Extrait de tissu bronchique de C 57 noir six souris ont été soumises à un traitement par véhicule et LMP. Dans cette figure, l’analyse histopathologique des coupes bronchiques révèle l’effet des LMP sur l’intégrité structurelle de l’épithélium bronchique.

En contrôle. Explication, l’épithélium bronchique était en grande partie intact. Cependant, dans les explants traités par LMP, la couche superficielle de cellules épithéliales a été endommagée ou perdue, et il y a eu des diminutions significatives de la hauteur et de la densité des cellules épithéliales, comme on le voit ici.

La coloration tunnel positive, un marqueur de l’apoptose, était plus prononcée dans l’épithélium bronchique traité par LMP par rapport au tissu témoin. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler dans des conditions stériles lors de la production de microparticules et de la réalisation d’une culture d’explan tissulaire.