Name: Application Technique dinjection stéréotaxique pour étudier les effets génétiques sur les comportements des animaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Découvrez l'injection stéréotaxique de lentivirus pour moduler l'expression génique dans des régions cérébrales spécifiques chez la souris. Cette méthode permet d'évaluer quantitativement les comportements liés à l'anxiété et à la dépression.

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Ce travail est soutenu en partie par la bourse de développement scientifique de l’American Heart Association et le prix NARSAD Young Investigator Award à Yingwei Mao.

REMARQUE: Tous les protocoles impliquant des animaux ont été respectées en accord avec les lignes directrices de soins aux animaux de la Pennsylvania State University, IACUC # 44057 1. lentivirus production NOTE: Le jour avant la transfection, LentiX-293 devrait être à 80% de confluence. <ol><li> Rincer les cellules avec du DMEM juste avant la transfection et incuber dans 10 ml de DMEM / 10% de FBS avec de la pénicilline (100 UI / ml) et streptomycine (100 ug / ml) pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Diluer l&#39;ADN et de polyéthylèneimine (PEI) (1 mg / ml) dans 1: 3 (1 ug d&#39;ADN: 3 ul de PEI) dans 1 ml de DMEM et vortex pendant 1 min. Le volume ajouté est de l&#39;ADN dépend de la concentration de l&#39;ADN. Incuber à température ambiante pendant 10 min. <ol><li> Par exemple, utiliser 20 ug d&#39;ADN plasmidique, composé de 10 ug du vecteur plasmidique, 5 ug de psPax2 14 plasmide, 5 ug de virus de la stomatite vésiculaire (VSV) avec 60 pi de PEI par boîte. </li></ol></li><li&gt; Mélanger l&#39;ADN et de solution de PEI à nouveau au vortex pendant 1 min. Incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Ajouter 1 / 10ème du volume de milieu de culture DMEM total de (c.-à-1 ml pour 10 ml de milieu de culture dans une boîte de 100 mm). Ajouter 1 ml de l&#39;ADN-PEI mélange goutte à goutte dans le plat et agiter le plat autour jusqu&#39;à ce que le milieu de culture est bien mélangé avec l&#39;ADN. </li><li> Incuber pendant 6 heures à température ambiante et retirer le surnageant. Ajouter 5 ml de milieu de culture. </li><li> 48 h après la transfection, recueillir le surnageant viral et de spin à 627 x g pendant 5 min à 4 ° C dans un tube de 50 ml. Filtrer 30 ml de surnageant viral à travers un filtre à seringue de 0,45 um dans un tube d&#39;ultracentrifugeuse. </li><li> Ajouter de l&#39;eau stérile pour équilibrer les tubes, et couvrir tubes avec petit morceau de parafilm. tubes de tourner à 11 249 g pendant 120 min à 4 ° C. Retirer le liquide avec l&#39;aide d&#39;un bout de l&#39;aspirateur. </li><li> Ajouter 100 pi de PBS froid le tube. Secouer doucement le tube à 4 ° CO / N. </li><li> Pour remettre en suspension le virus, pipette til PBS ajouté dans l&#39;étape 1.8 sur les granulés 10 fois, en faisant attention à ne pas toucher le culot avec la pointe. Le culot ne sera pas remis en suspension jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit complète. </li><li> Aliquoter le virus à 10-20 pi par tube, flash-gel dans de l&#39;azote liquide et conserver à -80 ° C. </li></ol> 2. Injection stéréotaxique 2.1) Préparation des Instruments <ol><li> Passer une paire de ciseaux, une pince à extrémités émoussées, un porte-aiguille, scalpel, des cotons-tiges, et un tissu dans un emballage scellé avec un indicateur de stérilisation, et autoclave avant l&#39;intervention chirurgicale. En outre, obtenir 10% d&#39;iode de povidone, l&#39;alcool éthylique à 70%, sutures absorbables, un coussin chauffant, des larmes artificielles, un verre stérilisateur à billes, perceuse, une mèche, 2 seringues jetables, une seringue d&#39;injection, rasoir électrique, analgésique (kétoprofène), anesthésique (Avertin), des gants et un appareil stéréotaxique avec pompe d&#39;injection. </li><li> Préparer une solution de 1,25% avertin frais ce jour-là, filtre dans une hotte stérile en utilisant un 0,2 &amp;# 181; m filtre seringue stérile, et la placer dans un flacon de sérum stérile. Mélanger 2,5 g d&#39;alcool 2,2,2-tribromoéthyle dans 5 ml d&#39;alcool tert-amylique, puis dissoudre dans 200 ml d&#39;eau. Gardez le pH inférieur à 5. 15 </li></ol> 2.2) Préparation de la souris <ol><li> Administrer avertin basé sur le poids de la souris (375 mg / kg). 15 Injecter la souris avec le avertin via un (IP) injection intrapéritonéale, puis remettez-le dans sa cage jusqu&#39;à pleinement anesthésiés. </li><li> Donnez un analgésique par injection IP (ketaprofen, 5 mg / kg), et le lieu des larmes artificielles sur les yeux de la souris pour éviter le dessèchement. </li><li> Assurez-vous que la souris est complètement endormie en pinçant leur pied. Si la souris répond à la pincée de pied, puis donner plus anesthésique (à des doses de 50 pi). Raser la tête de la souris à l&#39;aide d&#39;un rasoir électrique. Raser la zone à opérer (typiquement de juste derrière les oreilles, à la partie supérieure du museau) et la région environnante. </li><li> Placez le i de la sourisNto l&#39;appareil stéréotaxique. Verrouiller les dents de devant sur la pince antérieure, et abaisser la pince et le serrer de telle sorte que la mâchoire est entièrement sécurisé. </li><li> Insérez les barres d&#39;oreilles dans le canal de l&#39;oreille pour se stabiliser complètement la tête. Veillez à ne pas insérer les barres d&#39;oreilles trop loin, ce qui pourrait endommager l&#39;oreille interne. Une fois terminé, le corps de la souris devrait être en mesure d&#39;être légèrement déplacé sans perturber la position de la tête. </li><li> Placez un coussin chauffant sous la souris afin de réguler la température du corps de la souris tout au long de la procédure. </li><li> Nettoyez soigneusement la zone chirurgicale. En utilisant un coton-tige, frottez 10% de povidone iode dans un mouvement circulaire, à partir du milieu du site chirurgical et se déplaçant vers l&#39;extérieur. Ensuite, utilisez un coton-tige pour frotter l&#39;alcool éthylique à 70% sur le site chirurgical de la même façon. Répéter deux fois. </li></ol> 2.3) La première incision <ol><li> Une fois que la souris est préparée, ouvrir le sac de matériel stérile. Changer de gants avant touching les instruments. Sortez le tapis stérile et placer les instruments sur la toile. Si tout instrument touche une surface non stérile, utilisez la vitre stérilisateur à billes pendant 15 secondes pour le stériliser. </li><li> Prenez le scalpel dans les forceps dominantes de la main et extrémités franches dans la main non dominante. Utilisez la pince à extrémités émoussées à adhérence doucement la peau de la souris, et faire une incision au bistouri. Commencez l&#39;incision d&#39;environ 1,5 cm au-dessus des oreilles (vers le nez) et étendre à environ 0,5 cm au-dessous des oreilles. Elargir l&#39;incision verticale au milieu de la tête de la souris pour exposer bregma (Figure 1). </li><li> Une fois bregma est visualisé, prendre un bout de coton stérile pour éliminer en douceur toute trace de sang recouvrant la surface du crâne. Utilisez deux conseils de coton pour pousser la peau vers le côté de la tête. </li></ol> 2.4) Installation du matériel <ol><li> Après tout sang est retiré de la surface du crâne, et est clairement visualisé bregma, préparer la seringue (concentration de 10 8 TU / ml, volume de 1 pi). Dans la hotte, à remplir la seringue avec le virus à injecter. Assurez-vous que pas de bulles sont à l&#39;intérieur. Placez la seringue dans l&#39;appareil stéréotaxique, veillant à ce qu&#39;il soit entièrement garanti. </li><li> Abaisser lentement la seringue jusqu&#39;à ce qu&#39;il se trouve juste au-dessus de la surface du crâne, de sorte que la pointe de l&#39;aiguille de la seringue stérile est fixé à l&#39;intersection de la ligne et bregma interauriculaire. Réglez ce point zéro, et déterminer les coordonnées de ce point. </li><li> En fonction de la zone du cerveau d&#39;intérêt, les coordonnées stéréotaxiques varier. Déterminer ces coordonnées en utilisant un atlas du cerveau 4. Une fois les coordonnées sont déterminées, déplacer l&#39;aiguille de la seringue pour correspondre à ces coordonnées. Cibler les gyrus denté utilisant les coordonnées: M / L = +/- 1 mm, A / P = -1,82 mm. Abaissez l&#39;aiguille à droite au-dessus du crâne de visualiser où le trou doit être percé. </li><li> Soulever légèrement la seringue, prenez la perceuse et placer le bi de foraget juste au-dessus du site de forage cible à environ un angle de 45 ° sur le crâne. Commencer le forage, et de garder le forage jusqu&#39;à ce que le crâne cède. Lorsque le crâne cède la place, une baisse de la résistance peut être détectée. Veillez à ne pas percer dans le cerveau, de manière à prévenir les dommages corticale. </li><li> Prenez un bout de coton stérile et essuyer le sang du trou. </li><li> Abaissez la seringue de sorte que la pointe se trouve à droite sur la surface du cerveau (pas le crâne). Réglez le D / V de coordonnées (profondeur) à 0. Lower la seringue à la profondeur désirée, sur la base des coordonnées de l&#39;atlas du cerveau. Pour atteindre le gyrus denté, réglez D / V à -1,79 mm. </li><li> Lancer l&#39;injection à un débit de 0,2 ul / min. Lire à faire en sorte que la seringue ne glisse pas inférieure à la profondeur désirée. Si cela se produit, soulevez doucement la seringue à la profondeur désirée nouveau. </li><li> Après l&#39;injection est terminée, attendre environ 2 min pour assurer que tout virus résiduel a été absorbé. Soulevez lentement la seringue et d&#39;utiliser un coton-tige pour enlever toute liquid à partir du site d&#39;injection. </li><li> Répétez l&#39;opération pour l&#39;autre hémisphère. </li></ol> 2.5) suture <ol><li> Retirer le fil de suture et une aiguille stériles de son emballage et l&#39;adhérence de l&#39;aiguille en utilisant les supports d&#39;aiguille. Face à la pointe pointue de l&#39;aiguille loin de la porte-aiguille. Tenez les pince à extrémités émoussées dans la main non-dominante, et l&#39;utiliser pour saisir la peau de la souris. Commencez avec la main dominante. </li><li> Poussez doucement le fil de suture à travers la peau et utiliser les pince à extrémités émoussées pour saisir la peau de l&#39;autre côté de l&#39;incision. Tirez sur le support de suture à travers jusqu&#39;à environ 0,75 pouce reste. </li><li> Lâcher de l&#39;aiguille, et d&#39;utiliser les pince à extrémités émoussées pour envelopper le fil de suture autour du porte-aiguille une fois, puis, prenez le reste suture 0,75 pouces avec le support d&#39;aiguille, et tirez le fil de suture à travers, de sorte que le porte-aiguille et l&#39;aiguille finir sur le côté de la tête opposée à celle sur laquelle ils sont à l&#39;origine. Cela devrait former un noeud. </li><li> Répétez cette étapetrois fois, en alternant le côté de la tête du porte-aiguille se termine sur à chaque fois. </li><li> Couper le fil de suture et répétez les étapes 2.5.1-2.5.3 jusqu&#39;à l&#39;incision est fermée. </li></ol> 2.6) de soins post-opératoires <ol><li> Retirez délicatement les barres d&#39;oreilles de la souris, et retirer sa mâchoire de la pince antérieure. </li><li> Garder la souris sur le coussin chauffant jusqu&#39;à ce qu&#39;il se réveille et se déplace sur son propre. Surveiller la souris quotidienne, et de garder et œil sur les signes de douleur, comme ne pas se nettoyer, manger ou boire. Donnez analgésique supplémentaire lorsque cela est jugé nécessaire. </li></ol> 3. Ouvrez Field Test 3.1) Set Up <ol><li> Obtenir un carré vide, l&#39;arène en plastique avec des dimensions de 50 cm x 50 cm, avec 50 cm de hauts murs (mais peuvent être légèrement plus grand). Nettoyer la scène avec de l&#39;alcool éthylique à 70% avant le début de l&#39;expérience. Assurez-vous que l&#39;alcool éthylique a complètement sec avant de placer une souris dans l&#39;arène. </li><li> Placez l&#39;arène sur lede-chaussée, et essayer d&#39;assurer l&#39;éclairage est réglé pour minimiser les ombres et les reflets. </li><li> Si vous utilisez un logiciel de suivi, positionner la caméra directement au-dessus du champ ouvert, environ 1,5 pieds au-dessus du champ ouvert (assez loin pour englober l&#39;ensemble complet arène, mais assez proche pour avoir une vision claire de la souris). </li><li> Mettre en place une zone dans le centre de la boîte (environ une superficie de 30 cm x 30 cm). 16 Pour régler une zone, cliquez sur l&#39;onglet zone 1 dans le panneau latéral. <ol><li> Sélectionnez un contour de forme dans le panneau supérieur, et de définir le périmètre de la zone centrale. Sélectionnez la zone ajouter, et cliquez sur l&#39;intérieur de la zone centrale. En utilisant les invites de programme, le nom de la zone (ce qui sera dénommé «centre» pour cette procédure). Si le test de comportement sera marqué par la main, assurez-vous que le fond du champ est divisé en 10 cm x 10 cm carrés, marqué en utilisant du ruban. </li></ol></li><li> Mettre en place le logiciel de sorte que les paramètres sont corrects, et la souris est facilement visible sur l&#39;écran. Accomplir cela en ajustant les paramètres de détection sur la machine pour être compatible avec l&#39;arène de test (éclairage) et la couleur de la souris. NOTE: Lorsque les paramètres sont corrects, le système doit suivre uniquement la souris, et non les ombres ou les urines / matières fécales. Les paramètres logiciels spécifiques dépendent de l&#39;éclairage de la scène, et la couleur de la souris. </li></ol> 3.2) acclimatation et d&#39;essai <ol><li> Déplacez la souris expérimentales dans le comportement chambre 1 h avant le test afin de les acclimater à leur environnement. Laissez les souris dans leur cage pour l&#39;acclimatation. </li><li> Allumez l&#39;appareil photo à la bande de la tâche comportementale et placez la souris vers l&#39;avant centre de l&#39;arène pour que la souris est face au mur. </li><li> Réglez la minuterie pour 5 min, et pas loin de l&#39;arène. Si possible, quitter la salle afin de ne pas influencer accidentellement la souris. </li><li> Une fois 5 min sont en place, retirer la souris et placez-les dans leur cage. </li><li> Utilisez de l&#39;alcool éthylique à 70% pour nettoyer à fond sur le terrain avant de passer à la prochaine souris. Assurez-vous que l&#39;alcool éthylique a entièrement séché. </li></ol> 3.3) Scoring <ol><li> Considérez la souris comme étant au centre du terrain lorsque les quatre pattes sont à l&#39;intérieur du milieu de 30 cm x 30 cm. </li><li> Quantifier la quantité de fois que la souris passe au centre. Alternativement, de déterminer cette fois en utilisant un logiciel de suivi (comme Noldus ethovison). <ol><li> Pour ce faire, allez dans l&#39;onglet d&#39;analyse, et cliquez sur «mouvement» dans les profils d&#39;analyse. Supprimer les catégories actuellement sélectionnées, puis sélectionnez &quot;dans la zone&quot; sous l&#39;onglet emplacement. Sélectionnez la zone centrale. Ensuite, sélectionnez &quot;sortie d&#39;analyse&quot; (sous l&#39;onglet de résultats) pour afficher les résultats. Un tableau énumérant le temps passé immobile pour chaque essai devrait apparaître. </li></ol></li><li> Sinon, le score de l&#39;OFT à la main. Le champ ouvert devrait avoir 25 à 10 cm x 10 cm carrés décrites sur le fond de l&#39;OPEchamp de n (comme indiqué dans l&#39;étape 3.1.3). Quantifier la quantité de fois que la souris passe au centre, en plus du nombre d&#39;entrées dans le centre de l&#39;arène. 16 NOTE: Le centre de 30 cm x 30 cm zone est considérée comme le centre du champ ouvert. Une souris est considéré comme vivant dans la région centrale si les quatre pieds sont à l&#39;intérieur de la zone 30 cm x 30. </li></ol> 4. test de natation forcée REMARQUE: Prévoir un minimum de cinq jours entre tâches comportementales. 4.1) Set Up <ol><li> Obtenir un 2 L seau claire, et remplir avec 22 ° C de l&#39;eau. Placez le seau sur une table, et essayer d&#39;assurer l&#39;éclairage est réglé pour minimiser les ombres et les reflets. </li><li> Si l&#39;on utilise un logiciel de suivi, positionner la caméra juste au-dessus du godet. </li><li> Mettre en place un logiciel pour que la souris est facilement visible à l&#39;écran. </li></ol> 4.2) acclimatation et d&#39;essai <ol><li> Déplacez souris expérimentales dans le ro comportementaleom 1 h avant le test pour acclimater les environs. Laissez les souris dans leur cage pour l&#39;acclimatation. </li><li> Allumez l&#39;appareil photo à la bande de la tâche comportementale. Doucement, placez la souris dans le milieu du seau d&#39;eau. Veillez à ne pas laisser tomber la souris dans. Abaissez lentement la souris, de sorte que ses pieds avant touchent l&#39;eau en premier. Prenez soin d&#39;éviter de submerger leur tête. </li><li> Réglez la minuterie pour 6 min, et pas loin de la zone de comportement. </li><li> Une fois 6 min sont en place, retirer la souris dans le seau, et essuyez l&#39;excès d&#39;eau avant de placer la souris de retour dans leur cage. </li></ol> 4.3) Scoring <ol><li> Si vous utilisez un logiciel de suivi, mis pour cent immobilité à 11%, tel que suggéré par Noldus (cela devrait être le réglage par défaut), pour quantifier le temps flottant vs piscine. </li><li> Pour quantifier en utilisant le système de suivi, allez dans l&#39;onglet d&#39;analyse, puis cliquez sur le mouvement sous des profils d&#39;analyse. Supprimer les catégories actuellement définies, puis sélectionnez l&#39;état de mobilité, surle panneau latéral gauche (sous le comportement individuel). Ensemble immobilité à 11%. </li><li> Sélectionnez la piste de visualisation, sous l&#39;onglet Résultats. Sélectionnez sortie d&#39;analyse (sous l&#39;onglet de résultats) pour afficher les résultats. Un tableau énumérant le temps passé immobile pour chaque essai devrait apparaître. </li><li> Si le ballon de la main, mesurer le temps de la souris passe la natation ou l&#39;escalade, et la quantité de fois que la souris passe immobile. En outre, de mesurer la latence à la première immobile temps. Voir Figure 2 dans la section Résultats. </li></ol>

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<li>Sik-Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+neuronal+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+cAMP+in+the+dentate+gyrus+of+the+hippocampus+is+required+for+antidepressant-like+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Induction of neuronal vascular endothelial growth factor expression by cAMP in the dentate gyrus of the hippocampus is required for antidepressant-like behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 29 (26), 8493-8505 (2009).</li>
<li>Miller, D. G., Adam, M. A., Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+by+retrovirus+vectors+occurs+only+in+cells+that+are+actively+replicating+at+the+time+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (8), 4239-4242 (1990).</li>
<li>Rubinson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells%2C+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nature Genetics. 33, 401-406 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Injections stéréotaxiques succès reposent sur trois facteurs: en gardant la souris vivante, le réglage du point zéro correct pour coordonnées (pointe de l&#39;aiguille sur l&#39;intersection de bregma et la ligne interauriculaire), et le réglage de la bonne profondeur au point zéro (pointe de l&#39;aiguille juste toucher l&#39;extérieur du tissu cérébral). La viabilité des souris est important. la survie de la chirurgie peut être facilitée en faisant en sorte que la souris est correctement anesthésié et reçoit analgésiq...

La souris a été largement utilisé en neurobiologie, car il est facile à manipuler génétiquement. Techniques Gene knock-out permettent aux chercheurs d&#39;étudier comment chaque facteur génétique façonne les comportements de souris. En outre, le système cre-loxP fournit un outil précieux pour tissulaire et la cellule type- KO de gène spécifique chez la souris, ce qui permet aux chercheurs d&#39;étudier la fonction des gènes dans différents tissus. 1 Toutefois, dans la pratique, les profils d&#39;expression des promoteurs de la CRE sont difficiles à contrôler , et si loin de nombreux chauffeurs de cre établies ont pas atteint l&#39;expression spécifique à la région. 2,3 En variante, une injection stéréotaxique est une méthode qui cible des régions spécifiques du cerveau de la souris adulte. Par l&#39;injection de virus génétiquement modifiés exprimant des shRNA ou ADNc, de la modulation de l&#39;expression génique spécifique à la région peut être obtenue. Bien que la taille du cerveau de chaque souris varie, l&#39;emplacement des régions spécifiques du cerveau peut être déterminé en utilisant coor stéréotaxiquenates réglée de points de repère sur le crâne du cerveau de la souris. Les monuments les plus couramment utilisés sont bregma, lambda, et la ligne interauriculaire. Utilisation de coordonnées obtenues à partir d&#39;un atlas du cerveau, 4 l&#39;emplacement exact de chaque région du cerveau peut être identifié par le antéro-postérieur (A / P), médiale-latérale (M / L), et dorso-ventral (D / V) des axes à partir de bregma / interaural intersection de la ligne. Typiquement les virus se injecté dans le cerveau de souris sont étiquetés avec soit la protéine fluorescente rouge ou vert (DP ou GFP), de sorte que les injections peuvent être confirmés par la microscopie à fluorescence. Évaluations comportementales de souris sont particulièrement nécessaires pour la recherche fondamentale de troubles psychiatriques. Les symptômes de troubles psychiatriques chez les patients impliquent généralement des comportements anormaux. Certains de ces comportements humains sont évolutivement conservées et peuvent être directement imité et observé chez la souris. Par exemple, la dépression peut être modélisée chez la souris par la mesure de désespoir comportemental. Les gens souffrant de dépression OFTen se sentent comme si de rien ils ne seront jamais aider, un symptôme qui peut éventuellement conduire au suicide. Chez les rongeurs, ce qui peut être modélisée en utilisant le test de natation forcée (FST), qui mesure la quantité de temps par rapport à une souris de natation flottant dans une piscine d&#39;eau (considéré comme l&#39;abandon). Ce paradigme est validée par le sauvetage du phénotype avec des anti-dépresseurs. 7,8,9 souris qui ont reçu des anti-dépresseurs vont passer beaucoup moins de temps immobile par rapport à des témoins non traités. Un autre test comportemental, le test Open Field (OFT) est conçu pour évaluer la locomotion chez la souris, et peut en outre être utilisé pour analyser le phénotype anxieux chez la souris. 5,6 Ce test est basé sur la prémisse que les souris se sentent plus en sécurité quand ils sont proches au mur dans un roman plein champ. Souris de type sauvage finiront explorer le nouvel environnement, car ils sont des animaux curieux. Cependant, passer moins de temps dans le centre du champ indique l&#39;anxiété chez la souris, que la souris ne sera pas en mesure de surmonter l&#39;initial la peur provoquée par un nouvel environnement. L&#39;angoisse de la souris, telle que quantifiée par la quantité de temps passé dans le centre d&#39;un champ ouvert, peut être comparé à l&#39;anxiété clinique chez l&#39;homme, qui est présent dans de nombreux troubles psychiatriques. La combinaison des injections stéréotaxiques de paradigmes comportementaux est une nouvelle façon de modifier l&#39;expression d&#39;un gène spécifique dans une zone ciblée du cerveau. L&#39;effet de l&#39;expression du gène modulé sur les comportements de la souris peut alors être déterminée. Contrairement à élimination directe de l&#39;ensemble du cerveau, cette méthode est particulièrement utile, car elle ne vise que les zones spécifiques du cerveau. En outre, des injections stéréotaxiques sont généralement effectuées chez l&#39;adulte de souris de type sauvage, par conséquent, l&#39;expression du gène endogène a été maintenue tout au long des stades de développement. Cette méthode permet d&#39;éviter l&#39;effet de confondre si le gène est nécessaire pour la survie pendant le stade embryonnaire ou post-natale de développement. Une limitation majeure est que les souris expérimentales doivent aller through une chirurgie invasive, dont les crânes de souris doivent être ouvert. En outre, le degré de modulation de gène est déterminée par l&#39;efficacité et le titre du virus. Le virus doit être injecté dans la région correcte en utilisant les coordonnées stéréotaxiques, qui exige des instruments spéciaux. Vérification du site d&#39;injection correct ne peut être achevé post-mortem. Cette méthode a été précédemment utilisé pour tester l&#39;implication d&#39;un gène spécifique dans diverses maladies neurologiques. Par exemple, virale ARNi médiée par ciblage du gène Th (qui permet la dopamine à synthétiser) a été injecté dans la compacta substance noire, et l&#39;analyse du comportement locomoteur a été effectuée. 10 Une autre étude a utilisé injection stéréotaxique d&#39;un silençage DISC1 lentivirus pour évaluer le comportement de la souris en ce qui concerne de la schizophrénie. Knockdown de DISC1 entraîné une augmentation de la locomotion en réponse à la nouveauté (parallèles symptômes positifs de la schizophrénie), et une plus grande immobilité dans leFST. 11 De même, une étude complémentaire a révélé que 5-HT 1B surexpression conduit à un comportement exploratoire augmenté dans l&#39;OFT, compatible avec un phénotype anti-anxiété en utilisant cette méthode. 12 injections stéréotaxiques peuvent livrer virus de la CRE pour induire la recombinaison chez les souris cre-loxP . Cette méthode a été utilisée pour supprimer de manière sélective le récepteur Y2 dans l&#39;amygdale et le noyau du lit de la strie terminale. Lors de l&#39;analyse du comportement, ces souris ont été trouvés à un phénotype anti-dépressif lorsque le gène a été supprimée dans l&#39;amygdale centrale, mais aucun phénotype lorsque le gène a été supprimée dans l&#39;amygdale basolatérale ou le noyau du lit de la strie terminale. 13 Ainsi, cette technique fournit un outil unique d&#39;étudier l&#39;effet génétique sur les comportements des animaux.

<table><tbody><tr><td>Appareil stéréotaxique article 51725</td><td>Stoelting co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Pompe stéréotaxique par excellence&nbsp ;</td><td>Stoelting co.</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Styringue d’injection, 65 RN</td><td>Hamilton</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Î.-P.-É.-B. ;</td><td>Polysciences inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Outils chirurgicaux fins</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Pince à extrémité émoussée</td><td>Outils chirurgicaux fins</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguilles&nbsp ;</td><td>Outils chirurgicaux fins</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Ram Products Inc</td><td>Boîtier de contrôle de microcouple, pièce à main Tech2000</td><td>avec pédale</td></tr><tr><td>Stérilisateur de billes de verre</td><td>Inotech&nbsp ;</td><td>IS-400</td><td></td></tr><tr><td>Sutures résorbables&nbsp ;</td><td>Unify</td><td>M-K518r19</td><td>Résorbable, coupe inversée</td></tr><tr><td>Cotons-tiges</td><td>VWR</td><td>89031-270</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Gaymar</td><td>T-pump TP-500 PN11184-000</td><td></td></tr><tr><td>Larmes artificielles</td><td>Rugby</td><td>NDC 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Seringue jetable</td><td>BD Seringue 309623</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gants en tissu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> nbsp ;</td><td>Ansell</td><td>Senseitouch #7823</td><td></td></tr><tr><td>Avertin ou autre anesthésique</td><td>voir recette citation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kétoprofène ou autre analgésique</td><td>voir vétérinaire&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de suivi</td><td>Noldus</td><td>Ethovision XT</td><td></td></tr><tr><td>Caméra de suivi</td><td>Noldus</td><td>Media Recorder</td><td></td></tr></tbody></table>

application technique d&#39;injection stéréotaxique pour étudier les effets génétiques sur les comportements des animaux

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Injection stéréotaxique est une technique utile pour fournir des lentivirus de titre élevé dans les zones ciblées du cerveau chez la souris. Les lentivirus peuvent soit surexpression ou l&#39;expression des gènes knockdown dans une région relativement concentré, sans dommages importants aux tissus du cerveau. Après la récupération, la souris injectée peut être testée sur différentes tâches comportementales telles que le test Open Field (OFT) et le test de natation forcée (FST). L&#39;OFT est conçu pour évaluer la locomotion et le phénotype anxieux chez la souris par la mesure de la quantité de temps que d&#39;une souris passe au centre d&#39;un roman plein champ. Une souris plus anxieux va passer beaucoup moins de temps dans le centre du champ roman par rapport aux témoins. La FST évalue le phénotype anti-dépressif en quantifiant la quantité de temps que les souris passent immobile lorsqu&#39;il est placé dans un seau d&#39;eau. Une souris avec un phénotype anti-dépressive va passer beaucoup moins de temps immobile par rapport aux animaux témoins. L&#39;objectif de ce protocole est d&#39;utiliser le stereotactic injection d&#39;un lentivirus en conjonction avec des tests comportementaux pour évaluer comment les facteurs génétiques moduler les comportements animaux.

<html> Injection stéréotaxique précise repose largement sur la définition des coordonnées correctes. La pointe de l&#39;aiguille utilisée pour injecter le virus devrait être fixé directement sur ​​l&#39;intersection de bregma et la ligne interauriculaire (Figure 1). Il est utile d&#39;utiliser une loupe binoculaire pour déterminer si oui ou non l&#39;aiguille est correctement placé. Lorsque l&#39;on regarde au microscope, l&#39;aiguille doit être positionnée de sorte que si le virus a été injecté, il se ...

Injection stéréotaxique de lentivirus exprimant les ADNc ou shRNA peuvent moduler l&#39;expression génique dans des zones spécifiques du cerveau de souris. Ici, nous présentons un protocole de combiner injections stéréotaxiques avec des tâches comportementales, comme le test Open Field (OFT) et le test de natation forcée (FST).

Application Technique d&#39;injection stéréotaxique pour étudier les effets génétiques sur les comportements des animaux

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer comment la modulation de l'expression d'un gène dans une région cible affecte le comportement animal. Cela est réalisé en premier lieu en créant un lentivirus permettant de moduler l'expression du gène cible. La deuxième étape consiste à utiliser une injection stéréotaxique pour injecter le lentivirus dans une aire cérébrale spécifique d'un rongeur ER.Les comportements suivants, tels que l'anxiété et la dépression, peuvent être mesurés quantitativement à l'aide de paradigmes comportementaux établis. La dernière étape consiste à réaliser une histologie afin de confirmer l'emplacement correct du site d'injection. En définitive, l'injection stéréotaxique associée à une évaluation comportementale peut montrer comment un gène spécifique dans une région cible peut influencer les comportements de la souris.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que les scientifiques peuvent modifier l'expression d'un seul gène dans une petite zone ciblée, puis évaluer les changements comportementaux chez les souris. Pour commencer cette procédure, placez une souris anesthésiée dans l'appareil stéréotaxique, accro

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Source : Porlan, E., et al. Modification génétique stable et efficace des cellules de la souris adulte V-SVZ pour l’analyse des effets autonomes et non autonomes des cellules souches neurales. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre la modification génétique stable des cellules souches neurales (CSN) dans la zone ventriculaire-sous-ventriculaire (V-SVZ) par injection stéréotaxique d’un gène thérapeutique porteur du virus dans un modèle murin. Le virus pénètre dans les CSN, subit une...

Injection stéréotaxique de virus pour une modification génétique stable dans un modèle murin

Source : Fricano-Kugler, C. J., et al. Conception, emballage et administration de CRISPR retro et de lentivirus à titre élevé par injection stéréotaxique. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre l’injection virale stéréotaxique pour une édition précise des gènes neuronaux dans le cerveau de la souris. Le protocole garantit une livraison précise du virus au gyrus denté, permettant le marquage fluorescent et l’inactivation de gènes médiée par CRISPR pour étudier les circuits neuronaux, la...

Injection virale stéréotaxique pour l’édition de gènes neuronaux ciblés dans le cerveau de souris

Cet article décrit comment micro-injection de vecteurs viraux dans le cerveau de la souris, puis tester dans un endroit paradigme de préférence conditionné qui comprend une phase d'acquisition, l'extinction et la réintégration.

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Nous décrivons ici une procédure basée sur l’utilisation de particules lentivirales pour la modification génétique à long terme des cellules souches neurales et/ou de leurs cellules épendymaires adjacentes dans la niche neurogène ventriculaire-sous-ventriculaire adulte qui permet l’analyse séparée des effets autonomes et non autonomes des cellules dépendantes de la niche sur les cellules souches neurales.

Stable et efficace modification génétique de cellules dans le Adulte souris V-SVZ pour l&#39;analyse des cellules souches neurales autonome et effets non autonomes

Cet article décrit comment injecter des vecteurs viraux dans le cortex frontal de la souris pour tester tests comportementaux qui nécessitent la formation hétéromère GPCR.

HSV-Mediated Expression du transgène de chimériques Constructs pour étudier la fonction Behavioral des GPCR hétéromères chez la souris

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Chirurgie stéréotaxique des manipulations génétiques dans des cellules de cerveaux de souris néonatales striataux

Ce protocole décrit un ensemble de méthodes pour identifier la connectivité fonctionnelle spécifique de type cellulaire des entrées à longue portée des régions éloignées de cerveau utilisant des stimulations optogénétiques dans des tranches de cerveau ex vivo.

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Le rôle des gènes récemment découverts associés à la maladie dans la pathogénie des désordres neuropsychiatriques demeure obscur. Une technique bilatérale modifiée d’électroporation in utero permet le transfert de gènes dans de grandes populations de neurones et l’examen des effets causatifs des changements d’expression génétique sur le comportement social.

Un pipeline utilisant l’électroporation bilatérale in utero pour interroger les influences génétiques sur le comportement des rongeurs

Le présent protocole décrit une stratégie pratique pour accélérer l’étape de vérification des coordonnées d’injection stéréotaxique avant d’effectuer le traçage viral à l’aide de colorants et de coupes congelées.

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Injection stéréotaxique de micro-ARN exprimant lentivirus à la souris hippocampe CA1 Région et l&#39;évaluation du résultat comportemental

Découvrez l'injection stéréotaxique de lentivirus pour moduler l'expression génique dans des régions cérébrales spécifiques chez la souris. Cette méthode permet d'évaluer quantitativement les comportements liés à l'anxiété et à la dépression.

Application Technique d'injection stéréotaxique pour étudier les effets génétiques sur les comportements des animaux

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