Perforé patch-clamp enregistrement des souris neurones sensoriels olfactifs dans neuroépithélium Intact: Analyse fonctionnelle des neurones exprimant un récepteur odorant Identifié

L’objectif général de cette procédure est de mesurer les changements dans les propriétés membranaires des neurones sensoriels olfactifs en réponse aux stimulants olfactifs. Ceci est accompli en disséquant d’abord l’épithélium olfactif et en le transférant dans une chambre perfusée. La deuxième étape consiste à localiser et à choisir un OSN d’intérêt au microscope.

Le bouton dendritique de l’OSN choisi est ensuite clampé et analysé tout en étant stimulé avec des odorisants. En fin de compte, le serrage par patch perforé des boutons dendritiques OSN caractérise les propriétés fonctionnelles de l’OSN au niveau de la membrane. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’olfaction, telles que l’enregistrement olfactif, les neurones sensoriels, l’expression de récepteurs olfactifs définis, ainsi que les enregistrements de patch-clamp.

Fournir des informations sur les propriétés membranaires de ces neurones. Préparez les pipettes stimulantes à partir d’un verre d’un millimètre ou achetez-les pré-tirées à l’aide d’une flamme. Pliez six pipettes à environ un centimètre de la pointe à un angle de 45 degrés.

Disposez ensuite les six pipettes à pointe courbée autour d’une septième pipette droite, à l’aide d’un œillet comme guide, et enveloppez-les dans une gaine thermorétractable. Chauffez le film rétractable à l’autre extrémité des pipettes. Appliquez plus de film rétractable.

Cela fait une pipette de stimulation prepo à sept barils. Maintenant, à l’aide d’une traction polaire à plusieurs barils, la pipette de stimulation à sept barils. Une fois tiré, renforcez l’ensemble avec de la colle blanche autour de l’œillet.

Laissez ensuite la colle sécher pendant la nuit des solutions requises. La solution de nystatine doit être fraîche juste avant d’être utilisée. Si nécessaire, pesez trois milligrammes de nystatine et ajoutez-le à 50 microlitres de DMSO.

Puis mélanger au vortex pendant 20 secondes. Ensuite, sonicez le mélange pendant deux à trois minutes pour assurer une dilution complète. Ajoutez maintenant 20 microlitres du mélange à cinq millilitres de solution mère intracellulaire.

Vortex mixe pendant 20 secondes, suivi de deux à trois minutes de sonication. Ensuite, refroidissez la solution de travail sur de la glace et gardez-la à l’abri de la lumière. De cette façon, la solution de travail est bonne pour quelques heures.

Chargez une seringue équipée d’un microfilm avec la solution de travail. Il sera bon pour une heure d’utilisation jusqu’à ce qu’il soit utilisé. Cependant, conservez la seringue chargée en la maintenant sur de la glace.

Tirez maintenant sur des électrodes d’enregistrement avec de longs cols et des ouvertures de deux microns. L’objectif est d’obtenir une résistance de 15 à 20 méga ohms une fois chargé avec une solution de Nystatin. Enfin, chargez la pipette stimulante avec l’odorisant dilué dans la bague. Solution.

Pour ce protocole, ayez des souris disponibles entre deux et quatre semaines. Dans cette présentation, les souris exprimant ou IRES tau GFP sont utilisées en utilisant ou IS tau GFP souris. Tous les neurones exprimant le ou d’intérêt seront marqués avec la GFP.

Cette méthode peut être utilisée pour ou exprimée dans toutes les zones. Cependant, les dissections et les enregistrements seront plus faciles pour les RC exprimés dans la zone dorsale. Commencez par anesthésier puis décapiter une souris.

Le résultat de ce protocole dépend de la qualité de la dissection. Ces étapes de dissection doivent être aussi courtes que possible et précises. Pour commencer la chirurgie, utilisez des ciseaux de dissection pour faire une coupe longitudinale le long du dos.

Séparez la peau pour l’enlever. Ensuite, coupez le long de la mâchoire inférieure et faites une coupe coronale parallèle aux dents. Ainsi, retirez les incisives supérieures.

Faites maintenant une coupe coronale autour de la tête, derrière les yeux, jetez la tête postérieure et transférez la partie antérieure dans des bagues glacées. Maintenant, sous un microscope de dissection, isolez le septum dans les cinq à 10 minutes. Commencez par une coupe longitudinale le long de la face ventrale.

Ensuite, coupez les os dorsaux longitudinalement le long de la face latérale dorsale de la cavité nasale. Ensuite, retirez la plupart des os et le palais. Transférez le septum isolé et fixez l’épithélium dans un récipient de bagues oxygénées à température ambiante.

Dans les cinq minutes, faites les derniers préparatifs avant l’enregistrement. La solution ne doit pas être trop chaude, sinon la préparation aura l’air endommagée. Pour accéder au neuro-épithélium pour l’enregistrement.

Tout d’abord, décollez l’épithélium du septum sous-jacent avec une pince. Ensuite, à l’aide de micro ciseaux Vanna, coupez l’extrémité antérieure du septum pour libérer l’épithélium. Retirez maintenant avec précaution l’organe nasal du vomer.

Coupez-le là où il est attaché dorsalement. L’épithélium isolé peut maintenant être déplacé vers la chambre d’enregistrement, côté mucus vers le haut. Une fois en place, utilisez une harpe pour aplatir le tissu.

Transférez ensuite la chambre sur un microscope vertical. Visualisez le neuroépithélium sous un objectif d’immersion dans l’eau 40x tout en le perfusant continuellement avec des bagues fraîches à température ambiante. Pour commencer la recherche des cellules d’intérêt, qui dans ce cas expriment l’EGFP, une lumière de 480 nanomètres est utilisée pour rechercher des cellules qui émettent de la lumière dans la gamme de 530 à 550 nanomètres.

Les boutons dendritiques et l’osn ciblés, lorsqu’ils sont examinés à 80 à 160 x en fond clair, doivent être clairement distingués des cellules de support. Chargez maintenant l’électrode avec une solution de statine S. Tapotez les bulles qui se forment et fixez l’électrode au support.

Appliquez maintenant une pression positive. La résistance attendue est comprise entre 15 et 20 méga ohms. Amenez ensuite l’électrode vers la cellule tout en maintenant la pression positive.

Lorsque la résistance augmente à environ 40 méga ohms, relâchez la pression et appliquez une légère pression négative. Si un joint giga est fabriqué, le potentiel de membrane doit être fixé à environ moins 75 millivolts. Maintenant que la cellule est ouverte, poursuivez l’expérience.

Appliquez une stimulation, des protocoles et perfuser avec des traitements pharmacologiques au besoin pour tester avec un seul odorant. Enregistrez de 200 à 500 millisecondes d’activité spontanée. Appliquez l’odorisant pendant 500 millisecondes, puis mesurez les réponses jusqu’à 10 secondes à l’aide du protocole décrit.

MOR 23, exprimant des neurones marqués avec EGFP, ont été patchés et stimulés avec différentes concentrations de al. En mode pince de courant, lyal est un ligand pour MOR 23. Alternativement, les cellules ont été simulées sous le mode de pince de tension.

Dans les enregistrements en mode pince de tension, différentes caractéristiques ont été surveillées. Pour quantifier la réponse telle qu’elle est classiquement réalisée en électrophysiologie à l’aide de la réponse d’amplitude maximale, la dose-réponse a été tracée à l’aide de l’équation de Hill. Ces résultats fournissent des informations sur les propriétés d’encodage de chaque OSN, notamment son seuil de détection, son temporel, sa dynamique, sa plage dynamique et son niveau de saturation.

Une fois maîtrisée, la partie dissection de cette technique peut être réalisée en 10 à 15 minutes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’explorer les propriétés fonctionnelles des neurones sensoriels olfactifs exprimant des récepteurs odorants définis chez la souris.