Name: Méthodes pour explants de tissus en culture fémur humain pour étudier le cancer du sein cellulaire colonisation de la Niche métastatique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Découvrez une méthode d'explant osseux humain pour étudier la migration, la prolifération et la colonisation des cellules du cancer du sein dans la niche métastatique osseuse.

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Ces études ont été financées, en partie, par des subventions de la Fondation Alternative recherche et développement (107 588), l&#39;Institut national de la santé (1U54CA136465-04S1), et le Programme de recherche sur le cancer du sein en Californie (201B-0141). Nous remercions les Drs. Andrew Wilber et R. Scott McIvor pour le don généreux de leur <pkt2 lubig=""> transponson et PK / Hubic-SB11 plasmides de transposase. Nous tenons à remercier John Tamaresis, Ph.D. pour obtenir des conseils sur les méthodes statistiques, Timothy Brown pour effectuer cytométrie de flux, Georgette Henrich pour obtenir des conseils sur les migrations des essais, et Nancy Bellagamba pour faciliter la collecte de spécimens THR. </pkt2>

Têtes fémorales ont été prélevés chez des patients subissant une chirurgie élective THR dans le département de chirurgie orthopédique à l&#39;École de médecine de l&#39;Université Stanford. Tous les tissus ont été recueillies dans dépersonnalisées spécimens conformément à la réglementation de l&#39;Office Université Stanford recherches sur l&#39;observation. 1. Sélection d&#39;une ligne (s) de cellules du cancer du sein <ol><li> Obtenir ou transfecter la lignée cellulaire de cancer du sein souhaitée (s) avec une construction de rapporteur de la luciférase-GFP. Les expériences suivantes ont été effectuées en utilisant le MDA-MB-231 et MCF-7 du cancer du sein lignées cellulaires conçus pour l&#39;expression stable de la luciférase de luciole (USLC) et le renforcement de la protéine fluorescente verte (EGFP) par transfection avec la Belle au Bois Dormant transposon plasmide pKT2 / Lubig et le plasmide pK transposase / Hubic-SB11 45,46. REMARQUE: Les lignées de cellules transfectées sont désignés comme MDA-MB-231-Fluc-EGFP, et MCF-7-Fluc-EGFP. </li></ol> 2. Isoler tissus Fragments de têtes fémorales <ol><li> Après la chirurgie THR, recueillir la tête fémorale au rebut dans un récipient stérile remplie de sérum physiologique. Transférer le spécimen dans le laboratoire et de traiter dans un délai de 1-3 heures de la chirurgie. Remarque: se il ya un retard dans le traitement, le spécimen à 4 ° C. </li><li> Préparer une zone de travail en plaçant les éléments suivants sur un tapis absorbant dans une hotte à flux laminaire de culture de tissu: gants stériles, rongeur chirurgicale, pinces, bécher avec 70% d&#39;isopropanol à rincer les instruments, et les navires de culture de tissus tel que stipulé ci-dessous pour chaque type d&#39;expérience . </li><li> Le port d&#39;un gant chirurgical stérile pour maintenir la tête du fémur tour dans une main, utilisez le rongeur dans l&#39;autre main pour extraire des fragments d&#39;os trabéculaire de taille désirée (~ 2-5 mm) de l&#39;arbre supérieure exposée du fémur. Transfert des fragments d&#39;os dans le récipient de culture (par exemple, 6, 12, ou 24 puits plaque de culture tissulaire ou de la chambre de migration), en fonction du type de prolifération, colonisation ou migration expérience, telle que décrite dans les étapes 3, 4 ou 5. REMARQUE: des fragments de tissus osseux doit être récolté comme décrit ci-dessus après avoir terminé les étapes initiales pour chaque prolifération, la colonisation ou la migration test spécifique. Fragments varieront en taille comme le montre la figure 2. Les fragments peuvent être pesés avant ou après des expériences dans le but de normalisation. </li></ol> 3. Les cellules du cancer du sein Co-culture adjacentes à Fragments d&#39;os pour mesurer sein prolifération cellulaire en utilisant BLI <ol><li> Avant l&#39;expérience, préparer une suspension contenant 2 x 10 5 cellules du cancer du sein / 50 ul, et préparer des bouchons de cire osseuse pour l&#39;immobilisation de fragments d&#39;os en culture. Couper une pointe de micropipette P200 en 3 morceaux et utiliser l&#39;extrémité étroite de la plus grande pièce d&#39;une manière &quot;cookie cutter&quot; pour couper des petits (~ 35 mg) morceaux de cire osseuse. Utiliser l&#39;extrémité large de la plus petite pièce pour éjecter les bouchons de cire osseuse dans une boîte de Pétripour le stockage. </li><li> Placez un morceau de cire d&#39;os à la position de 12 heures de chaque puits et appuyez doucement avec un index stériles gantées. </li><li> Introduire à la pipette 50 ul de suspension cellulaire contenant 1 x 10 5 cellules de cancer du sein dans un milieu DMEM-10% SVF + Pen-Strep au centre de chaque puits d&#39;une plaque à 6 puits. (Variante, des cellules de semences dans un motif dispersé si désiré.) Placer la plaque dans une culture de tissu C incubateur à 37 ° pendant 45 min à promouvoir l&#39;attachement des cellules. </li><li> Placez une fragment d&#39;os sur une morceau de cire osseuse pour chaque puits expérimental et appliquer une légère pression avec le rongeur pour le fixer. Réaliser des expériences en triple telle que trois fragments d&#39;os d&#39;un spécimen THR données sont placées dans les trois premiers puits, tandis que les trois derniers puits contiennent la cire osseuse seulement comme témoins. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;une pipette de 5 ml, doucement et lentement fournir 5 ml de DMEM-10% FBS sur le côté de chaque puits afin d&#39;éviter de déloger les cellules mammaires ou des fragments d&#39;os. Placer la plaque dans un 3776; C culture tissulaire incubateur pour 20-24 h. </li><li> Pour effectuer l&#39;imagerie par bioluminescence (BLI) retirer la plaque de l&#39;incubateur et ajouter le substrat de luciférine (pour obtenir une concentration de 300 ug / ml) dans chaque puits. Image la plaque immédiatement sur une plateforme d&#39;imagerie IVIS utilisant les paramètres suivants: f-stop de 1, petite binning, temps d&#39;exposition de 1 sec, le niveau D. mesurer l&#39;intensité du signal de chaque ainsi que l&#39;éclat moyenne (photons / seconde centimètres / carré / stéradian). </li><li> Utilisez le logiciel d&#39;imagerie pour définir des régions d&#39;intérêt (ROI) pour quantifier le rayonnement moyenne pour tous les puits expérimentaux et de contrôle. valeurs de radiance moyenne à l&#39;exportation vers une feuille Excel pour effectuer des statistiques et de générer des graphiques. </li></ol> 4. Les cellules du cancer du sein Co-culture ensemencées directement sur Fragments d&#39;os pour l&#39;étude de la colonisation et du numéro de cellulaire <ol><li> Utiliser des pinces pour placer des fragments d&#39;os directement dans les puits vides d&#39;une plaque de culture tissulaire à 24 puits (1 fragment / puits). </li><li> Pépinette un 50 ul de suspension cellulaire gouttelette de DMEM-FBS à 10% contenant 1 X 3 à 6 octobre cellules de cancer du sein directement au-dessus de chaque fragment d&#39;os. Placer la plaque dans un 37 ° C incubateur de culture tissulaire pendant 45 min à promouvoir l&#39;attachement des cellules. Ajouter doucement 2.1 ml de DMEM-10% de FBS dans le côté de chaque puits de telle sorte que le fragment est entièrement immergé dans le milieu. Incuber la plaque dans un 37 ° C incubateur pour culture de tissus de 20 à 24 h. </li><li> Après incubation, utiliser une pince pour transférer chaque fragment de tissu osseux à une plaque à 24 puits fraîche contenant 1 ml de DMEM-10% de FBS dans chaque puits. Pour effectuer BLI, suivez les étapes 3.6 à 3.7 ci-dessus. En outre, les fragments peuvent être visualisés à l&#39;aide d&#39;un microscope à fluorescence, ou rincés pour obtenir la population de la moelle osseuse pour l&#39;analyse des chiffres et des propriétés cellulaires de cancer du sein comme décrit dans l&#39;étape 6. </li><li> Pour préparer les fragments intacts pour l&#39;évaluation qualitative par microscopie à fluorescence suivant BLI, pipette 5 pi de solution d&#39;étiquetage de bisphosphonate fluorescent (prépréparée selon les instructions du fabricant) dans chaque puits pour étiqueter les spicules minéralisées des fragments d&#39;os. Incuber la plaque dans l&#39;incubateur de culture tissulaire pendant 24 heures. </li><li> À la suite de 24 h de culture dans la solution de marquage de bisphosphonate fluorescent, utiliser une pince pour transférer les fragments de plaques de culture de tissu contenant du milieu dépourvu de rouge de phénol et vue l&#39;aide d&#39;un microscope à fluorescence configuré pour imager la GFP (485 nm) et l&#39;étiquette de bisphosphonate (680 nm). </li></ol> 5. Mesurer la migration des cellules de cancer du sein à des fragments de tissu osseux et de culture Fragment d&#39;os surnageants <ol><li> Migration vers le tissu osseux surnageant de culture. REMARQUE: réaliser des expériences en triple telle que trois fragments d&#39;un spécimen THR données sont utilisés pour générer trois surnageants. Pour chaque expérience, la migration est comparée dans trois puits contenant surnageants osseuses contre trois puits contenant du milieu de commande seulement. <ol><li> Générer tis osseusepoursuivre surnageants en plaçant des fragments d&#39;os dans les puits d&#39;une plaque à 12 puits contenant 2,2 ml de DMEM-10% de FBS par puits. Culture dans un 37 ° C incubateur de culture tissulaire pendant 24 heures. Retirer le milieu à 24 h et le remplacer par 2,2 ml frais DMEM-10% de FBS. Traiter les puits témoins contenant du DMEM-FBS à 10% de la même manière. NOTE: Le milieu est changé à 24 h pour éliminer les facteurs sécrétés en réponse à un traumatisme des tissus résultant d&#39;une chirurgie. Parce que les surnageants de tissu osseux sont générés dans un milieu contenant du FBS-puits contenant FBS, un milieu contenant seulement sont inclus pour contrôler la contribution de FBS à la migration de cellules de cancer du sein. </li><li> A 48 heures, de recueillir 0,9 ml de chaque / moyen et pipette de contrôle surnageant dans les puits d&#39;une plaque réceptrice. Les insertions seront ensuite placés dans ces puits. Incuber la plaque du récepteur dans le tissu incubateur de culture tout en ensemençant les inserts. Remarque: Le surnageant restant (~ 1 ml après évaporation) peuvent être collectées pour l&#39;analyse des sécrétome factors 44 si vous le souhaitez. </li><li> Pour ensemencer les inserts Transwell, placez-les dans une norme, vide de 24 puits plaque de culture de tissus. Introduire à la pipette 350 ul de suspension cellulaire contenant 1 x 10 5 cellules de cancer du sein dans du DMEM-FBS à 10% sur la surface de la membrane interne, supérieure, de chaque insert comme représenté sur la figure 1A. Placer la plaque à 24 puits contenant les inserts ensemencées dans les 37 ° C incubateur de culture tissulaire pendant 45 min pour favoriser la fixation. </li><li> Une fois que les cellules ont attaché aux inserts, utiliser une pince pour transférer les inserts à la plaque de récepteur selon les instructions du fabricant. Angle chaque insert lorsque vous les placez dans le récepteur et pour prévenir la formation de bulles entre la membrane d&#39;insertion et le récepteur ainsi surnageant. Incuber la plaque du récepteur avec des inserts pendant 20 heures dans un 37 ° C incubateur de culture tissulaire. REMARQUE: Vérifiez la partie inférieure de la plaque réceptrice de bulles entre la membrane d&#39;insertion et le récepteur ainsi supernatant. Si des bulles sont visibles, enlever les inserts spécifiques et de les placer à nouveau dans le récepteur ainsi jusqu&#39;à ce qu&#39;aucune bulle sont présents. </li><li> Après 20 heures d&#39;utilisation des forceps pour retirer les inserts de la plaque du récepteur. En utilisant les procédures décrites dans les étapes 3.6 à 3.7 à l&#39;image BLI effectuer les cellules qui ont migré dans et fixés au fond des puits de la plaque de réception. </li></ol></li><li> La migration vers les fragments de tissu osseux. REMARQUE: réaliser des expériences en triple telle que trois fragments d&#39;un spécimen THR données sont placés dans trois inserts séparés, et trois perles de verre sont placés dans trois inserts séparés comme témoins. <ol><li> Préparer la plaque réceptrice par pipetage de 0,9 ml de DMEM-FBS à 10% dans chaque puits. Placez-le dans le tissu incubateur de culture tout en préparant les inserts. </li><li> Pour ensemencer les inserts, les inverser sur la surface d&#39;une boîte de tube de centrifugeuse en plastique muni d&#39;un couvercle. Pipeter 50 uL d&#39;une suspension cellulaire de gouttelettes de DMEM-FBS à 10% contenant 1 x 10 5 cellules de cancer du sein; directly sur la surface extérieure, en bas de chaque membrane de l&#39;insert (qui est orientée vers le haut sur les inserts inversées). Couvrir la boîte de tube de centrifugeuse avec le couvercle entrouverte et de le transférer à l&#39;incubateur à 37 ° C de tissu pendant 45 min à promouvoir l&#39;attachement des cellules. </li><li> Transférer la boîte du tube de centrifugeuse pour la hotte de culture de tissus, et d&#39;utiliser une pince pour tourner les inserts ensemencées côté droit et les transférer dans les puits de la plaque réceptrice. Pipette 0,450 ml de DMEM-FBS à 10% dans chaque cupule d&#39;insertion. En utilisant des pinces, transférer un fragment de tissu osseux (~ 3 mm) dans chaque coupelle d&#39;insertion préparé. Eventuellement, utiliser des perles de verre de contrôles négatifs dans des puits supplémentaires. Placer la plaque dans un incubateur de culture de tissu pendant 20 heures. </li><li> Pour mesurer la migration, préparer une plaque de culture de tissu à 24 puits standard contenant 1 ml de DMEM-FBS à 10% par puits. Retirer la plaque du récepteur de l&#39;incubateur et utiliser des pinces pour transférer les fragments d&#39;os et perles de chaque insert dans des puits séparés de la plaque standard. Ajouter luciférinesubstrat (pour obtenir une concentration finale de 300 ug / ml) dans chaque puits et BLI effectuer en utilisant les procédures décrites dans les étapes 3.6 à 3.7. </li></ol></li></ol> 6. Les analyses pré- et post-expérimentaux supplémentaires <ol><li> Analyse de moelle rouge. <ol><li> Transférer un fragment d&#39;os dans un tamis cellulaire de 70 pm placée au sommet d&#39;un tube conique de 50 ml. Utiliser une seringue de 10 ml avec une aiguille 25 G pour rincer énergiquement le fragment avec 10 ml de PBS pour obtenir une suspension de cellules de moelle osseuse dans le tube conique. Centrifuger la suspension de cellules pendant 3 minutes à 300 x g et 21 ° C, Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans du PBS ou tout autre solution souhaitée pour la cytométrie de flux. REMARQUE: Les volumes de remise en suspension varie en fonction de la taille du culot de cellules après centrifugation, et l&#39;application. </li><li> Pour les tests de viabilité ~ 75-300 volumes ul de PBS sont appropriées, et ces suspensions peuvent être analysées à l&#39;aide disponible dans le commerce fluorescence essais de viabilité en fonction selon les instructions du fabricant, à la pipette dans un hémocytomètre classique, et comptées en utilisant un microscope à fluorescence inversé. </li><li> Pour l&#39;analyse par cytométrie de flux ou tri basé sur la détection de cellules de cancer du sein positives à GFP, remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de PBS contenant 2% de FBS, 2 mM d&#39;EDTA et 10 mM de HEPES de telle sorte que la concentration est de 1 x 10 6 cellules / ml. </li></ol></li><li> Coloration H &amp; E et immunohistochimie. <ol><li> Pour traiter les fragments pour hématoxyline &amp; éosine (H &amp; E) coloration et / ou immunohistochimie, placer les fragments de cassettes plastique étiquetés avec un crayon numéro 2, et plonger dans un récipient rempli de formol à 10% tamponnée pendant 24 heures. </li><li> tissus de procédé pour inclusion dans la paraffine, de sectionnement et de la coloration en utilisant des protocoles de routine qui comprennent une étape de décalcification pour tenir compte des spicules minéralisées dans chaque fragment. </li></ol></li></ol>

Aucune divulgation à signaler.

Mehra et al. Ont déjà décrit la collecte et l&#39;analyse des échantillons d&#39;os post-mortem de patients métastatiques de cancer de la prostate récoltés au moment de l&#39;autopsie, révélant des tissus de haute qualité et de valider l&#39;utilisation des échantillons d&#39;os humains pour étudier le processus métastatique 47. Ici, nous avons décrit les protocoles pour la collecte, le traitement et l&#39;utilisation de fragments de tissus osseux humains obtenus à partir de têtes fémorales au rebut ...

Le microenvironnement tumoral est largement reconnue comme un facteur déterminant du comportement des cellules cancéreuses lors de la progression du cancer du sein métastatique et réparties 1-3. Le but de la méthode présentée ici est de faciliter l&#39;étude des cellules de cancer du sein dans le microenvironnement du tissu osseux humain, le site le plus fréquent des métastases du cancer du sein 06/04. L&#39;os est constitué de compartiments minéralisées et moelle 7-9, qui abritent les deux cellules et les facteurs sécrétés impliqués dans la progression métastatique 10,11. Bien que largement utilisé dans des modèles murins in vivo faciliter les études systémiques du processus métastatique 12-15, interactions cellulaires dans le squelette ne sont pas facilement accessibles pour l&#39;observation et la perturbation directe. systèmes de modèle pour l&#39;étude et la culture de tissus osseux de la souris et des cellules de moelle de souris fournissent un meilleur accès et ont donné de nombreuses idées concernant la diaphonie et les mécanismes sous-jacents cellules du cancer du sein metastasis du squelette murin 16-22. Cependant, des études ont suggéré qu&#39;il pourrait y avoir des motifs spécifiques aux espèces de ostéotropisme pour le tissu osseux 23,24. Ces modèles pourraient refléter espèces spécifiques inhérents différences dans les propriétés du tissu osseux, les différences résultant de populations de moelle osseuse altérées chez des souris immunodéficientes 11, et / ou l&#39;âge relativement jeune de souris utilisés dans des expériences, qui sont tous des déterminants probables de l&#39;os microenvironnement. Approches in vitro pour étudier les cellules du cancer du sein dans l&#39;os co-cultures humaines ont généralement porté sur des types de cellules osseuses spécifiques tels que les ostéoblastes dérivées de la moelle ou de cellules stromales cultivées en monocouches ou dans des systèmes modèles en 3 dimensions modifiées 25-35. Bien que les modèles de culture cellulaires deux dimensions ont formé le pilier de approches in vitro pour la recherche sur le cancer, il est reconnu depuis longtemps que le comportement de la cellule est fondamentalement modifiée en monolayer systèmes de culture 18,36,37. Cela a conduit au développement de micro-environnements modifiés qui imitent la complexité des tissus vivants trois dimensions, y compris matriciel et modèles basés échafaudage sont constitués de matières naturelles, telles que le collagène, ou des polymères synthétiques ensemencées avec des types de cellules spécifiques pour créer des micro-environnements de tissu ressemblant 36-41. Les approches d&#39;ingénierie ont également inclus l&#39;utilisation de plates-formes de bioréacteurs pour contrôler et étudier le milieu hormonal du microenvironnement 18,19,41-43. Bien que les modèles et les bioréacteurs biomimétiques fournissent de nombreux éléments d&#39;un microenvironnement des tissus complexes dans un environnement contrôlé, et ont été appliquées avec succès pour faire progresser l&#39;étude des métastases du cancer du sein à l&#39;os 18,19,35,42,43, systèmes modèles d&#39;ingénierie ne intègrent généralement pas la gamme complète de types de cellules et de composants de la matrice extracellulaire présents dans l&#39;environnement de l&#39;os natif. Jusqu&#39;à récemment, le cancer du seincellules ne ont pas été étudiés dans le, intacte microenvironnement natif, trois dimensions des tissus osseux humains. Nous avons récemment rapporté le développement d&#39;un modèle de co-culture en utilisant des fragments de tissus osseux humains isolés à partir de prothèse totale de hanche (PTH) Chirurgie spécimens 44. Ces spécimens abritent les deux compartiments minéralisées et de moelle osseuse nécessaires pour étudier les mécanismes sous-jacents de micro-métastases dans la culture à court terme. Dans des travaux antérieurs, nous avons établi la preuve de principe pour l&#39;utilisation de l&#39;imagerie par bioluminescence (BLI) de surveiller la prolifération des cellules du cancer du sein exprimant la luciférase (MDA-MB-231-Fluc) co-cultivées avec des fragments d&#39;os 44. Ici, nous présentons détaillons protocoles expérimentaux pour étudier la prolifération des cellules du cancer du sein, de la colonisation et de la migration dans le contexte du microenvironnement natif utilisant des explants de tissus osseux humain. Nous présentons d&#39;abord un protocole de cellules de cancer du sein co-culture adjacents à des fragments d&#39;os pour mesurer seinla prolifération cellulaire en utilisant BLI. Dans cette section, des suspensions de cellules du sein sont ensemencées sous forme de taches de cellules dans des plaques à 6 puits adjacents à des fragments d&#39;os, qui sont immobilisées par des morceaux de cire osseuse. Les puits témoins contiennent de la cire d&#39;os, mais pas de fragment d&#39;os. Une fois les taches de cellules attachent, milieu est ajouté et la plaque est mise en culture pendant 24 heures, après quoi l&#39;intensité du signal bioluminescent (associée avec le nombre de cellules) est mesuré avec BLI. Dans l&#39;étape suivante, nous présentons des procédés pour les cellules cancéreuses du sein co-culture ensemencés directement sur les fragments d&#39;os à étudier la colonisation et la prolifération. Ici, les suspensions de cellules du sein sont déposés à la pipette directement sur les fragments de tissus osseux, qui sont suivis dans la culture par BLI et la microscopie de fluorescence au cours du temps pour suivre la colonisation et le nombre de cellules. Dans ce procédé, le compartiment de moelle peut être envoyé à partir des fragments d&#39;os à ne importe quel point dans le temps pour l&#39;analyse de cellules du cancer du sein colonisés par cytométrie en flux, ou des dosages de viabilité de la moelle osseuse. En outre, on describe deux approches différentes pour la mesure de la migration des cellules du cancer du sein. Dans la première méthode étapes sont décrites pour mesurer la migration vers les tissus osseux surnageants de culture. Dans ce protocole, les cellules de cancer du sein sont ensemencées sur les surfaces supérieures intérieures, d&#39;insérer des membranes Transwell avec une taille de pores de 8 um (comme représenté sur la figure 1A). Les inserts sont ensuite placés dans une plaque de réception avec des puits contenant des tissus osseux surnageant ou le milieu de contrôle. Au cours d&#39;une période d&#39;incubation de 20 h, un petit nombre de cellules cancéreuses du sein migrent à travers les membranes d&#39;insertion vers le bas dans les puits de culture de tissus inférieurs où ils se fixent pour la détection par BLI. Dans la seconde méthode de migration des cellules de cancer du sein sont ensemencées sur les surfaces extérieures inférieures, de membranes d&#39;insert Transwell. des fragments de tissu osseux sont placées dans les cupules d&#39;insertion et les cellules de cancer du sein migrent à travers les membranes à coloniser les fragments d&#39;os (comme représenté sur la figure 1B), quisont ensuite imagé en utilisant BLI.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Compléter tous les DMEM avec 10 % de sérum de bovin fœtal et 1 % de Pen/Strep</td></tr><tr><td>McCoy’s 5A Medium (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>16600-082</td><td>Compléter tous les McCoy’s avec 10 % de sérum de bovin fœtal et 1 %</td></tr> de <tr><td>sérum de veau fœtal</td> Pen/Streptophyque <td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillen Streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Blastocidine (10 mgl/ml)</td><td>InvivoGen&nbsp ;</td><td>ant-bl</td><td>Milieu de supplément utilisé pour les lignées cellulaires transfectées.</td></tr><tr><td>Faucon&reg ; Inserts de culture cellulaire pour plaque à 24 puits avec membrane PET transparente (8.0 &mu ; taille des pores)</td><td>Corning Incorporated</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&reg ; 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de viabilité/cytotoxicité *pour cellules de mammifères*</td><td>Invitrogen Detection Technologies</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>D-luciférine luciole, sel de potassium 5 g (30 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>Passoire à cellules stériles 70 &mu ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>6 Grappe de cultures cellulaires bien traitée par TC Corning</td><td>Incorporated</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>12 Grappe de cultures cellulaires bien traitée par TC</td><td>Corning Incorporated</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24 Grappe de cultures cellulaires bien traitée par TC</td><td>Corning Incorporated</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Cire osseuse</td><td>Surgical Specialties Corporation</td><td>903</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 50 Plate-forme d’imagerie</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software Program&nbsp ;</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td><td>133026</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Imaging System</td> Life <td>Technologies</td><td>Version 4.2</td><td></td></tr><tr><td>OsteoSense 680 EX</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7 cellules cancéreuses du sein</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cellules cancéreuses du sein</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Souris monoclonale anti-cytokératine humaine clone</td> de <td>cytomation DAKO</td><td>(AE1/AE3)</td><td></td></tr></tbody></table>

méthodes pour explants de tissus en culture fémur humain pour étudier le cancer du sein cellulaire colonisation de la niche métastatique

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

L&#39;os est le site le plus courant de métastase de cancer du sein. Même se il est largement admis que le comportement cellulaire influences microenvironnement de cancer, on en sait peu sur les propriétés et comportements de cellules de cancer du sein dans le microenvironnement natif du tissu osseux humain. Nous avons développé des approches pour suivre, de quantifier et de moduler les cellules cancéreuses du sein humain dans le microenvironnement de fragments humains en culture de tissus osseux isolés à partir de têtes fémorales rebut suivants arthroplasties totales de la hanche. En utilisant des cellules de cancer du sein d&#39;ingénierie pour la luciférase et améliorés protéine fluorescente (EGFP) expression vert, nous sommes en mesure de quantifier de façon reproductible les schémas de migration et de prolifération utilisant l&#39;imagerie par bioluminescence (BLI), les interactions cellulaires de piste dans les fragments d&#39;os en utilisant la microscopie de fluorescence, et d&#39;évaluer les cellules mammaires après colonisation par cytométrie de flux. Les principaux avantages de ce modèle sont les suivants: 1) un MicroE de tissu natif, l&#39;architecture intactenvironnement qui comprend les types pertinents de cellules humaines, et 2) l&#39;accès direct à la micro, ce qui facilite quantitative rapide et suivi qualitatif et la perturbation du sein et de cellules osseuses propriétés, les comportements et interactions. Une limitation principale, à l&#39;heure actuelle, la viabilité est finie de fragments de tissus, qui confine la fenêtre d&#39;études de culture à court terme. Les applications du système de modèle comprennent l&#39;étude de la biologie fondamentale du cancer du sein et d&#39;autres tumeurs malignes ostéotropes l&#39;intérieur de la niche métastatique, et le développement de stratégies thérapeutiques pour cibler efficacement les cellules de cancer du sein dans les tissus osseux.

Isoler des fragments de tissus provenant de têtes fémorales Têtes fémorales ont été prélevés sur un nombre égal de patients de sexe féminin (44-90 ans) qui subissent une chirurgie de remplacement total de la hanche élective dans le département de chirurgie orthopédique à l&#39;École de médecine de l&#39;Université Stanford et masculins. Chaque tête fémorale jeté contient une petite portion de la partie supérieure du fémur, qui abrite tissu osseux trabéculaire composé de spicules minéralisées...

Les protocoles sont décrits pour l&#39;étude de la migration des cellules de cancer du sein, de la prolifération et de la colonisation dans un système de modèle d&#39;expiant de tissu osseux humain.

Méthodes pour explants de tissus en culture fémur humain pour étudier le cancer du sein cellulaire colonisation de la Niche métastatique

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

L'objectif de cette procédure est d'étudier la prolifération, la colonisation et la migration des cellules cancéreuses du sein dans un modèle de système d'explants de tissu osseux humain. Cela est réalisé en isolant des fragments de tissu osseux trabéculaire à partir de prélèvements chirurgicaux de tête fémorale et en les cultivant avec des cellules cancéreuses du sein exprimant la luciférase et la protéine verte fluorescente. L'imagerie bioluminescente est utilisée pour mesurer la prolifération cellulaire et confirmer la colonisation des cellules cancéreuses du sein dans les fragments de tissu osseux.Les schémas de colonisation des cellules cancéreuses du sein sont visualisés par microscopie à fluorescence. Le compartiment médullaire peut être éliminé par lavage à partir des fragments pour une analyse par cytométrie en flux, ainsi que par des tests de luminescence et de coloration. La migration des cellules cancéreuses du sein vers des surnageants de culture tissulaire et des fragments de tissu osseux est mesurée dans des chambres de migration Transwell avec imagerie de bioluminescence. L'os constitue le site le plus fréquent de métastases du cancer du sein, et ce modèle offre finalement une nouvelle fenêtre d'observation pour l'étude des cellules cancéreuses du sein au sein du niché métastatique osseux.Un grand avantage de ce modèle est qu'il permet un accès direct au microenvironnement de fragments de tissu osseux humain, ce qui nous permet d'observer et d'analyser facilement le comportement des cellules cancéreuses du sein lors d'expériences de co-culture à court terme. Cette méthode peut être utilisée pour étudier des questions clés concernant les mécanismes sous-jacents au cancer du sein et aux métastases osseuses, dans le but d'identifier des stratégies thérapeutiques permettant de prévenir et de traiter efficacement cette maladie. Bien que ce modèle puisse fournir des informations sur la métastase du cancer du sein, il peut également être utilisé pour étudier d'autres tumeurs osseuses, telles que le cancer de la prostate.Des fragments de tissu osseux doivent être prélevés à différents moments au cours de chaque essai. Cette procédure commence par la collecte et le transport d'un spécimen fémoral dans du sérum physiologique, ainsi que par la préparation du poste de travail dans une hotte de sécurité biologique portant un gant chirurgical. Saisissez la tête du fémur d'une main et utilisez un outil chirurgical pour extraire l'os trabéculaire.Les fragments mesurent environ deux à cinq millimètres de taille. Les pinces ne conviennent pas pour cette étape. Vous avez besoin d'un bon bistouri chirurgical.Pour cette expérience, préparez une suspension de cellules de cancer du sein contenant 100 000 cellules par 50 microlitres de DMEM supplémenté de 10 % de FBS. En outre, préparez des bouchons de cire osseuse pour mobiliser les fragments osseux à l’aide des extrémités coupées d’une pipette micropipette, et conservez les bouchons dans une boîte de Pétri. Ensuite, à l’aide de pinces, transférez les bouchons dans une plaque de six puits et, à l’aide d’un gant stérile, appuyez-les en position 12 heures.Ensuite, prélevez à la pipette 50 microlitres de la suspension cellulaire au centre de chaque puits. Placez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pendant 45 minutes afin de favoriser l'attachement cellulaire, pendant que la plaque incube, extrayez les fragments osseux avec les cellules attachées à la plaque. Placez un fragment de tissu osseux sur la cire à os dans trois puits et appuyez doucement sur chacun à l’aide du GER ; les trois puits sans fragments serviront de témoins.Ensuite, ajoutez lentement cinq millilitres de DMEM supplémenté de 10 % de FBS sur la paroi de chaque puits. Le cire osseuse et les fragments osseux ne doivent pas être délogés. Incubez ensuite la culture pendant 20 à 24 heures.Le lendemain, commencez par imager les cellules. Ajoutez 300 microgrammes par millilitre de luciférine dans chaque puits, puis imager immédiatement la plaque à l’aide d’une plateforme d’imagerie Ivis. Cette expérience nécessite une suspension de cellules de cancer du sein similaire à la précédente.Après avoir extrait les fragments osseux, utilisez une pince pour transférer chaque fragment dans un puits vide d'une plaque 24 puits, puis pipetez 50 microlitres de suspension cellulaire directement sur chaque fragment osseux, et transférez la plaque dans une étuve pendant 45 minutes afin de favoriser l'attachement cellulaire. Une fois les cellules attachées, ajoutez doucement un à deux millilitres de milieu dans chaque puits, suffisamment pour immerger le fragment osseux. Ensuite, placez la plaque dans l'incubateur de culture tissulaire pendant 20 à 24 heures.En prévision de l'imagerie Ivis, de l'imagerie de fluorescence ou de la collecte de cellules médullaires pour analyse en imagerie Ivis, transférez les fragments osseux dans une plaque de 24 puits contenant un millilitre de milieu frais par puits. Ajoutez 300 microgrammes par millilitre de Lucifer à chaque puits, puis procédez comme décrit précédemment pour la microscopie à fluorescence. Prélevez cinq microlitres de solution marquée au bisphosphonate fluorescent et ajoutez-les dans chaque puits afin de marquer les spicules osseuses des fragments osseux, puis incubez la plaque pendant encore 24 heures.24 heures plus tard, utilisez une pince pour transférer les fragments vers des plaques contenant un milieu sans rouge de phénol. Ensuite, observez les plaques à l’aide d’un microscope à fluorescence configuré pour l’imagerie à 485 nanomètres afin de localiser les cellules cancéreuses du sein exprimant la GFP colonisant les spicules osseuses marquées au bisphosphonate, et à 680 nanomètres pour identifier les spicules osseuses marquées au bisphosphonate. Rincez le compartiment de la moelle osseuse pour analyser le nombre ou les propriétés des cellules.Transférez un fragment dans un tamis de 70 micromètres placé au-dessus d'un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, utilisez une seringue de 10 millilitres munie d'une aiguille de 25 gauge pour rincer vigoureusement le fragment avec 10 millilitres de PBS. Centrifugez la suspension à 300 ×g pendant trois minutes à température ambiante afin de former un culot cellulaire, puis aspirez et jetez le surnageant.Pliez le culot de cellules médullaires dans du PBS ou toute autre solution souhaitée pour des analyses par cytométrie en flux ou des tests de viabilité. Commencez par générer un réseau de tissu osseux. Placez les fragments osseux dans les puits d'une plaque de 12.Plaque de culture contenant 2,2 millilitres de DMEM avec 10 % de FBS par puits et laisser quelques puits témoins sans fragments osseux. Incuber la plaque pendant 24 heures. Puis aspirer et remplacer le milieu, puis poursuivre la culture pendant encore 24 heures ; au bout de 48 heures de culture, transférer 0,9 millilitre de surnageant dans une plaque réceptrice tout en incubant temporairement la plaque réceptrice.Placer les inserts de transwell dans une plaque 24 puits vide. Ensuite, semer 100 000 cellules de cancer du sein dans 350 microlitres sur chaque insert. Puis cultiver les plaques pendant 45 minutes afin de favoriser l'attachement cellulaire. Après 45 minutes, utiliser des pinces pour transférer les inserts vers une plaque réceptrice.Veillez à incliner les inserts lors de leur placement dans le récepteur. Supinez bien afin d'éviter la formation de bulles. Incubez ensuite la plaque avec les inserts pendant 20 heures à 37 degrés Celsius le lendemain.Utilisez une pince pour retirer les inserts et ajoutez 300 microgrammes par millilitre de Lucifer dans chacun. Réalisez une imagerie de bioluminescence sur la plaque réceptrice afin de détecter les cellules cancéreuses du sein qui ont migré à travers les membranes et qui se sont fixées au fond des puits de la plaque réceptrice. Commencez par charger une plaque réceptrice avec du milieu et placez-la dans l'incubateur de culture tissulaire.Pour ensemencer les inserts, retournez-les dans une boîte vide pour tubes microfusés avec couvercle. Ajoutez ensuite 100 000 cellules en 50 microlitres sur la surface inférieure externe de chaque membrane d'insert.Couvrez la boîte en laissant le couvercle entrouvert et incubez les inserts pendant 45 minutes dans l’incubateur de culture tissulaire. Ensuite, utilisez une pince pour retourner et transférer les inserts, ainsi que les puits d’une plaque réceptrice, dans chaque cupule d’insert contenant 0,45 millilitre de DMEM avec 10 % de FBS. Ajoutez ensuite un fragment osseux de trois millimètres ou une bille de verre dans chaque insert et incubez la plaque pendant 20 heures.Le lendemain, utilisez une pince pour transférer les fragments et les billes vers une plaque dont les puits contiennent un millilitre de milieu frais. Ajoutez 300 microgrammes par millilitre de Lucifer par puits, puis procédez à l'imagerie de bioluminescence. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.Des cellules cancéreuses du sein ont été cultivées en co-culture à proximité de fragments osseux immobilisés afin de mesurer la prolifération des cellules mammaires. Une imagerie par bioluminescence après 24 heures de culture a révélé une prolifération accrue des cellules cancéreuses du sein en présence de fragments osseux dans les trois puits supérieurs, comparativement à l'absence de fragments osseux dans les trois puits inférieurs. Les résultats d'expériences utilisant des fragments provenant de trois spécimens chirurgicaux distincts ont montré une prolifération accrue en présence d'os par rapport à son absence.Dans les trois cas, une colonisation des cellules MCF seven F Luke EGFP situées directement sous les fragments de tissu osseux a été observée par imagerie bioluminescente après 24 heures. Une diminution du signal a été associée à une densité d'ensemencement décroissante après 48 heures. Les fragments ensemencés directement et marqués avec un réactif bisphosphonate ont révélé une colonisation des cellules cancéreuses du sein positives pour la GFP au sein des compartiments minéralisés et médullaires.La migration des cellules de cancer du sein à travers la membrane poreuse vers la culture de tissu osseux, les surnageants observés dans les trois puits supérieurs étaient importants par rapport à la migration dans le contrôle. Milieu observé dans les trois puits inférieurs. Une migration vers trois fragments osseux provenant d'un même échantillon de PTH a également été observée, tandis qu'aucune migration sur les billes n'a été observée.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment extraire des fragments de tissu osseux humain à partir d'un spécimen de tête fémorale et les initier dans des essais de co-culture afin de mesurer les comportements des cellules cancéreuses du sein, notamment la migration, la colonisation et la prolifération.

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Culture à long terme des spécimens humains de cancer du sein et leur analyse en utilisant la tomographie optique de projection

Cette vidéo décrit la culture de cellules cancéreuses du sein adjacentes à des explants osseux de fémur pour mesurer la prolifération et la colonisation des cellules cancéreuses dans un système modèle d’explant de tissu osseux humain.

Co-culture de cellules BC : Culture de cellules cancéreuses du sein avec des fragments d’os pour étudier la prolifération des cellules cancéreuses

Dans les procédés de culture standards cellules sont retirées de leur environnement physiologique et cultivées sur la surface en plastique d'un plat. Pour étudier le comportement de cellules primaires de moelle osseuse humaine, nous avons créé un système de culture en 3-D, où les cellules sont cultivées dans des conditions récapitulant le microenvironnement du tissu natif.

A Tissue Culture Modèle tridimensionnel pour étudier primaire moelle osseuse humaine et de ses affections malignes

Culture de cellules primaires en utilisant organites intacts de tissu fournit un système modèle qui imite le microenvironnement in vivo multicellulaire. Nous avons développé un modèle de culture primaire de tissu d'épithélium mammaire sans sérum qui perpétue mixtes lignées de culture cellulaire et des expositions morphologie différenciés, sans interruption de tissu enzymatique. organites mammaires restent viables pendant&gt; 6 mois.

Non enzymatique, sans sérum de culture de tissus de lésions mammaires pré-invasives pour la génération spontanée de mammospheres

Ici, nous présentons un protocole de co-culture en trois dimensions, qui est utile pour étudier les interactions multicellulaires et la modulation dépendante de la matrice extracellulaire du comportement des cellules cancéreuses. Dans ce modèle expérimental, les cellules cancéreuses sont cultivées sur des gels de collagène intégrés à des fibroblastes humains associés au cancer.

En trois dimensions modèle de co-culture tumeur stromale-Interaction

Ce manuscrit décrit un système modèle ex vivo composé de milieux conditionnés par des organes dérivés des ganglions lymphatiques, des os, des poumons et du cerveau de souris. Ce système modèle peut être utilisé pour identifier et étudier les facteurs solubles dérivés d’organes et leurs effets sur le tropisme des organes et le comportement métastatique des cellules cancéreuses.

Génération des médias et applications Organ-conditionnés pour l&#39;étude Influences spécifiques d&#39;organes sur le cancer du sein métastatique Comportement

Les cellules cancéreuses sont intégrées dans un gel de collagène, puis prises en sandwich dans un gel de fibrine acellulaire pour générer un système de culture 3D dans lequel le caractère invasif et la formation de tumeurs satellites peuvent être surveillés.

Three-Dimensional Culture Assay pour explorer des cellules cancéreuses invasives et Tumor Satellite Formation

Ce protocole expérimental décrit l’isolement des CSCA à partir d’échantillons de cellules et de tissus cancéreux du sein ainsi que les tests in vitro et in vivo qui peuvent être utilisés pour évaluer le phénotype et la fonction des CSBC.

Isolement et évaluation fonctionnelle des cellules souches du cancer du sein humain à partir d’échantillons de cellules et de tissus

Le manuscrit décrit une méthodologie pour l’établissement ainsi que le suivi longitudinal de la croissance des métastases pulmonaires spontanées à partir de tumeurs mammaires injectées orthotopiquement, susceptible d’intervention à tous les stades de la cascade métastatique.

In vivo Imagerie pour mesurer les métastases pulmonaires spontanées de cellules tumorales mammaires injectées orthotopiquement

Il existe un besoin critique de modèles de cancer 3D qui capturent la diaphonie hétérocellulaire pour étudier les métastases cancéreuses. Notre étude présente la génération d’épithélium stromal hétéromulticellulaire dans un environnement sans échafaudage qui peut être utilisé pour étudier l’invasion et les distributions spatiales cellulaires.

Cellules stromales hétéromulticellulaires dans des cultures 3D sans échafaudage de cellules cancéreuses épithéliales pour stimuler l’invasion

Ce protocole décrit les méthodes de culture, de manipulation et d’analyse des CAF murins, y compris les essais fonctionnels in vitro/in vivo , la transcriptomique et l’analyse informatique. De plus, il décrit une plate-forme Web développée pour analyser les transcriptomes accessibles au public de composants stromaux et épithéliales micro-disséqués par capture laser à partir d’une collection de tumeurs cancéreuses du sein humain.

Fibroblastes associés au cancer provenant de tumeurs mammaires de souris comme outils pour les études moléculaires et computationnelles

Découvrez une méthode d'explant osseux humain pour étudier la migration, la prolifération et la colonisation des cellules du cancer du sein dans la niche métastatique osseuse.

Méthodes pour explants de tissus en culture fémur humain pour étudier le cancer du sein cellulaire colonisation de la Niche métastatique (Vidéo) | JoVE Journal

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