Méthodes pour explants de tissus en culture fémur humain pour étudier le cancer du sein cellulaire colonisation de la Niche métastatique

Les protocoles sont décrits pour l'étude de la migration des cellules de cancer du sein, de la prolifération et de la colonisation dans un système de modèle d'expiant de tissu osseux humain.

L’objectif de cette procédure est d’étudier la prolifération, la colonisation et la migration des cellules cancéreuses du sein dans un système modèle d’explan de tissu osseux humain. Ceci est accompli en isolant des fragments de tissu osseux trabéculaire à partir d’échantillons chirurgicaux de la tête fémorale et en les cultivant avec des cellules cancéreuses du sein exprimant la luciférase et la protéine fluorescente verte. L’imagerie par bioluminescence est utilisée pour mesurer la prolifération des cellules et vérifier la colonisation des cellules cancéreuses du sein dans les fragments de tissu osseux.

Les modèles de colonisation des cellules cancéreuses du sein sont imagés par microscopie à fluorescence. La moelle osseuse peut être évacuée des fragments pour être analysée par cytométrie en flux par luminescence et par coloration. La migration des cellules cancéreuses du sein vers la culture tissulaire, les surnageants et les fragments de tissu osseux est mesurée dans les chambres de migration Transwell avec imagerie par bioluminescence L’os est le site le plus fréquent de métastases du cancer du sein, et finalement ce modèle offre une nouvelle fenêtre pour l’étude des cellules cancéreuses du sein dans la niche métastatique osseuse.

Un grand avantage de ce modèle est qu’il offre un accès direct au microenvironnement des fragments de tissu osseux humain, ce qui nous permet d’observer et d’analyser facilement le comportement des cellules cancéreuses du sein lors d’expériences de co-culture à court terme. Cette méthode peut être utilisée pour étudier des questions clés sur les mécanismes sous-jacents au cancer du sein, des métastades à l’os dans le but d’identifier des stratégies thérapeutiques pour prévenir et traiter efficacement son action. Bien que ce modèle puisse donner un aperçu des métastases du cancer du sein, il peut également être utilisé pour étudier d’autres tumeurs malignes à la recherche osseuse, telles que le cancer de la prostate.

Des fragments de tissu osseux doivent être prélevés à divers points de chaque essai. Cela commence par la collecte et le transport d’un échantillon fémoral dans une solution saline et la préparation du poste de travail dans une enceinte de biosécurité avec un gant chirurgical. Saisissez la tête du fémur d’une main et utilisez un cru chirurgical pour extraire l’os trabéculaire.

Les fragments ont une taille d’environ deux à cinq millimètres. Les forceps ne fonctionneront pas pour cette étape. Vous avez besoin d’un brut chirurgical de bonne qualité.

Pour cette expérience, préparez une suspension de cellules cancéreuses du sein avec 100 000 cellules par 50 microlitres de DMEM plus 10 % FBS. De plus, préparez des bouchons de cire d’os pour mobiliser les fragments d’os à l’aide des extrémités coupées d’une pointe de micro-pipette, rangez les bouchons dans une boîte de Pétri. Ensuite, à l’aide d’une pince, transférez les bouchons dans une plaque à six puits et, à l’aide d’un gant stérile, appuyez sur les bouchons à la position 12 heures.

Ensuite, pipetez 50 microlitres de la suspension cellulaire au centre de chacune. Placez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pendant 45 minutes pour favoriser la fixation des cellules pendant que la plaque incube extraire les fragments osseux avec les cellules attachées à la plaque. Placez un fragment de tissu osseux sur la cire osseuse dans trois puits et appuyez sur chacun d’eux à l’aide des commandes des serveurs GER à trois puits sans fragments.

Ensuite, ajoutez lentement cinq millilitres de DMEM plus 10 % FBS à la paroi de chaque puits. La cire d’os et les fragments d’os ne doivent pas être délogés. Ensuite, incubez la culture pendant 20 à 24 heures.

Le lendemain, imagez d’abord les cellules. Ajoutez 300 microgrammes par millilitre de Lucifer dans chaque puits, puis imagez immédiatement la plaque avec une plate-forme d’imagerie Ivis. Cette expérience nécessite une suspension de cellules cancéreuses du sein comme la précédente.

Après avoir extrait les fragments d’os, à l’aide d’une pince, transférez chaque fragment dans un puits vide d’une plaque à 24 puits, puis pipetez 50 microlitres de suspension cellulaire directement sur chaque fragment d’os et transférez la plaque dans un incubateur pendant 45 minutes pour favoriser la fixation des cellules. Une fois que les cellules se sont fixées, ajoutez doucement un à deux millilitres de milieu à chacune, suffisamment pour immerger le fragment d’os. Placez ensuite la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 20 à 24 heures.

En préparation de l’imagerie Ivis, de l’imagerie par fluorescence ou de la collecte de cellules de moelle osseuse pour l’analyse pour l’imagerie Ivis, transférez les fragments d’os dans une plaque à 24 puits avec un millilitre de milieu frais par puits. Ajoutez 300 microgrammes par millilitre de Lucifer dans chaque puits et procédez comme décrit précédemment pour la microscopie à fluorescence. Pipetez cinq microlitres de solution de marquage au bisphosphate fluorescent dans chaque puits pour marquer les spicules osseux du fragment d’os et incubez la plaque pendant 24 heures supplémentaires.

24 heures plus tard, à l’aide d’une pince, transférez les fragments dans des plaques contenant un milieu sans rouge de phénol. Ensuite, visualisez les plaques à l’aide d’un microscope à fluorescence configuré pour imager à 485 nanomètres pour localiser, coloniser les cellules cancéreuses du sein exprimant la GFP et une analyse de 680 nanomètres. Identifier les spicules osseux marqués au bisphosphate pour rincer le compartiment de la moelle osseuse afin d’analyser le nombre ou les propriétés des cellules.

Transférez un fragment dans une passoire de 70 microns sur un tube de 50 millilitres. Ensuite, utilisez une seringue de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 25 pour rincer vigoureusement le fragment avec 10 millilitres de centrifugeuse PBS. La suspension à 300 G pendant trois minutes à température ambiante pour granuler les cellules aspire et jette le supinate reus.

Pliez la pastille de cellules de moelle dans du PBS ou d’autres solutions souhaitées par cytométrie en flux ou tests de viabilité. Commencez par générer du tissu osseux. Placez des fragments d’os dans les puits d’un 12.

Plaque de puits contenant 2,2 millilitres de DMEM 10 % FBS par puits et laisser certains puits de contrôle sans fragments d’os. Cultivez la plaque pendant 24 heures. Ensuite, aspirez et remplacez le milieu et continuez la culture pendant encore 24 heures, 48 heures après le transfert de 0,9 millilitre de supinate sur une plaque réceptrice tout en incubant temporairement la plaque réceptrice.

Placez les inserts transwell dans une plaque vide de 24 puits. Puis iPet 100 000 cellules cancéreuses du sein dans 350 microlitres sur chaque insert. Ensuite, cultivez les plaques pendant 45 minutes pour favoriser la fixation des cellules Après 45 minutes, utilisez une pince pour transférer les inserts sur une plaque réceptrice.

Assurez-vous d’incliner les inserts lorsque vous les placez dans le récepteur. Bien supiner pour éviter la formation de bulles. Ensuite, incubez la plaque avec des inserts pendant 20 heures à 37 degrés Celsius le lendemain.

Utilisez une pince pour retirer les inserts et ajoutez 300 microgrammes par millilitre de Lucifer dans chacun. Effectuez une imagerie de bioluminescence sur la plaque réceptrice pour détecter les cellules cancéreuses du sein qui ont migré à travers les membranes et se sont fixées au fond des puits de la plaque réceptrice. Tout d’abord, chargez une plaque réceptrice avec du milieu et placez-la dans l’incubateur de culture tissulaire.

Pour amorcer les inserts. Retournez-les dans une boîte vide en tube micro fusionné avec un couvercle. Ajoutez ensuite 100 000 cellules dans 50 microlitres sur la surface inférieure extérieure de chaque membrane d’insertion.

Couvrez la boîte en laissant le couvercle fissuré et incubez les inserts pendant 45 minutes dans l’incubateur de culture tissulaire. Ensuite, à l’aide d’une pince, inversez et transférez les inserts, les puits d’une plaque réceptrice dans chaque coupelle d’insertion à 0,45 millilitre de DMEM avec 10 % FBS. Ajoutez ensuite un fragment d’os de trois millimètres ou une perle de verre dans chaque insert et coupez dans la plaque pendant 20 heures.

Le lendemain, utilisez une pince pour transférer les fragments et les perles dans une assiette avec des puits contenant un millilitre de milieu frais. Ajoutez 300 microgrammes par millilitre de Lucifer par puits et procédez à l’imagerie par bioluminescence. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

Des cellules cancéreuses du sein ont été co-cultivées à côté de fragments d’os immobilisés pour mesurer la prolifération des cellules mammaires. L’imagerie par bioluminescence après 24 heures de culture a montré une prolifération accrue des cellules cancéreuses du sein en présence de fragments d’os dans les trois puits supérieurs par rapport à l’absence de fragments d’os dans les trois puits inférieurs. Les résultats des expériences utilisant des fragments de trois échantillons chirurgicaux distincts ont montré une prolifération accrue en présence ou en absence d’os.

Dans les trois cas, la colonisation de sept cellules EGFP de F Luke situées directement sous des fragments de tissu osseux a été observée par imagerie par bioluminescence après 24 heures. Une diminution du signal était associée à une diminution de la densité d’ensemencement après 48 heures. Des fragments directement ensemencés marqués avec un réactif de bisphosphonate ont révélé une colonisation des cellules cancéreuses du sein positives à la GFP dans les compartiments minéralisés et la moelle osseuse.

La migration des cellules cancéreuses du sein à travers la membrane de migration poreuse vers la culture du tissu osseux, surnageantes observées dans les trois puits supérieurs, était robuste par rapport à la migration vers le contrôle. Moyen vu dans les trois puits inférieurs. Une migration dans trois fragments d’os à partir d’un spécimen THR donné a également été observée, alors qu’aucune migration sur les billes n’a été observée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’extraire des fragments de tissu osseux humain d’un échantillon de tête fémorale et de les initier à des tests de co-culture pour mesurer les comportements des cellules cancéreuses du sein, y compris la migration, la colonisation et la prolifération.