Name: Électrorétinogramme Analyse de la réponse visuelle chez le poisson zèbre larves (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Apprenez l'électrorétinographie sur larves de Danio rerio pour évaluer la fonction visuelle in vivo. Cette méthode utilise des microélectrodes de verre et permet d'étudier l'adaptation des cônes.

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Nous remercions les membres de l’installation d’aquaculture du poisson-zèbre de l’UNC pour l’entretien du poisson-zèbre. Nous tenons également à remercier Diagnosys, LLC pour son aide dans la configuration de l’appareil ERG. Des remerciements supplémentaires vont à la Dre Portia McCoy et au laboratoire du Dr Ben Philpot pour leur aide avec les méthodes électrophysiologiques. Nous tenons également à remercier Lizzy Griffiths pour son illustration d’une larve de poisson-zèbre. Ce travail a été soutenu par les subventions F32 EY022279 (à J.D.C) et R21 EY019758 (à E.R.W. des National Institutes of Health).

l&#39;entretien des animaux et des protocoles expérimentaux ont été approuvés par les soins et l&#39;utilisation des comités institutionnels animales de l&#39;Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, et répondent à toutes les exigences de l&#39;Office NIH de laboratoire bien-être animal et de l&#39;Association pour l&#39;évaluation et l&#39;accréditation des animaux de laboratoire Care International. NOTE: Pour obtenir des larves pour l&#39;analyse ERG, publié protocoles pour l&#39;élevage du poisson zèbre standard et l&#39;entretien ont été employées 18. Les larves sont obtenus grâce à la sélection naturelle et logé sous un / 10 h cycle d&#39;obscurité 14 heures de lumière. Ce protocole a été optimisé pour les larves à 5-7 jours après la fécondation (DPF), mais pourrait idéalement être effectuées sur les poissons plus âgés avec de petites modifications de la procédure. Ici, utilisez la souche TL de type sauvage larves de poisson zèbre à 5 dpf. 1. Micropipette production <ol><li> Tirez plusieurs micropipettes utilisant 1,5 x 0,86 mm (diamètre extérieur par diamètre intérieur) capillaires en verre borosilicate poli-feu avecfilament (température de fusion, 821 ° C) et un P-97 Flaming / Brown Micropipette Extracteur équipé filament boîte de chaleur. Utilisez le programme pour façonner micropipettes décrits dans le tableau 1. </li><li> Vérifiez chaque micropipette sous un microscope avec un dirigeant du réticule appropriée pour assurer que les pourboires sont de 10 à 15 m de diamètre et a un embout lisse ouverture (ie, sans bords dentelés). </li><li> Stocker soigneusement micropipettes pour prévenir les dommages de la pointe et l&#39;exposition à la poussière. Les options de stockage comprennent des boîtes de Pétri avec du ruban de laboratoire, boîtes de mousse bordée, ou disponibles dans le commerce des conteneurs de stockage de micropipette. NOTE: D&#39;autres extracteurs de micropipette et de verre capillaires peuvent être utilisés aussi longtemps que le diamètre correct de la micropipette et une pointe de haute qualité est atteint. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Pression </td><td> Chaleur </td><td> Tirer </td><td> Vitesse </td&gt; <td> Temps </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Programme pour la production de micro-pipettes l&#39;aide d&#39;un P-97 Flaming / marron Micropipette Extracteur équipé d&#39;un filament boîte de chaleur Micropipettes sont faites en utilisant 1,5 x 1,0 mm 2 (diamètre extérieur par diamètre intérieur) capillaires en verre borosilicate poli-feu avec filament. (température de fusion, 821 ° C). 2. Tampon Préparation <ol><li> Utilisation filtré, le tampon de Ringer oxygénée poisson rouge 19 dans le capillaire de micro-électrodes et pour saturer l&#39;éponge alcool polyvinylique (PVA), sur lequel les larves sont placés pour les expériences. Vous pouvez également utiliser l&#39;E3<html> médias d&#39;embryons ou solution saline équilibrée de Hank. </li><li> Préparer la solution de Ringer 10x poissons rouges comme décrit dans le tableau 2. ajuster le pH à 7,8 et stériliser l&#39;aide d&#39;un filtre de 0,22 um et stocker le 10x stock à 4 ° C. </li><li> Créer une solution de travail le jour de l&#39;expérience en diluant la solution de Ringer à 1x 10x avec de l&#39;eau distillée déminéralisée. Filtrer au moyen d&#39;un système de filtre de 0,22 um. Oxygéner par barbotage avec 95% O 2/5% CO 2 gazeux pendant 10 minutes. Couvercle de la cuvette par la suite pour se assurer que la solution reste oxygéné. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NaCl </td><td> 1,25 M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> glucose </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 mM </td></tr></tbody></table>jove_content »&gt; Tableau 2: Préparation de la solution de Ringer 10x poissons rouges. 3. Plateforme Électrorétinogramme <ol><li> Réaliser des expériences ERG sur une table anti-vibration à l&#39;intérieur d&#39;une cage de Faraday pour améliorer le rapport signal sur bruit. Fixez une plate-forme en acier personnalisé à la table anti-vibrations en utilisant les écrous hexagonaux. Placez une plate-forme en plastique mobile avec un polymère d&#39;uréthane amortisseur viscoélastique fond sur la table sous la source de lumière. </li><li> Placez la caméra avec un stand aimanté, visant vers le bas à la plate-forme en plastique mobile. Placez le micromanipulateur (qui tiendra la microélectrode d&#39;enregistrement) avec une deuxième cage aimantée à la droite de la plate-forme en plastique mobile. Assurez-vous que la caméra et micromanipulateur ne seront pas perturbés par le mouvement des autres équipements et qu&#39;ils ne bloquent pas l&#39;éclairage de la source lumineuse. </li><li> Branchez l&#39;appareil photo à un moniteur vidéo et le positionner pour voir l&#39;œil de lalarve pour placer l&#39;électrode dans la position correcte. </li><li> Assurez-vous que l&#39;installation est correctement mise à la terre avec du fil de cuivre. Pour vérifier le bruit, placer l&#39;électrode de référence et la pointe de la microélectrode d&#39;enregistrement dans une boîte de Pétri 35 mm rempli de la solution de Ringer. Vérifiez les niveaux de bruit électrique de l&#39;installation avec un oscilloscope ou d&#39;une fonctionnalité intégrée de l&#39;appareil ERG. Les niveaux de bruit ne devraient pas être plus de ± 10 mV par rapport au départ. </li></ol> 4. Préparation éponge <ol><li> Coupez un petit rectangle d&#39;éponge de PVA sec qui se ajuste bien dans un plat de 35 mm de Pétri. L&#39;épaisseur de l&#39;éponge ne doit pas être supérieure à la profondeur de la cuvette. Utilisez un couteau avec une lame de rasoir propre pour couper. </li><li> Faire une coupe supplémentaire dans l&#39;éponge pour accueillir l&#39;électrode de référence (soit une coupe peu profonde de la longueur sur le fond de l&#39;éponge ou un papillon couper verticalement à travers l&#39;une des extrémités plus petites). </li><li> Utilisez un marqueur résistant aux produits chimiquespour marquer un petit point sur l&#39;éponge (où la larve sera placé) qui peut être utilisé pour positionner la caméra vidéo. </li><li> Tremper l&#39;éponge PVA dans la solution de Ringer jusqu&#39;à saturation. Retirer et éponger rapidement sur une serviette de papier 2-3 fois. Placez l&#39;éponge dans un endroit propre 35 mm boîte de Petri. </li><li> Positionner la boîte de Pétri contenant de l&#39;éponge sur la plate-forme de matière plastique de telle sorte que la marque peut être visualisée par la caméra. </li></ol> 5. Préparation de l&#39;électrode REMARQUE: L&#39;installation se compose d&#39;un poisson zèbre électrode de référence en contact avec une solution saturée de PVA éponge de Ringer et une électrode d&#39;enregistrement en contact avec la cornée. L&#39;électrode de référence est constituée d&#39;une pastille Ag / AgCl. L&#39;électrode d&#39;enregistrement est une micro-pipette de verre tiré rempli de la solution de Ringer et détenus par un détenteur de microélectrodes contenant un fil Ag. <ol><li> Chlorure électrodes en les trempant dans 9.6% d&#39;hypochlorite de sodium (eau de Javel) pendant 5 minutes (le micr d&#39;enregistrementoelectrode fils) ou 15 min (l&#39;électrode de référence). Sécher à l&#39;air sur une Kimwipe pendant 5 min. <ol><li> Selon le style de coupe faite à l&#39;étape 4.2, placez le culot Ag / AgCl de l&#39;électrode de référence dans (pour la coupe papillon vertical) ou moins (pour la coupe peu profonde de la longueur sur le fond) l&#39;éponge. Attacher le fil d&#39;électrode de référence au système d&#39;enregistrement. </li><li> Alternativement, si la configuration ERG a des contraintes d&#39;espace ou il sont particulièrement fortes artefacts photovoltaïques de l&#39;électrode Ag / AgCl, connectez l&#39;électrode de référence à l&#39;éponge par un pont de sel et d&#39;agar pour déplacer l&#39;électrode sur le chemin de lumière. </li></ol></li><li> Fixez ~ 40 cm de tube de taille appropriée à une 5 ml non luer lock seringues. Remplir la seringue avec la solution de Ringer. titulaires de microélectrodes possédant ports de pression sont généralement livrés avec des adaptateurs pour accueillir des tubes avec des diamètres intérieurs de 1/16 &quot;, 3/32&quot;, 1/8 &quot;ou 5/32&quot;. </li><li> Remplissez un 1 ml non luer lock seringue avecLa solution de Ringer et, en utilisant un micro-fil, remplissez soigneusement le titulaire de microélectrodes. Éviter la formation de bulles. </li><li> Fixer la seringue de 5 ml à l&#39;orifice de pression du support de microélectrodes avec des tubes et l&#39;utiliser pour faire en sorte que le support de micro-électrodes est rempli de la solution de Ringer. Utilisation de la Micro-fil et de 1 ml seringue remplie de solution de Ringer, remplir le verre de micropipette de la pointe et de se assurer qu&#39;aucune bulle sont présents. </li><li> Fixez la micropipette de verre pour le titulaire de microélectrodes, en faisant attention de garder la ligne droite de fil d&#39;électrode. Une fois fixé, utilisez la seringue de 5 ml pour forcer attentivement la solution de Ringer à travers le micro-électrodes jusqu&#39;à ce qu&#39;une petite quantité de solution est visible sur la pointe. Occasionnelle de pression à la seringue (lorsqu&#39;il ne est pas appliqué à la cornée) permettra d&#39;éviter la formation de bulles d&#39;air, ainsi que des occlusions dues à la poussière ou l&#39;accumulation de sels, dans la pointe de la micropipette. <ol><li> Si la solution apparaît comme un flux, remplacer le gmicropipette lass, que l&#39;ouverture de la pointe est trop grand ou est endommagée. </li></ol></li><li> Placez délicatement la microélectrode d&#39;enregistrement dans le micromanipulateur et fixer le fil au système d&#39;enregistrement. </li></ol> 6. Analyse Électrorétinogramme NOTE: En raison de la dominance de cône de la rétine larvaire, les résultats ERG de haute qualité peuvent être obtenus lorsque les préparatifs pour l&#39;enregistrement sont effectuées sous de faibles niveaux de lumière blanche indirecte (&lt;1 lux) ou avec de courtes périodes (&lt;1 min) d&#39;intensité supérieure ( ≤250 lux) lumière de travail. Une courte période d&#39;adaptation sombre est toujours nécessaire avant l&#39;enregistrement (voir l&#39;étape 6.7). Cependant, les expériences peuvent être effectuées sous une lumière rouge ou infrarouge dim aide d&#39;une caméra sensible à l&#39;infrarouge. Toutes les expériences ont été réalisées dans (0,22 um) de l&#39;eau du système de filtration stérilisé de la Facilité UNC poisson zèbre AquaCulture mais les médias d&#39;embryons alternatives peuvent être utilisées. <ol><li> Couper des carrés de serviettes en papier mesurant environ 1cm 2. </li><li> Si la mesure de potentiel isolée du récepteur de la masse de cône, incuber 3-5 larves dans de l&#39;eau du système avec 500 pM (±) -2-4-phosphonobutyrique-amino acides (APB) pendant 5 min. REMARQUE: Pendant APB est un mélange racémique de l&#39;actif (L) et inactifs (R) formes de AP4, il est aussi efficace que la L-AP4 et est moins coûteux. </li><li> Anesthetize 3-5 larves dans de l&#39;eau du système à 0,02% (p / v) jusqu&#39;à ce que tricaïne répond pas, environ 1-2 min. </li><li> Utilisez une pipette et pipette Pasteur pompe pour transférer attentivement larves individuelle sur des carrés de serviettes en papier sous un stéréoscope dissection en utilisant un éclairage minimal (≤250 lux pour &lt;1 min). Vérifiez la position de chaque larve et choisir un candidat qui est dorsale vers le haut avec un oeil non occlus. <ol><li> Pour les enregistrements étendus (&gt; 30 min), garder la larve humide en vitrage le corps jusqu&#39;à mais ne incluant pas la tête avec 3% de méthylcellulose l&#39;aide d&#39;un pinceau fin en poils de chameau. </li></ol></li><li> En utilisant des pinces, transférer le squar de serviette en papiere avec la larve à l&#39;éponge PVA humide. <ol><li> Pour les enregistrements étendus (&gt; 30 min), appliquer un flux continu d&#39;saturé d&#39;eau 100% O 2 gaz sur la larve par barbotage du gaz à travers un airstone dans un flacon bras latéral contenant de l&#39;eau distillée. Placez le tuyau sortant du flacon bras latéral qui transporte l&#39;oxygène humidifié près de la tête de la larve. REMARQUE: L&#39;étape 6.4.1 et 6.5.1 seront pas prolonger la vie du poisson 16. </li></ol></li><li> Sous un éclairage minimal, utiliser le micromanipulateur et la caméra de positionner la pointe de microélectrodes au milieu entre le nez et extrémités caudales de l&#39;œil et appuyez doucement sur la limite dorsale de la cornée. NOTE: Le mauvais positionnement de la pointe de l&#39;électrode aux zones distales loin de la cornée peut entraîner des formes d&#39;onde ERG de polarité inversée. </li><li> Laisser larve foncé adapter pendant 5-10 min. </li><li> Enregistrez le flash de test réponses à la lumière fournie par une source de lumière LED ou stimulateur optique utilisant le avaimatériel de stimulation et l&#39;enregistrement étiquette. Réglez les paramètres de protocole tels que l&#39;intensité du flash, flash longueur, la couleur flash, l&#39;intensité de fond et couleur et les réglages de filtre pour se adapter à l&#39;expérience. </li><li> Lorsque vous avez terminé avec l&#39;expérience, euthanasier larves selon les directives de l&#39;AVMA / IACUC. </li></ol>

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<li>Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celsr3+is+required+for+normal+development+of+GABA+circuits+in+the+inner+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+genetics%22%5BJournal%5D)">Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina.</a> PLoS. genetics. 7, e1002239(2011).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans ce protocole, une procédure simple pour les enregistrements ERG de poisson zèbre larvaire est détaillé. Cette procédure permet une analyse rapide et complète de Visual function.There sont plusieurs étapes critiques tout au long de la procédure qui doit être gardé à l&#39;esprit. Les larves de poisson zèbre doit être en bonne santé avant l&#39;expérience pour éviter la mort au cours des traitements potentiels de la drogue et de se assurer des moyens de subsistance prolongée pendant les enregistrements ERG. En outre,...

L&#39;électrorétinogramme (ERG) est une méthode électrophysiologique non invasive qui a été largement utilisé en clinique pour déterminer la fonction de la rétine chez les humains. L&#39;activité électrique en réponse à un stimulus lumineux est mesuré en plaçant des électrodes d&#39;enregistrement sur la surface externe de la cornée. Les caractéristiques du modèle de stimulus et la forme d&#39;onde de réponse définissent les neurones rétiniens qui contribuent à la réponse. Cette méthode a été adaptée pour une utilisation avec un certain nombre de modèles animaux, y compris les souris et le poisson zèbre. La réponse ERG vertébrés typique a quatre composantes principales: l&#39;une d&#39;onde, qui est un potentiel de cornée négatif provenant de l&#39;activité des cellules photoréceptrices; la b-ondes, un potentiel de cornée positif dérivé de l&#39;ON cellules bipolaires; le d-ondes, un potentiel de cornée positif interprété comme l&#39;activité des cellules bipolaires OFF; et c-ondes, qui se produit quelques secondes après le b-ondes et reflète l&#39;activité dans la glie Müller et retInal épithélium pigmentaire 1-4. Références supplémentaires pour comprendre l&#39;histoire et les principes de l&#39;analyse ERG chez les humains et les animaux modèles sont le manuel en ligne, WebVision, de l&#39;Université de l&#39;Utah et des textes tels que les Principes et pratique de électrophysiologie clinique de Vision 4, 5. Danio rerio (poisson zèbre) a longtemps été privilégiée comme un modèle pour le développement des vertébrés, en raison de sa maturation et la transparence rapide, ce qui permet pour l&#39;analyse morphologique non invasive de systèmes d&#39;organes, les tests comportementaux et les deux avant et arrière écrans génétiques (pour revue, voir Fadool et Dowling 6). Larves de poisson zèbre sont prêtent très bien à la manipulation génétique et pharmacologique, qui, lorsqu&#39;il est couplé avec leur taux de fécondité élevé, en font un modèle animal excellente pour les analyses biologiques à haut débit. Le ratio plus élevé de cônes à des tiges chez le poisson zèbre larves - environ 1: 1 par rapport à des souris (~ 3% cônes) - rendent particulièrement utile pour l&#39;étude de la fonction de cône 7-9. Dans la rétine de vertébrés, cônes se développent avant 10 tiges. Fait intéressant, les cônes de poisson zèbre sont opérationnels dès 4 dpf, permettant une analyse électrophysiologique sélective des cônes à ce stade 6, 11,12. En revanche, les réponses ERG en tiges apparaissent entre 11 et 21 dpf 13. Par conséquent, larves de poisson zèbre à 4-7 servir dpf fonctionnellement comme une rétine tout-cône. Cependant, la réponse ERG photopique natif de 4-7 larves de DPF est dominée par la b-ondes. Application des agents pharmacologiques, tels que la L - (+) - 2-amino-4-phosphono-butyrique (L-AP4), un agoniste de glutamate métabotropique (mGluR6) récepteur exprimé par les cellules conductrices bipolaires, bloque efficacement la génération de la b-ondes et révèle le potentiel de masse isolée de cône du récepteur, (la «une vague») 14-17. Nous décrivons ici un simple et reliablméthode de e pour l&#39;analyse ERG en utilisant l&#39;équipement disponible dans le commerce ERG conçu pour une utilisation avec des souris qui ont été conçus pour être utilisés avec des larves de poisson zèbre. Ce système peut être utilisé sur des larves de poisson zèbre divers milieux génétiques, ainsi que ceux traités avec des agents pharmacologiques, pour aider les chercheurs à l&#39;identification des voies qui contribuent à la sensibilité visuelle et adaptation à la lumière 16 signalisation. Les procédures expérimentales décrites dans ce protocole guideront les enquêteurs dans l&#39;utilisation de l&#39;analyse ERG pour répondre à une variété de questions biologiques relatives à la vision, et de démontrer la construction d&#39;une configuration souple ERG.

<table><tbody><tr><td>Cage de Faraday</td><td>80/20 Inc</td><td>personnalisé</td><td>« Industrial Erector Set » en aluminium conçu sur mesure pour cadre de cage</td></tr> éponge <tr><td>PVA</td><td>Amazon</td><td>B000ZOWG1C</td><td>Fournit une plate-forme douce et humide pour le placement de larves de poisson-zèbre</td></tr><tr><td>150 ml Systèmes de filtres stériles</td><td>Corning</td><td>431154</td><td>Solutions de filtrage pour empêcher les petits articulés de bloquer les micropipettes</td></tr><tr><td>Espion E2</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contact</td><td>Système d’électrophysiologie modulaire capable de générer des stimuli visuels pour n’importe quel stimulateur et d’enregistrer et d’analyser numériquement les réponses à l’aide d’un logiciel propriétaire, plus d’informations sur http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Colordome</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contact Stimulateur</td><td>de lumière avec LED RGB et sources lumineuses au xénon pour Ganzfeld ERG, plus d’informations sur http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Drummond</td><td>3-000-024-R</td><td>Maintien et positionnement de la microélectrode d’enregistrement</td></tr><tr><td>Support annulaire magnétique</td><td>Drummond</td><td>3-000-025-MB</td><td>Maintien et positionnement de la caméra et de l’électrode de référence</td></tr><tr><td>Rallonges de câble</td><td>Grass Technologies</td><td>F-LX</td><td>Câbles de rechange femelle à mâle de 1,5 mm pour le raccordement des électrodes</td></tr><tr><td>Broche mâle à femelle Adaptateur SAFELEAD Grass</td><td>Technologies</td><td>DF-215/10</td><td>Connexion de broches de 2 mm à des broches de tête de lit 1,5</td></tr><tr><td>Cadre de moustiquaire de fenêtre (métal) et cannelure</td><td>Lowes ou Home Depot</td><td>divers</td><td>Pour la fixation d’un treillis de cuivre à l’armature de la cage de Faraday</td></tr><tr><td>Filtres Steriflip 50 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>Solutions de filtrage pour éviter que les petites articulations ne bloquent les micropipettes</td></tr><tr><td>Adaptateur BNC</td><td>Monoprice</td><td>4127</td><td>Connexion de la caméra au câble BNC</td></tr><tr><td>Câble BNC</td><td>Monoprice</td><td>626</td><td>Connexion de la caméra à l’adaptateur vidéo</td></tr><tr><td>Objectif de la caméra</td><td>Navitar</td><td>1582232</td><td>Visualisation du positionnement de la microélectrode d’enregistrement sur la cornée larvaire</td></tr><tr><td>Coupleur de caméra</td><td>Navitar</td><td>1501149</td><td>Visualisation du positionnement de la microélectrode d’enregistrement sur la cornée larvaire</td></tr><tr><td>Luna Convertisseur BNC vers VGA + HDMI</td><td>Sewell</td><td>SW-29297-PRO</td><td>Adaptateur BNC vers VGA permettant de projeter l’image de la caméra sur l’écran d’ordinateur</td></tr><tr><td>APB</td><td>Sigma</td><td>A1910</td><td>mGluR6 agoniste, bloque l’onde b permettant l’analyse du potentiel du récepteur de masse du cône isolé</td></tr><tr><td>Verre borosilicaté</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td>Verre borosilicaté poli au feu (température de mesure = 821&deg ; C) avec filament et dimensions de 1,5 mm x 0,86 mm (diamètre extérieur par diamètre intérieur)</td></tr><tr><td>P97 Extracteur flamboyant/brun</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>Pour tirer des micropipettes en verre</td></tr><tr><td>Feuille de sorbothane</td><td>Thorlabs</td><td>SB12A</td><td>Polymère synthétique viscoélastique à base d’uréthane, placé sous des supports d’isolation passive et une plate-forme ERG pour absorber les chocs et éviter de glisser, peut être coupé sur mesure</td></tr><tr><td>Planche à pain</td><td>Thorlabs</td><td>B2436F</td><td>Plaque d’isolation des vibrations pour stimulateur ERG et spécimen</td></tr> <tr><td>de poisson zèbreSupports d’isolation passive</td><td>Thorlabs</td><td>PWA074</td><td>Fournit une isolation des vibrations à la plaque d’essai</td></tr><tr><td>Maille de cuivre</td><td>TWP</td><td>022X022C0150W36T</td><td>Pour aligner la cage de Faraday</td></tr><tr><td>Pompe à pipette</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td>Utilisée avec les pipettes Pasteur pour transférer avec précaution les larves de poisson-zèbre</td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>Utilisée avec la pompe à pipette pour transférer avec précaution les larves de poisson-zèbre</td></tr><tr><td>Caméra</td><td>Watec</td><td>WAT-902B</td><td>Visualisation du positionnement de la microélectrode d’enregistrement sur la cornée larvaire</td></tr><tr><td>Tricaïne (MS-222)</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-S</td><td>Anesthésique de qualité pharmaceutique,Micro-fil</td></tr> <tr><td></td><td>WPI</td><td>MF28G-5</td><td>Remplissage du porte-microélectrode et du verre de microélectrode</td></tr><tr><td>Porte-microélectrode</td><td>WPI</td><td>MEH2SW15</td><td>Maintient la microélectrode en verre, se connecte à l’équipement ERG</td></tr><tr><td>Électrode de référence</td><td>WPI</td><td>DRIREF-5SH</td><td>Cassez soigneusement le dernier centimètre du boîtier pour drainer l’électrolyte et exposer l’électrode à granulés Ag/AgCl frittée</td></tr><tr><td>Électrode de référence (alternative)</td><td>WPI</td><td>EP1</td><td>Alternative à DRIREF-5SH. Électrode Ag/AgCl qui doit être câblée/soudée au fil de raccordement</td></tr><tr><td>Câble silencieux pour support de microélectrode</td><td>WPI</td><td>13620</td><td>Raccordement du support de microélectrode d’enregistrement à l’adaptateur/tête de lit</td></tr></tbody></table>

Électrorétinogramme analyse de la réponse visuelle chez le poisson zèbre larves

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

L&#39;électrorétinogramme (ERG) est une méthode non invasive électrophysiologique pour déterminer la fonction rétinienne. Grâce à la mise en place d&#39;une électrode sur la surface de la cornée, l&#39;activité électrique généré en réponse à la lumière peut être mesurée et utilisée pour évaluer l&#39;activité des cellules rétiniennes in vivo. Ce manuscrit décrit l&#39;utilisation de l&#39;ERG pour mesurer la fonction visuelle chez le poisson zèbre. Poisson zèbre ont longtemps été utilisé comme un modèle pour le développement des vertébrés raison de la facilité de la suppression de gènes par des oligonucléotides morpholino et la manipulation pharmacologique. A 5-10 dpf, seuls les cônes sont fonctionnelles dans la rétine des larves. Par conséquent, le poisson zèbre, la différence d&#39;autres animaux, est un puissant système modèle pour l&#39;étude de la fonction visuelle cône in vivo. Ce protocole utilise l&#39;anesthésie standard, micromanipulation et protocoles stéréomicroscopie qui sont communs dans les laboratoires qui effectuent des recherches de poisson zèbre. Les méthodes décrites font usage de l&#39;équation d&#39;électrophysiologie normeATION et une caméra basse lumière pour guider le placement du micro-électrodes d&#39;enregistrement sur la cornée larvaire. Enfin, nous démontrons comment un ERG stimulateur / enregistreur disponible dans le commerce à l&#39;origine conçu pour une utilisation avec des souris peut facilement être adapté pour une utilisation avec le poisson zèbre. ERG de poisson zèbre larves fournit une excellente méthode de dosage cône fonction visuelle chez les animaux qui ont été modifiés par injection d&#39;oligonucléotides morpholino ainsi que des techniques d&#39;ingénierie des génomes plus récents tels que Zinc Finger nucléases (ZFN), Transcription Activator-Like effecteur nucléases (TALENs), et cluster régulièrement espacées courtes répétitions palindromiques (CRISPR) / Cas9, qui ont tous fortement augmenté l&#39;efficacité et l&#39;efficacité du ciblage de gène chez le poisson zèbre. En outre, nous profitons de la capacité des agents pharmacologiques pour pénétrer larves de poisson zèbre pour évaluer les composants moléculaires qui contribuent à la photoréponse. Ce protocole décrit une configuration qui peut être modifié et utilisé par les chercheursavec différents objectifs expérimentaux.

Typiquement, ERG sont enregistrées à partir de larves de poisson zèbre à 5 dpf, depuis un certain nombre d&#39;études ont publié des enregistrements ERG à ce stade neuf, 16,20. Réponses larvaires ont été mesurés dans des conditions adaptés à l&#39;obscurité sans éclairage de fond en utilisant un stimulus 20 msec de lumière LED blanche. Nous avons utilisé un système ERG disponible dans le commerce constitué d&#39;un stimulateur de lumière Ganzfeld et l&#39;ordinateur contrôleur / enregistreur. Le stimulateur u...

Nous présentons une méthode pour l’analyse électrorétinographique (ERG) des larves de poisson-zèbre en utilisant des techniques de micromanipulation et d’électrorétinographie. Il s’agit d’une méthode simple et directe pour mesurer la fonction visuelle des larves de poisson-zèbre in vivo.

Électrorétinogramme Analyse de la réponse visuelle chez le poisson zèbre larves

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

L'objectif général de cette procédure est d'illustrer les étapes nécessaires pour effectuer une analyse électrographique sur des larves de poisson zèbre. Cette analyse est réalisée en premier lieu en fabriquant des micro-pipettes en verre de forme et de taille appropriées. La deuxième étape consiste à installer soigneusement le matériel essentiel à l'expérience, tel que les électrodes de référence et d'enregistrement.Ensuite, le poisson-zèbre larvaire est anesthésié et correctement orienté par rapport à l'équipement de stimulation et d'enregistrement. La dernière étape consiste à placer correctement l'électrode microscopique en verre sur la cornée du poisson-zèbre larvaire. En fin de compte, le poisson-zèbre larvaire.L'analyse ERG est utile pour étudier la fonction visuelle des cônes dans la rétine vertébrée entièrement constituée de cônes, in vivo. Cette méthode est très utile pour répondre à des questions clés dans le domaine des sciences de la vision, telles que l'identification des voies de signalisation qui contribuent à la sensibilité visuelle et à l'adaptation à la lumière dans les cônes. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car le positionnement correct de l'électrode microscopique d'enregistrement sur l'échantillon est difficile à apprendre en raison de la petite taille de l'œil du poisson-zèbre larvaire.Pour commencer cette procédure, tirez plusieurs micropipettes en utilisant des capillaires en verre borosilicaté poli au chalumeau avec filament. Vérifiez chaque micropipette au microscope avec une règle graduée appropriée afin de vous assurer que le diamètre des embouts est compris entre 10 et 15 micromètres et qu'ils présentent un aspect régulier. Préparez une solution de travail le jour de l'expérience en diluant une solution de Ringer 10 x jusqu'à 1 x.Avec un filtre à eau distillée déionisée, stérilisez la solution afin de garantir que les particules ne bouchent pas l'extrémité de la micropipette. Ensuite, oxygénez avec un mélange de 95 % d'oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone pendant 10 minutes. Refermez hermétiquement la solution par la suite pour s'assurer qu'elle reste oxygénée.Placez maintenant une plateforme en plastique mobile équipée d'un fond en polymère d'uréthane viscoélastique absorbant les chocs sur la table anti-vibration située sous la source lumineuse. Ensuite, positionnez la caméra à l'aide d'un support magnétisé et orientez-la vers la plateforme en plastique mobile. Puis, placez le micromanipulateur de l'électrode d'enregistrement sur un second support magnétisé.Veillez à ce que la caméra et le micromanipulateur ne soient pas perturbés par le déplacement d'autres équipements, et à ce qu'ils n'obstruent pas l'illumination provenant de la source lumineuse. Ensuite, connectez la caméra à un moniteur vidéo et positionnez-la vers la plateforme. Assurez-vous que le dispositif est correctement mis à la terre à l'aide d'un fil de cuivre.À cette étape, découpez un petit rectangle d'éponge PVA sèche qui s'ajustera parfaitement dans une boîte de Pétri de 35 millimètres à l'aide d'un rasoir propre. Effectuez une incision supplémentaire dans l'éponge pour loger l'électrode de référence. Utilisez ensuite un marqueur résistant aux produits chimiques pour marquer un petit point sur l'éponge à l'endroit où la larve sera placée.Ensuite, imbiber l’éponge en PVA avec de la solution de Ringer jusqu’à saturation. L’extraire et l’essuyer rapidement sur une serviette en papier deux à trois fois avant de la placer dans une boîte de Pétri propre de 35 millimètres. Puis, positionner la boîte de Pétri contenant l’éponge sur une plateforme en plastique de manière à ce que la marque puisse être visualisée par la caméra.Ensuite, chlorer les électrodes en les faisant tremper dans une solution de chlorure de sodium à 6 à 9 %. Puis les sécher à l'air sur un essuie-tout Kim pendant cinq minutes. Placer la pastille en argent chloruré de l'électrode de référence dans ou sous l'éponge, selon le type d'incision réalisée, et raccorder le câble de l'électrode de référence au système d'enregistrement.Ensuite, fixez environ 40 centimètres de tubulure à une seringue de cinq millilitres sans système de verrouillage et remplissez la seringue avec une solution de Ringer. Ensuite, remplissez une seringue d'un millilitre sans système de verrouillage avec la solution de Ringer. À l’aide d’un microfill, remplissez soigneusement le porte-électrode micro et évitez la formation de bulles.Ensuite, fixez la seringue de cinq millilitres au port de pression du porte-électrode à l’aide d’un tube, en utilisant le microfill et une seringue d’un millilitre remplie de solution de Ringer. Remplissez la micropipette en verre par l’extrémité et veillez à ce qu’aucune bulle ne soit présente. Ensuite, fixez la micropipette en verre au porte-électrode et veillez à maintenir le fil de l’électrode bien droit.Une fois fixée, utilisez la seringue de cinq millilitres pour faire passer avec précaution la solution de Ringer à travers la microélectrode jusqu'à ce qu'une petite quantité de solution soit visible à l'extrémité. Placez maintenant délicatement la microélectrode d'enregistrement dans le micromanipulateur et reliez la connexion au système d'enregistrement afin de vérifier le bruit du système. Placez l'électrode de référence et l'extrémité de la microélectrode d'enregistrement dans une boîte de Pétri de 35 millimètres remplie de solution de Ringer.Vérifiez les niveaux de bruit électrique du dispositif à l’aide d’un oscilloscope ou d’une fonction intégrée de l’appareil d’ERG. Les niveaux de bruit ne doivent pas dépasser plus ou moins 10 microvolts par rapport à la ligne de base. Dans cette procédure, découpez plusieurs carrés de papier essuie-tout d’un centimètre carré, anesthésiez trois à cinq larves dans une boîte de Pétri de 35 millimètres en ajoutant du trica à une concentration finale de 0,02 % et en attendant une à deux minutes.Après cela, transférez délicatement un larve individuel sur un carré de papier essuie-tout sous un stéréomicroscope de dissection avec un éclairage minimal. Vérifiez la position des larves en sélectionnant un spécimen dorsal vers le haut présentant un œil obstrué pour les séances d’enregistrement dépassant 30 minutes. Maintenez la larve humide en appliquant une fine couche de méthylcellulose à 3 % sur le corps à l’aide d’un pinceau en poil de chameau fin.Ensuite, transférez le carré de papier essuie-tout avec la larve vers l'éponge humide en PVA. Puis, appliquez un flux continu d'eau saturée en oxygène à 100 % sur les larves en faisant barboter le gaz à travers une pierre à air dans un ballon à col latéral contenant de l'eau distillée. Positionnez l'oxygène humidifié provenant du col latéral du ballon près de la tête de la larve à l'aide d'un tube, sous une illumination minimale.Utilisez le micromanipulateur et la caméra pour positionner la pointe de l'électrode microscopique au point médian entre les extrémités nasale et caudale de l'œil et appuyez doucement sur la limite dorsale de la cornée. Laissez les larves s'adapter à l'obscurité pendant cinq à dix minutes. Ensuite, enregistrez les réponses aux éclairs d'essai provoqués par la lumière fournie par une source lumineuse à LED ou par un stimulateur optique.Cette figure montre un enregistrement typique de l'ERG chez un larve de poisson-zèbre âgé de cinq jours post-fécondation. Les poissons adaptés à l'obscurité ont été exposés à une lumière blanche LED pendant 20 millisecondes, avec des intensités allant de 1 à 5 000 canula par mètre carré, le stimulus lumineux débutant à zéro seconde. Le potentiel négatif, ou onde a, est difficile à distinguer, tandis que le potentiel positif, ou onde b, constitue le pic dominant de la forme d'onde.Cette vue agrandie montre les amplitudes moyennes de la réponse de l'onde B ajustées à l'aide de l'équation NACA modifiée. Cette figure présente un enregistrement typique de l'ERG chez un poisson-zèbre larvaire de cinq jours post-fécondation (DPF), adapté à l'obscurité et traité avec un PB. Les poissons sont exposés à une lumière blanche LED pendant 20 millisecondes, avec des intensités variant de 1 à 5 000 candélas par mètre carré, et le potentiel récepteur massique des cônes isolés constitue l'élément dominant de la forme d'onde. Cette vue agrandie montre les amplitudes de réponse moyennes d'un poisson-zèbre larvaire traité au PB, ajustées à l'aide de l'équation NACA modifiée.Cette figure montre un enregistrement typique de l'ERG chez un poisson-zèbre larvaire traité avec cinq D-P-F-A-P-B. En utilisant un paradigme de double éclat, les poissons adaptés à l'obscurité sont exposés à des éclairs blancs successifs de 20 millisecondes.Les LED clignotent avec une intensité de 1000 canula par mètre carré, et l'ISI entre les clignotements est de deux secondes. L'apparition de chaque stimulus lumineux est indiquée ici. Cette figure montre le rapport de la réponse maximale du récepteur massique du cône isolé au second stimulus par rapport à celle du stimulus initial, en fonction de l'augmentation de l'ISI, ce qui indique la récupération progressive de la sensibilité des photorécepteurs.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que la qualité des enregistrements dépend de l'intégrité de la connexion entre l'électrode et la cornée ainsi que de l'état de santé des larves. Le développement de cette technique a considérablement amélioré la capacité des chercheurs en sciences de la vision à étudier l'adaptation et la récupération des cônes dans la rétine des vertébrés in vivo.

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