Name: Génération de microparticules lymphocytaire et détection de leur effet pro-apoptotique sur les cellules épithéliales des voies aériennes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Découvrez la production de microparticules lymphocytaires à partir de lignées cellulaires T et leurs effets pro-apoptotiques sur les cellules épithéliales des voies aériennes. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes cellulaires impliqués.

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Ce travail est soutenu par des subventions des Instituts de recherche en santé (178 918), le Fonds de recherche en santé du Québec du Canada - Réseau de recherche sur la santé visuelle.

REMARQUE: Homme souris C57BL / 6 (ancienne 5-7 semaines) sont de Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Québec, Canada.) Et manipulés selon des protocoles approuvés par la Sainte-Justine Comité de protection des animaux CHU. Souris explants de tissus bronchiques constituent une bonne source de cellules épithéliales bronchiques primaires pour étudier les effets pro-apoptotiques de PMT sur les cellules épithéliales. Ce protocole décrit la génération in vitro de PMT, ainsi qu&#39;un procédé de détection de l&#39;apoptose des cellules épithéliales sur des explants de tissus bronchiques PMT-traités. Ce protocole se compose de trois sections. 1. PMT production et la caractérisation NOTE: Pour éviter la contamination, veiller à ce que tous les matériaux utilisés dans cette expérience sont stériles ou autoclavés. Effectuez toutes les étapes à la température ambiante dans une enceinte de sécurité biologique dans des conditions stériles, sauf indication contraire. 1.1) Stimulation et Collection des députés9 <ol><li> Décongeler une aliquote de 10 millions de cellules T CEM C dans un bain d&#39;eau à 37 °. Diluer à 10 ml préchauffé milieu hématopoïétique tels que X-VIVO, dans un tube stérile de 15 ml et centrifuger à 200 gx 5 min sans sérum. Aspirer les cellules surnageant et remettre en suspension dans 5 ml de milieu préchauffé. </li><li> des cellules de transfert dans un ballon de culture de tissu T75 (pour les cellules en suspension) à 15 ml de milieu hématopoïétique préchauffé tel que X-VIVO et incuber pendant 4 jours dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Après 4 jours, transférer la totalité du milieu de culture et les cellules dans un flacon de culture de tissu T175 contenant 100 ml de milieu frais. Continuer l&#39;incubation des cellules pendant environ 72 heures dans les mêmes conditions jusqu&#39;à ce qu&#39;ils aient atteint une densité de 2 millions de cellules / ml. </li><li> Cellules également réparti entre quatre flacons T175 contenant chacune 150 ml de milieu frais et continuer la culture de cellule jusqu&#39;à ce que les cellules se sont développées (environ 48 heures d&#39;incubation) à une densité de 2 millions / ml. </li><li&gt; Rassembler les cellules provenant de chaque flacon par centrifugation à 200 xg pendant 5 min et remettre en suspension 300 x 10 6 cellules dans un nouveau flacon T175 contenant 150 ml de milieu frais pour maintenir la densité de cellules de 2 millions / ml. </li><li> Ajouter actinomycine D (dissous dans du DMSO à 2 mg / ml) dans le milieu à une concentration finale de 0,5 ug / ml et incuber pendant 24 heures. </li><li> Transférer tout le milieu de culture dans 50 ml tubes coniques et centrifuger les cellules à 750 g pendant 5 min. Transférer le surnageant dans des tubes de 50 ml et centrifuger coniques à 1500 xg pendant 15 min pour éliminer les gros fragments de cellules. </li><li> Transférer le surnageant dans un flacon de 250 ml et par ultracentrifugation à 12 000 xg pendant 50 min. Jeter le surnageant et recueillir des pellets. </li><li> Pastilles de lavage PMT-PBS enrichi avec 40 ml stérile dans un tube de 50 ml par centrifugation à 12 000 xg pendant 50 min. Répéter deux fois cette étape. </li><li> Recueillir le dernier lavage surnageant; il sera utilisé en tant que contrôle du véhicule. Suspendre les pastilles dans une PMTml de PBS et de les transférer dans un microtube de 1,5 ml stérile. Aliquotes et stocker PMT isolés à -80 ° C (pour éviter de multiples cycles de libre-dégel). </li></ol> 1.2) Caractérisation des députés via Analyse FACS 4 <ol><li> Préparer deux échantillons de tampon annexine, une avec et l&#39;autre sans CaCl2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, plus ou moins 5 mM de CaCl2. </li><li> Filtrer tampon de FACS et l&#39;annexine fluide de gaine d&#39;écoulement en utilisant un filtre de 0,22 um pour éliminer les particules. </li><li> Diluer 1 ul de LMP dans 44 ul de tampon d&#39;annexine avec 5 mM de CaCl2 dans un tube FACS. Préparer un autre tube avec 1 pl de PMT dans 44 pi de tampon annexine sans CaCl 2 (contrôle négatif). </li><li> Ajouter 5 ul de AnnexinV-Cy5 dans chaque tube et bien mélanger. Incuber pendant 15 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. Arrêter la réaction en diluant le mélange avec 400 ul de liquide de gainage FACS d&#39;écoulement dans chaque tube. </li><li> Ajouter 10 pi (200 000 perles) de 7 um comptage beasuspension ds comme étalon interne dans chaque tube pour obtenir une numération absolue. </li><li> Établir portes de taille relative (FSC-H, PMT E00, échelle logarithmique) et la granularité relative (SSC-H, PMT 325, échelle logarithmique) intrigue point sur le cytomètre en flux en utilisant des billes fluorescentes taille calibrée de 1 pm (porte 1) et compter perles porte à 7 pm (porte 2). </li><li> Analyser l&#39;échantillon PMT sur FSC-H / SSC-H parcelle en utilisant les portes établies et FL-4 canaux pour annexine (PMT 765, échelle logarithmique) en points, en acquérant un signal jusqu&#39;à 20 000 billes de comptage sont atteints dans la porte 2. </li><li> Déterminer les événements AnnexinV positifs de PMT dans un tampon annexine contenant CaCl2, puis soustraire les événements de PMT dans un tampon de annexine sans CaCl 2 (contrôle négatif). </li><li> Calculer le nombre absolu de députés sur la base de l&#39;équation suivante: <img alt="Equation 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52651/52651eq1.jpg" /></li></ol> 1.3) Détermination de MP Protein Concentration (Bradford Assay) <ol><li> 5 Préparer des dilutions en série d&#39;un niveau de 1,25 à 20 ug / ml de protéine. Introduire à la pipette 800 ul de chaque solution étalon et de l&#39;échantillon dans un tube à essai propre en double. Ajouter 200 ul de réactif de colorant de Bradford à chaque tube. Mélangez bien, puis incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Mesurer l&#39;absorbance à 595 nm. Déterminer la concentration en protéine en utilisant le PMT de régression linéaire de la courbe standard. </li></ol> 2. explants de tissus bronchiques et traitement PMT REMARQUE: Portez une attention particulière à l&#39;environnement de travail stérile et aseptique préparer les solutions et moyen utilisés dans les expériences suivantes. Pour préparer la complète guérison moyen, ajouter 1 ml de guérison des tissus moyennes suppléments avec du sérum (décongelés sur de la glace) à 100 ml Tissue de guérison moyen et bien mélanger. 2.1) Préparation des explants de tissus bronchiques <ol><li> Avant culture, rayer six zones de 1 cm 2chacune sur le bord de la surface de chaque boîte de culture tissulaire de 100 mm avec une lame de scalpel. Enrober chaque rayé 100 tissu mm boîte de culture avec 2 ml de la solution de revêtement de boîte de culture, et incuber le plat dans un incubateur à CO2 humidifié O / N à 37 ° C. Vide aspirer la solution excédentaire et remplir la cuve avec 15 ml de laver des tissus moyen. </li><li> Euthanasier souris C57BL / 6 (5 à 7 semaines) par inhalation de CO 2 selon des protocoles approuvés par le comité d&#39;éthique de soins aux animaux. </li><li> Aseptique disséquer le tissu pulmonaire avec scalpel, Dumont super fine pince à épiler et des ciseaux chirurgicaux. Retirez délicatement parenchyme et les vaisseaux sanguins. Placez le tissu pulmonaire dans glacée tissus laver moyen pour le transport au laboratoire, le cas échéant. </li><li> Disséquer outre bronche immergé dans le lavage des tissus à moyen et séparer les bronches d&#39;un diamètre de 1 à 2,5 mm à partir de tissus pulmonaires périphériques. Trancher les tissus bronchiques dans ~ 5 mm d&#39;épaisseur anneaux bronchiques avec un scalpel. </li&gt; <li> Utilisez un mouvement d&#39;écopage avec la pince de microdissecting courbes stériles pour ramasser les fragments bronchiques et placez-les sur les zones rayées de la vaisselle. </li><li> Retirez le laver de tissus moyen, et incuber les fragments à température ambiante pendant ~ 5 min pour leur permettre de respecter les plats. </li><li> Ajouter 10 ml de complète guérison moyenne à chaque plat et les placer dans une chambre de l&#39;incubateur modulaire atmosphère contrôlée. Rincer la chambre de mélange de gaz O 2 élevé (70% de O 2, 25% de N 2 et 5% CO 2). Placez la chambre dans un incubateur orbital de paillasse et le secouer à 37 ° C. Secouez la chambre pendant 24 heures à 10 cycles par minute pour permettre le support de circuler de façon intermittente au cours des fragments. </li><li> Après 24 heures d&#39;incubation, observer les explants de tissus sous un microscope optique à contraste de phase inversée. Sélectionnez explants bronchiques avec complète, le mouvement de poils fins et de l&#39;épithélium bronchique animée pour le traitement PMT ultérieure. </li></ol>2.2) Traitement PMT <ol><li> Préparer un milieu de croissance complet comme suit: moyennes suppléments de croissance de dégel avec un inhibiteur de sérum de fibroblastes et sur la glace. Ajouter 1 ml de milieu de culture avec des suppléments de sérum et 200 ul d&#39;inhibiteur de fibroblastes à 100 ml de milieu de croissance; bien mélanger. Chauffer le milieu de croissance complet à 37 ° C pendant 10 min avant utilisation. </li><li> Diluer PMT isolés dans un nouveau tube Eppendorf stérile avec PBS pour préparer un stock PMT à une concentration de 800 pg / ml. </li><li> Ajouter 0,5 ml de la croissance complète moyenne à chaque puits d&#39;une plaque de culture de tissu à 12 puits. </li><li> Transférez les explants bronchiques sélectionnés avec la pince de microdissecting courbes du protocole précédent (section 2.1) à chaque puits de la plaque de culture de tissu. </li><li> Étiqueter la plaque de culture appropriée pour identifier PMT puits de traitement et des puits de contrôle. Ajouter 25 ul PMT bouillon dans chaque traitement PMT bien (pour une concentration finale de 40 pg / ml) et 25 véhicules de contrôle de pi (voir LMP<html> s production) dans les puits de contrôle. </li><li> Poursuivre l&#39;incubation dans une chambre de l&#39;incubateur modulaire à atmosphère contrôlée à 37 ° C sous agitation douce. </li><li> Après 24 h, laver explants 3 fois avec du PBS et procéder à la (fixation du paraformaldéhyde 4% [PFA]) prochaine étape. </li></ol> 3. examen histopathologique 3.1) Préparer les solutions suivantes avant de procéder aux prochaines étapes <ol><li> Préparer du tampon PBS 1x en mélangeant 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,76 mM de KH 2 PO 4 à pH 7,4. </li><li> Pour préparer PFA 4%, dissoudre 20 g de PFA dans 400 ml d&#39;eau, chauffé à 60 ° C sous agitation; ajouter quelques gouttes de NaOH 10 M pour effacer la solution. Ensuite, ajoutez tampon PBS 1x et ajuster le volume à 500 ml et le pH à 7,4. Filtre et aliquote; stocker à -20 ° C. </li><li> Préparer les réactifs de déshydratation ou après réhydratation; 100%, 90%, 70%, 50% d&#39;éthanol et le xylene. </li></ol>e_step &quot;&gt; 3.2) explantation fixation et de tissus Section Déparaffinage <ol><li> Placer chaque explant dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml étiqueté avec 4% de PFA et incuber O / N à 4 ° C. Rincer les explants deux fois avec PBS 1x. </li><li> Déshydrater explants à travers une série d&#39;alcool (70% d&#39;éthanol: 3 fois 30 minutes chacun; 90% d&#39;éthanol: 2 fois 30 minutes chacun; 100% d&#39;éthanol: 3 fois 30 minutes chacun, puis xylène: 3 fois 20 min chacun). Effectuez toutes les étapes à la température ambiante dans une hotte. </li><li> Incruster des explants de tissu dans de la paraffine à 58 ° C dans un four. Préparer 5 um coupes de tissus épais en utilisant un microtome rotatif. </li><li> Flotter les sections C dans un bain d&#39;eau de 56 °, puis monter les sections sur des lames histologiques marqués. Placer les lames dans le manuel racks de coloration et sèche à 65 ° C pendant 1 heure. Laisser les lames refroidir à température ambiante. </li><li> Tremper les racks à quatre plats de taches consécutifs contenant xylène pendant 10 min chacun pour enlever la paraffine. Tremper les racks d&#39;une série de l&#39;éthanol pour éliminer le xylène: 100%, puis 95%, efr 80%, puis 70%, puis 50% d&#39;éthanol (5 min à chaque étape). Rincer les supports avec de l&#39;eau du robinet pendant 5 min pour éliminer l&#39;éthanol. </li></ol> 3.3) hématoxyline et de l&#39;éosine (H &amp; E) Coloration <ol><li> Continuer à travailler avec les sections de tissus fixés; placez la grille dans un plat à coloration à l&#39;hématoxyline de Mayer pendant 15 min. Rincez la grille avec de l&#39;eau du robinet pour enlever hématoxyline pendant 20 min. </li><li> Placez-les dans de l&#39;eau distillée pendant 30 sec.Place éthanol à 95% pendant 30 sec. Placer dans éosine Y plat solution de coloration pendant 1 min. Déshydrater par deux changements de 95% d&#39;éthanol, éthanol à 100%, et le xylène pendant 2 minutes chacun. </li><li> Effectuez une vérification rapide sous un microscope pour se assurer que l&#39;excès de l&#39;éosine est retiré. Placez 2 à 3 gouttes de milieu de montage (Fisher SP15-100) sur chaque diapositive, puis couvrir avec un couvercle en verre. </li></ol> 3.4) In Situ mort cellulaire détection: TUNEL Assay <ol><li> Avant de commencer, préparer une solution de travail de la proteinase K: 20 pg / ml dans10 mM de Tris / HCl, pH 7,4. </li><li> Répétez les étapes 1 à 5 de l&#39;article 3.2 (fixation explantation et de tissus section déparaffinisation). Rincer les lames avec déminéralisée H 2 O. </li><li> Plonger les lames avec 1x PBS pendant 10 min. Égoutter l&#39;excès de PBS. Incuber les coupes de tissus pendant 30 minutes à température ambiante avec une solution de proteinase K de travail. Rincer les lames deux fois avec PBS 1x. </li><li> Effectuer l&#39;essai TUNEL comme décrit dans le manuel d&#39;utilisation du kit de détection de la mort cellulaire. Monter en utilisant un milieu de montage, et lamelle manuellement avec des lamelles de verre. </li><li> Analyser les échantillons sous un microscope optique. Utilisez Image Pro 4.5 pour analyser les cellules apoptotiques en couleur brune. </li></ol>

<ol><li>Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+microparticles+in+the+pathogenesis+of+cardiovascular+disease%3A+friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 4-9 (2011).</li>
<li>Martinez, M. C., Tual-Chalot, S., Leonetti, D., Andriantsitohaina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles%3A+targets+and+tools+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Microparticles: targets and tools in cardiovascular disease.</a> Trends Pharmacol Sci. 32 (11), 659-665 (2011).</li>
<li>Benameur, T., Andriantsitohaina, R., Martinez, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+plasma+membrane-derived+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rep%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of plasma membrane-derived microparticles.</a> Pharmacol Rep. 61 (1), 49-57 (2009).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytic+microparticles+inhibit+angiogenesis+by+stimulating+oxidative+stress+and+negatively+regulating+VEGF-induced+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lymphocytic microparticles inhibit angiogenesis by stimulating oxidative stress and negatively regulating VEGF-induced pathways.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 294 (2), 467-476 (2008).</li>
<li>Yang, C., Gagnon, C., Hou, X., Hardy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+lipoprotein+receptor+mediates+anti-VEGF+effect+of+lymphocyte+T-derived+microparticles+in+Lewis+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Low density lipoprotein receptor mediates anti-VEGF effect of lymphocyte T-derived microparticles in Lewis lung carcinoma cells.</a> Cancer Biol Ther. 10 (5), 448-456 (2010).</li>
<li>Angelillo-Scherrer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-derived+microparticles+in+vascular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-derived microparticles in vascular homeostasis.</a> Circ Res. 110 (2), 356-369 (2012).</li>
<li>Maeno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+Cells+are+required+for+inflammation+and+destruction+in+cigarette+smoke-induced+emphysema+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice.</a> J Immunol. 178 (12), 8090-8096 (2007).</li>
<li>Qiu, Q., Xiong, W., Yang, C., Gagnon, C., Hardy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte-derived+microparticles+induce+bronchial+epithelial+cells%27+pro-inflammatory+cytokine+production+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte-derived microparticles induce bronchial epithelial cells' pro-inflammatory cytokine production and apoptosis.</a> Mol Immunol. 55 (3-4), 220-230 (2013).</li>
<li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shed+membrane+particles+from+T+lymphocytes+impair+endothelial+function+and+regulate+endothelial+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Shed membrane particles from T lymphocytes impair endothelial function and regulate endothelial protein expression.</a> Circulation. 109 (13), 1653-1659 (2004).</li>
<li>Shet, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li>
<li>Mause, S. F., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles%3A+protagonists+of+a+novel+communication+network+for+intercellular+information+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange.</a> Circ Res. 107 (9), 1047-1057 (2010).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-proliferative+and+anti-tumour+effects+of+lymphocyte-derived+microparticles+are+neither+species-+nor+tumour-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Anti-proliferative and anti-tumour effects of lymphocyte-derived microparticles are neither species- nor tumour-type specific.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Soleti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles+harboring+Sonic+Hedgehog+promote+angiogenesis+through+the+upregulation+of+adhesion+proteins+and+proangiogenic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Microparticles harboring Sonic Hedgehog promote angiogenesis through the upregulation of adhesion proteins and proangiogenic factors.</a> Carcinogenesis. 30 (4), 580-588 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Les députés sont des médiateurs actifs de diaphonie intercellulaire et leur étude est prometteur dans de nombreux domaines de la science. 11 Cette étude a présenté un protocole détaillé pour in vitro production à grande échelle de PMT issues d&#39;une lignée de cellules T apoptotique. Ces députés expriment un large répertoire de molécules de lymphocytes et sont biologiquement impliqués dans la régulation de l&#39;homéostasie cellulaire et tissulaire. Cependant, PMT provenant de différentes sources pe...

Les microparticules (MP) sont des vésicules membranaires submicroniques biologiquement actives libérées suite à l’activation cellulaire ou à l’apoptose. Les MP sont dérivés de cellules saines et endommagées et sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. 1 Les MPs ont été détectés non seulement dans le plasma humain, mais aussi dans les tissus inflammatoires et apoptotiques. L’utilité biologique des MP dérivées de la membrane cellulaire a été démontrée dans divers contextes, y compris des modèles de signalisation cellulaire et en tant qu’outils pharmacologiques. 2,3 Nous avons précédemment démontré que les LMP dérivées des lymphocytes T suite à la stimulation de l’actinomycine D (pour induire l’apoptose) suppriment l’angiogenèse et inhibent la survie et la prolifération des cellules endothéliales. 4,5 Les effets antiangiogéniques des LMP peuvent varier considérablement en fonction des stimuli utilisés pour activer les lymphocytes T in vitro. 6
L’épithélium des voies respiratoires fonctionne comme une barrière physique et fonctionnelle protectrice. Un nombre accru de lymphocytes T dans les voies respiratoires peut contribuer aux dommages cellulaires et à l’inflammation des voies respiratoires. 7 Nous avons montré que les LMP induisent l’apoptose des cellules épithéliales bronchiques humaines8, ce qui indique que les LMP peuvent modifier la fonction barrière de l’épithélium bronchique in vivo. Les cellules apoptotiques peuvent être identifiées à l’aide de la méthode TUNEL, qui détecte la fragmentation de l’ADN in situ. 
L’objectif global de ce protocole est d’illustrer la production in vitro de LMP à partir d’une lignée cellulaire de lymphocytes T, et de démontrer leur effet pro-apoptotique sur les cellules épithéliales des voies respiratoires. La détection in situ de la mort cellulaire a démontré que les LMP induisent fortement la mort cellulaire de l’épithélium bronchique des voies respiratoires, ce qui suggère que les lésions de l’épithélium des voies respiratoires induites par les LMP peuvent avoir un impact sur la fonction barrière de l’épithélium endommagé.

<table><tbody><tr><td>Production et caractérisation des</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lymphocytes T CEM</td> LMP<td>ATCC&nbsp ;</td><td>CCL-119</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 moyen&nbsp ;</td><td>Cambrex, Walkersville</td><td>04-744Q</td><td></td></tr><tr><td>Flacon T75</td><td>Sarstedt</td><td>83.1813.502</td><td></td></tr><tr><td>Flacon T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.502</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycine&nbsp ; D&nbsp ;</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>A9415-2mg</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lifetechnologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0,22 et micro ; m filter</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin-VCy5</td><td>BD Pharmagen&nbsp ;</td><td></td><td></td>559933</tr><tr><td>solution d’écoulement FACS</td><td>BD Bio-sciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles fluorescentes (1 &micro ; m)</td><td>Sondes moléculaires&nbsp ;</td><td>T8880</td><td></td></tr><tr><td>Perles de comptage en polystyrène (7 & micro ; m)</td><td>Bangs laboratories</td><td>PS06N/6994</td><td></td></tr><tr><td>Tubes FACS en polypropylène</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de 1 ml</td><td>Fisher</td><td>13-678-11B</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de 5 ml</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de 25 ml</td><td>Ultident</td><td>DL-357551</td><td></td></tr><tr><td>Microtube conique en polypropylène de 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.690</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique en polypropylène de 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique en polypropylène de 50 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polypropylène haute vitesse de 50 ml</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050</td><td></td></tr><tr><td>Flacon en polypropylène haute vitesse de 250 ml</td><td>Beckman</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Dosage des protéines (essai de Bradford)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Étalon de dosage des protéines II</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0007</td><td></td></tr><tr><td>Tube à essai 16 x 100</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>Tube à essai 12 x 75</td><td>Ultident</td><td>170-14100005B</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de cellules&nbsp ;</td><td>Mandel</td><td>Heracell 150</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse à basse vitesse</td><td>IEC</td><td>Centra8R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse à grande vitesse</td><td>Beckman</td><td>Avanti J8</td><td></td></tr><tr><td>Rotor à grande vitesse pour bouteille de 250ml</td><td>Beckman</td><td>JLA16.250</td><td></td></tr><tr><td>Rotor à grande vitesse pour tube de 50ml</td><td>Beckman</td><td>JA30.50</td><td></td></tr><tr><td>Cytométrie Fow&nbsp ;</td><td>BD Bio-sciences</td><td>FACS Calibur</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Beckman</td><td>Series 600</td><td></td></tr><tr><td>Explants et coupes de tissus bronchiques&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 souris (5-7 semaines)&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Charles River Laboratories, Inc.&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voies respiratoires de souris PrimaCell&trade ; Système :</td><td>CHI Scientific, Inc.</td><td>2-82001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Lames de scalpel en acier au carbone côtelées</td><td>Becton Dickinson AcuteCare</td><td>371310</td><td>#10</td></tr><tr><td>Manche de scalpel</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp ;</td><td>10003-12</td><td>#7</td></tr><tr><td>microscope inversé à contraste de phase</td><td>Olympus Optical CO., LTD.&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>mélange gazeux O2 élevé&nbsp ;</td><td>VitalAire Canada Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chambre d’incubation modulaire</td><td>Billups-Rothenberg Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 agitateur orbital incubé</td><td>Barnstead Lab-Line,&nbsp ;</td><td>SHKA4000-7</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 12 puits</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture tissulaire en plastique (100 mm)</td><td>Sarstedt, Inc.</td><td>83.1802</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp ;</td><td>14060-09</td> Pince Graefe droite<td>, tranchante, de 9 cm de long</td></tr><tr><td>Pince Graefe demi-courbée</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp ;</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>incubateur au CO2 humidifié</td><td>Mandel Scientific Company Inc.&nbsp ;</td><td>SVH-51023421</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Examen histopathologique&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>formol formaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>paraffine</td><td>Fisher scientific&nbsp ; International, Inc.</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>alcool éthylique</td><td>Merck KGaA, Darmstadt</td><td>EX0278-1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; glutaraldéhyde&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp ;</td><td>G6403</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp ;</td><td>31533</td><td></td></tr><tr><td>lames de microscope</td><td>VWR Scientific Inc.&nbsp ;</td><td>48300-025</td><td>25x75 mm</td></tr><tr><td>Xylène</td><td>Fisher scientific&nbsp ; International, Inc.</td><td>X5-4</td><td></td></tr><tr><td>Hématoxyline de Mayer</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp ;</td><td>MHS16</td><td>Entonnoir avec papier filtre&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>HCl&nbsp ;</td><td>Fisher scientific&nbsp ; International, Inc.&nbsp ; &nbsp ;</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>eosin&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp ;</td><td>HT110116</td><td>Entonnoir avec papier filtre&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Permount&trade ; Support de montage</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&nbsp ;</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>lamelle en verre</td><td>surgipath medical industries, Inc.</td><td>84503</td><td>24& fois ; 24&nbsp ;#1&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit de détection TUNEL</td><td>Détection in situ de la mort cellulaire, POD</td><td>11 684 817 910</td><td></td></tr><tr><td>four</td><td>Despatch Industries Inc.</td><td>LEB-1-20</td><td></td></tr><tr><td>Microtome rotatif</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>Papier filtre RM2145</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Whatman International Ltd.</td><td>1003150#</td><td>3</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon Imaging Japan Inc.</td>Plat de coloration <td>E800</td><td></td></tr><tr><td>complet</td><td>Wheaton Industries, Inc.</td><td>900200</td><td>y compris plat, grille, couvercle</td></tr><tr><td>1,5 ml eppendorf tube</td><td>Sarstedt Inc.&nbsp ;</td><td>72.69</td><td>39x10 mm</td></tr><tr><td>Bain-marie orbital et alternatif</td><td>ExpotechUSA</td><td>ORS200</td><td></td></tr><tr><td>solution saline tamponnée au phosphate&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Hotte GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nicram RD Service</td><td>3707E</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de microparticules lymphocytaire et détection de leur effet pro-apoptotique sur les cellules épithéliales des voies aériennes

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

L&#39;intérêt pour les rôles biologiques des cellules vésicules membranaires dérivés dans la communication cellulaire a augmenté ces dernières années. Des microparticules (MP) sont un tel type de vésicules, de diamètre allant de 0,1 um à 1 um, et typiquement libéré de la membrane plasmique de cellules eucaryotes en cours de l&#39;activation ou de l&#39;apoptose. Nous décrivons ici la génération de microparticules de lymphocytes T dérivés (PMT) à partir de cellules T CEM apoptotiques stimulées par actinomycine D. PMT sont isolés par un processus de centrifugation différentielle en plusieurs étapes et caractérisé par cytométrie de flux. Ce protocole présente également un procédé de détection in situ de la mort cellulaire pour démontrer l&#39;effet pro-apoptotique de PMT sur les cellules épithéliales bronchiques dérivés d&#39;explants de souris primaires de tissus respiratoires bronchiques. Procédés décrits ici prévoient une procédure reproductible pour isoler des quantités abondantes de PMT à partir de lymphocytes apoptotiques in vitro. PMT dérivéde cette manière peut être utilisé pour évaluer les caractéristiques des différents modèles de maladies et de la pharmacologie et de tests de toxicologie. Étant donné que l&#39;épithélium des voies aériennes offre une barrière de protection physique et fonctionnelle entre l&#39;environnement externe et les tissus sous-jacents, l&#39;utilisation d&#39;explants de tissus bronchiques plutôt que des lignées de cellules epitheliales immortalisées fournit un modèle efficace pour les enquêtes qui nécessitent des tissus des voies respiratoires des voies.

PMT ont été caractérisés avec de l&#39;annexine V coloration 10 par la cellule activé par fluorescence (FACS) analyse et fermée en utilisant une um perles dans lequel 97% des députés (≤1 um) ont été annexine-V-Cy5 positive (figure 1A et 1B). Typiquement, environ 2,5 mg de PMT ont été obtenus à la suite de ce protocole. Explants de tissus bronchiques de souris C57BL / 6 ont été soumis à un traitement véhicule et PMT. L&#39;analyse histopathologique des sections bronchiques révélé l&#39;effet d...

Microparticules membranaires hangar cellulaires (PM) sont des vésicules biologiques actifs qui peuvent être isolés et leurs effets physiopathologiques étudiés dans différents modèles. Nous décrivons ici un procédé pour générer PM dérivées de lymphocytes T (PMT) et pour mettre en évidence leur effet pro-apoptotique sur les cellules epitheliales des voies respiratoires.

Génération de microparticules lymphocytaire et détection de leur effet pro-apoptotique sur les cellules épithéliales des voies aériennes

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

L'objectif général de cette procédure est d'illustrer la production in vitro de microparticules lymphocytaires, ou LMP, à partir d'une lignée cellulaire de lymphocytes T, et de démontrer leur effet pro-apoptotique sur les cellules épithéliales des voies respiratoires. Ceci est réalisé en premier lieu par la production des LMP. Ensuite, les LMP isolées sont caractérisées par analyse en cytométrie en flux.Ensuite, les explants de tissu bronchique sont cultivés. Enfin, le traitement par LMP sur les explants bronchiques est effectué. En définitive, des examens histopathologiques tels que l'hématéine-éosine et la détection de la mort cellulaire par NC deux sont utilisés pour mettre en évidence les lésions induites par le LMP au niveau de la couche épithéliale bronchique et l'apoptose des cellules épithéliales.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'isolement de microparticules à partir de sang périphérique humain, réside dans notre capacité à produire à grande échelle des microparticules dérivées d'une lignée cellulaire par action in vitro. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés car les étapes critiq

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ici, nous décrivons les protocoles pour la récolte des macrophages alvéolaires murins, qui sont des résidents cellules immunitaires innées dans le poumon, et en examinant leur activation en réponse à la co-culture avec des nanoparticules polyanhydride.

La récolte macrophages alvéolaires murins et l&#39;évaluation d&#39;activation cellulaire induite par des nanoparticules polyanhydride

Cette vidéo démontre la génération et l’isolement de microparticules dérivées des lymphocytes T, LMP, à partir de lymphocytes T après un traitement par actinomycine-D.

Isolement de microparticules dérivées de lymphocytes T apoptotiques in vitro

Cette vidéo présente une méthode pour induire l’apoptose dans les cellules Jurkat - une lignée cellulaire de leucémie à lymphocytes T humains. Les cellules sont exposées au rayonnement ultraviolet C (UVC), qui cause des dommages importants à l’ADN et conduit à la mort cellulaire apoptotique.

Une technique in vitro pour la génération de lymphocytes T apoptotiques par irradiation UV

Nous décrivons un procédé pour générer des tranches de poumon couper avec précision (PCLS) et les immunocoloration pour visualiser la localisation de divers types de cellules immunitaires dans le poumon. Notre protocole peut être étendu pour visualiser l'emplacement et la fonction de différents types de cellules dans une variété de conditions.

coupe de précision de la souris Tranches Lung pour visualiser les cellules vivantes pulmonaire dendritiques

Nouveaux protocoles sont décrits ici pour isoler et caractériser les microparticules dérivées de l’homme et les neutrophiles de souris. Ces protocoles utilisent l’ultracentrifugation, cytométrie en flux et immunoblotting techniques pour analyser le contenu au moyen de microparticules, et ils peuvent être utilisés pour étudier le rôle de microparticules dérivés de divers types de cellules à fonction cellulaire.

Isolement et caractérisation de microparticules neutrophile dérivés pour des études fonctionnelles

Le protocole introduit ici permet la caractérisation de la capacité de radioralliement pulmonaire des lymphocytes humains primaires dans des conditions inflammatoires in vivo. Une infiltration pulmonaire des cellules immunitaires humaines moutschen transférés dans un modèle murin d’inflammation allergique peut être imagée et quantifiée par microscopie à fluorescence lumière-feuille de tissu pulmonaire chimiquement défrichées.

Avancée d’imagerie du poumon Homing des Lymphocytes humains dans un modèle In Vivo de l’Inflammation allergique, issue des feuilles lumière microscopie expérimentale

Ce manuscrit décrit un protocole pour déterminer si l'exposition à l'ozone, un polluant atmosphérique de critères, altère l'efferocytose de macrophage alvéolaire in vivo. Ce protocole utilise des réactifs et des techniques couramment utilisés et peut être adapté à plusieurs modèles de lésions pulmonaires pour déterminer les effets sur l'efférocytose macrophage alvéolaire.

Évaluation in vivo de l'efférocytose du macrophage alvéolif après l'exposition à l'ozone

Les souris exposées à l’ozone et à l’endotoxine bactérienne combinées montrent une mort cellulaire largement répandue, y compris celle des neutrophiles. Nous avons observé des adaptations cellulaires telles que la rupture du lamellipodia cytosquelettique, l’expression cellulaire accrue de la sous-unité complexe de synthase de V ATP β et l’angiostatin dans le lavage broncho-alvéolaire, la suppression de l’immuno-réaction de poumon et le recrutement retardé de neutrophile.

Visualisation des adaptations cellulaires pulmonaires pendant les lésions pulmonaires aiguës murines induites par l’ozone et le LPS

Présenté ici est une méthode reproductible, abordable et robuste pour l’isolement et l’expansion des cellules épithéliales bronchiques primaires pour la biobanque à long terme et la génération de cellules épithéliales différenciées par culture à l’interface air-liquide.

Isoler les cellules épithéliales bronchiques du tissu pulmonaire réséqué pour les biobanques et établir des cultures d’interface air-liquide bien différenciées

Ici, nous décrivons un modèle in vitro pour isoler et différencier les cellules épithéliales des voies respiratoires murines, en nous concentrant sur leur acclimatation à l’extrait chronique de fumée de cigarette (ECS). Le modèle pourrait être utilisé pour caractériser de manière exhaustive l’impact multi-omique de l’ECS, ce qui pourrait donner un aperçu des réponses cellulaires en cas d’exposition chronique à la fumée.

Modèle in vitro pour l’étude de la différenciation et des modifications de la multi-omique sur des cellules épithéliales des voies respiratoires murines stimulées par un extrait de fumée de cigarette

Découvrez la production de microparticules lymphocytaires à partir de lignées cellulaires T et leurs effets pro-apoptotiques sur les cellules épithéliales des voies aériennes. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes cellulaires impliqués.

Génération de microparticules lymphocytaire et détection de leur effet pro-apoptotique sur les cellules épithéliales des voies aériennes (Vidéo) | JoVE Journal

Génération de microparticules lymphocytaire et détection de leur effet pro-apoptotique sur les cellules épithéliales des voies aériennes

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