Méthodes pour explants de tissus en culture fémur humain pour étudier le cancer du sein cellulaire colonisation de la Niche métastatique

L'objectif de cette procédure est d'étudier la prolifération, la colonisation et la migration des cellules cancéreuses du sein dans un modèle de système d'explants de tissu osseux humain. Cela est réalisé en isolant des fragments de tissu osseux trabéculaire à partir de prélèvements chirurgicaux de tête fémorale et en les cultivant avec des cellules cancéreuses du sein exprimant la luciférase et la protéine verte fluorescente. L'imagerie bioluminescente est utilisée pour mesurer la prolifération cellulaire et confirmer la colonisation des cellules cancéreuses du sein dans les fragments de tissu osseux.

Les schémas de colonisation des cellules cancéreuses du sein sont visualisés par microscopie à fluorescence. Le compartiment médullaire peut être éliminé par lavage à partir des fragments pour une analyse par cytométrie en flux, ainsi que par des tests de luminescence et de coloration. La migration des cellules cancéreuses du sein vers des surnageants de culture tissulaire et des fragments de tissu osseux est mesurée dans des chambres de migration Transwell avec imagerie de bioluminescence. L'os constitue le site le plus fréquent de métastases du cancer du sein, et ce modèle offre finalement une nouvelle fenêtre d'observation pour l'étude des cellules cancéreuses du sein au sein du niché métastatique osseux.

Un grand avantage de ce modèle est qu'il permet un accès direct au microenvironnement de fragments de tissu osseux humain, ce qui nous permet d'observer et d'analyser facilement le comportement des cellules cancéreuses du sein lors d'expériences de co-culture à court terme. Cette méthode peut être utilisée pour étudier des questions clés concernant les mécanismes sous-jacents au cancer du sein et aux métastases osseuses, dans le but d'identifier des stratégies thérapeutiques permettant de prévenir et de traiter efficacement cette maladie. Bien que ce modèle puisse fournir des informations sur la métastase du cancer du sein, il peut également être utilisé pour étudier d'autres tumeurs osseuses, telles que le cancer de la prostate.

Des fragments de tissu osseux doivent être prélevés à différents moments au cours de chaque essai. Cette procédure commence par la collecte et le transport d'un spécimen fémoral dans du sérum physiologique, ainsi que par la préparation du poste de travail dans une hotte de sécurité biologique portant un gant chirurgical. Saisissez la tête du fémur d'une main et utilisez un outil chirurgical pour extraire l'os trabéculaire.

Les fragments mesurent environ deux à cinq millimètres de taille. Les pinces ne conviennent pas pour cette étape. Vous avez besoin d'un bon bistouri chirurgical.

Pour cette expérience, préparez une suspension de cellules de cancer du sein contenant 100 000 cellules par 50 microlitres de DMEM supplémenté de 10 % de FBS. En outre, préparez des bouchons de cire osseuse pour mobiliser les fragments osseux à l’aide des extrémités coupées d’une pipette micropipette, et conservez les bouchons dans une boîte de Pétri. Ensuite, à l’aide de pinces, transférez les bouchons dans une plaque de six puits et, à l’aide d’un gant stérile, appuyez-les en position 12 heures.

Ensuite, prélevez à la pipette 50 microlitres de la suspension cellulaire au centre de chaque puits. Placez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pendant 45 minutes afin de favoriser l'attachement cellulaire, pendant que la plaque incube, extrayez les fragments osseux avec les cellules attachées à la plaque. Placez un fragment de tissu osseux sur la cire à os dans trois puits et appuyez doucement sur chacun à l’aide du GER ; les trois puits sans fragments serviront de témoins.

Ensuite, ajoutez lentement cinq millilitres de DMEM supplémenté de 10 % de FBS sur la paroi de chaque puits. Le cire osseuse et les fragments osseux ne doivent pas être délogés. Incubez ensuite la culture pendant 20 à 24 heures.

Le lendemain, commencez par imager les cellules. Ajoutez 300 microgrammes par millilitre de luciférine dans chaque puits, puis imager immédiatement la plaque à l’aide d’une plateforme d’imagerie Ivis. Cette expérience nécessite une suspension de cellules de cancer du sein similaire à la précédente.

Après avoir extrait les fragments osseux, utilisez une pince pour transférer chaque fragment dans un puits vide d'une plaque 24 puits, puis pipetez 50 microlitres de suspension cellulaire directement sur chaque fragment osseux, et transférez la plaque dans une étuve pendant 45 minutes afin de favoriser l'attachement cellulaire. Une fois les cellules attachées, ajoutez doucement un à deux millilitres de milieu dans chaque puits, suffisamment pour immerger le fragment osseux. Ensuite, placez la plaque dans l'incubateur de culture tissulaire pendant 20 à 24 heures.

En prévision de l'imagerie Ivis, de l'imagerie de fluorescence ou de la collecte de cellules médullaires pour analyse en imagerie Ivis, transférez les fragments osseux dans une plaque de 24 puits contenant un millilitre de milieu frais par puits. Ajoutez 300 microgrammes par millilitre de Lucifer à chaque puits, puis procédez comme décrit précédemment pour la microscopie à fluorescence. Prélevez cinq microlitres de solution marquée au bisphosphonate fluorescent et ajoutez-les dans chaque puits afin de marquer les spicules osseuses des fragments osseux, puis incubez la plaque pendant encore 24 heures.

24 heures plus tard, utilisez une pince pour transférer les fragments vers des plaques contenant un milieu sans rouge de phénol. Ensuite, observez les plaques à l’aide d’un microscope à fluorescence configuré pour l’imagerie à 485 nanomètres afin de localiser les cellules cancéreuses du sein exprimant la GFP colonisant les spicules osseuses marquées au bisphosphonate, et à 680 nanomètres pour identifier les spicules osseuses marquées au bisphosphonate. Rincez le compartiment de la moelle osseuse pour analyser le nombre ou les propriétés des cellules.

Transférez un fragment dans un tamis de 70 micromètres placé au-dessus d'un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, utilisez une seringue de 10 millilitres munie d'une aiguille de 25 gauge pour rincer vigoureusement le fragment avec 10 millilitres de PBS. Centrifugez la suspension à 300 ×g pendant trois minutes à température ambiante afin de former un culot cellulaire, puis aspirez et jetez le surnageant.

Pliez le culot de cellules médullaires dans du PBS ou toute autre solution souhaitée pour des analyses par cytométrie en flux ou des tests de viabilité. Commencez par générer un réseau de tissu osseux. Placez les fragments osseux dans les puits d'une plaque de 12.

Plaque de culture contenant 2,2 millilitres de DMEM avec 10 % de FBS par puits et laisser quelques puits témoins sans fragments osseux. Incuber la plaque pendant 24 heures. Puis aspirer et remplacer le milieu, puis poursuivre la culture pendant encore 24 heures ; au bout de 48 heures de culture, transférer 0,9 millilitre de surnageant dans une plaque réceptrice tout en incubant temporairement la plaque réceptrice.

Placer les inserts de transwell dans une plaque 24 puits vide. Ensuite, semer 100 000 cellules de cancer du sein dans 350 microlitres sur chaque insert. Puis cultiver les plaques pendant 45 minutes afin de favoriser l'attachement cellulaire. Après 45 minutes, utiliser des pinces pour transférer les inserts vers une plaque réceptrice.

Veillez à incliner les inserts lors de leur placement dans le récepteur. Supinez bien afin d'éviter la formation de bulles. Incubez ensuite la plaque avec les inserts pendant 20 heures à 37 degrés Celsius le lendemain.

Utilisez une pince pour retirer les inserts et ajoutez 300 microgrammes par millilitre de Lucifer dans chacun. Réalisez une imagerie de bioluminescence sur la plaque réceptrice afin de détecter les cellules cancéreuses du sein qui ont migré à travers les membranes et qui se sont fixées au fond des puits de la plaque réceptrice. Commencez par charger une plaque réceptrice avec du milieu et placez-la dans l'incubateur de culture tissulaire.

Pour ensemencer les inserts, retournez-les dans une boîte vide pour tubes microfusés avec couvercle. Ajoutez ensuite 100 000 cellules en 50 microlitres sur la surface inférieure externe de chaque membrane d'insert.

Couvrez la boîte en laissant le couvercle entrouvert et incubez les inserts pendant 45 minutes dans l’incubateur de culture tissulaire. Ensuite, utilisez une pince pour retourner et transférer les inserts, ainsi que les puits d’une plaque réceptrice, dans chaque cupule d’insert contenant 0,45 millilitre de DMEM avec 10 % de FBS. Ajoutez ensuite un fragment osseux de trois millimètres ou une bille de verre dans chaque insert et incubez la plaque pendant 20 heures.

Le lendemain, utilisez une pince pour transférer les fragments et les billes vers une plaque dont les puits contiennent un millilitre de milieu frais. Ajoutez 300 microgrammes par millilitre de Lucifer par puits, puis procédez à l'imagerie de bioluminescence. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

Des cellules cancéreuses du sein ont été cultivées en co-culture à proximité de fragments osseux immobilisés afin de mesurer la prolifération des cellules mammaires. Une imagerie par bioluminescence après 24 heures de culture a révélé une prolifération accrue des cellules cancéreuses du sein en présence de fragments osseux dans les trois puits supérieurs, comparativement à l'absence de fragments osseux dans les trois puits inférieurs. Les résultats d'expériences utilisant des fragments provenant de trois spécimens chirurgicaux distincts ont montré une prolifération accrue en présence d'os par rapport à son absence.

Dans les trois cas, une colonisation des cellules MCF seven F Luke EGFP situées directement sous les fragments de tissu osseux a été observée par imagerie bioluminescente après 24 heures. Une diminution du signal a été associée à une densité d'ensemencement décroissante après 48 heures. Les fragments ensemencés directement et marqués avec un réactif bisphosphonate ont révélé une colonisation des cellules cancéreuses du sein positives pour la GFP au sein des compartiments minéralisés et médullaires.

La migration des cellules de cancer du sein à travers la membrane poreuse vers la culture de tissu osseux, les surnageants observés dans les trois puits supérieurs étaient importants par rapport à la migration dans le contrôle. Milieu observé dans les trois puits inférieurs. Une migration vers trois fragments osseux provenant d'un même échantillon de PTH a également été observée, tandis qu'aucune migration sur les billes n'a été observée.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment extraire des fragments de tissu osseux humain à partir d'un spécimen de tête fémorale et les initier dans des essais de co-culture afin de mesurer les comportements des cellules cancéreuses du sein, notamment la migration, la colonisation et la prolifération.