Mise en place d'un modèle de xénogreffe humain de myélome multiple dans le poulet pour étudier la croissance tumorale, l'invasion et l'angiogenèse

L’objectif global de l’expérience suivante est d’établir un modèle d’embryon de poulet in vivo avec des cellules de myélome humain et de mésenchyme greffées afin d’étudier les effets des médicaments anticancéreux sur la croissance, l’invasion et l’angiogenèse des tumeurs. Ceci est réalisé en générant des cellules de myélome multiple humain transgéniques pour l’analyse dans des modèles 3D in vitro et in vivo. Les cellules sont transfectées avec du lentivirus, fournissant la GFP pour la visualisation et la résistance à la blastine pour la sélection des cellules transfectées.

Dans un second temps, les viroïdes 3D. Avec les cellules transfectées, des cellules mésenchymateuses et une matrice extracellulaire sont générées, ce qui permet un criblage à grande échelle de médicaments anticancéreux dans un environnement 3D complexe in vitro. Prochaine tumeur 3D.

La PHE peut être cultivée in vivo dans des embryons de poulet afin de tester les effets de nouveaux médicaments sur la croissance tumorale, l’invasion et l’angiogenèse. En fin de compte, la taille de la tumeur et les réponses angiogéniques peuvent être documentées quotidiennement et après l’euthanasie. Les tumeurs peuvent être examinées par GFP, Eliza et immunohistochimie.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la mise en miroir de modèles de xénogreffes est l’ECX par rapport à la manipulation et à l’imagerie des tumeurs humaines. Les cellules tumorales humaines avec des cellules thro humaines de soutien et des composés de la matrice extracellulaire peuvent se développer in vivo et des embryons de poulet qui n’ont toujours pas de réponses immunitaires adaptatives. Cette méthode peut aider à développer de nouvelles thérapies et permet un dépistage préclinique rapide pour le traitement des patients atteints de myélome multiple.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les cellules humaines du myélome multiple subissent facilement l’apoptose en raison du stress et les embryons de la joue peuvent mourir lorsqu’ils sont mal manipulés, ce qui est dû à des conditions de culture exor appropriées. Technicien expérimenté de notre laboratoire. Pour ce protocole, préparez des cultures de lignées cellulaires de myélome multiple, OPM deux RPMI 8 2 2 6, et des cellules souches mésenchymateuses humaines de la moelle osseuse incubent les cellules normalement dans un milieu supplémenté suivant le protocole de texte transfectent un million de cellules de myélome multiple avec 100 000 particules lentivirales.

Dans une plaque de 24 puits avec un milieu de croissance complet après trois jours, commencez à sélectionner les cellules transfectées en ajoutant deux microgrammes de blastine pour chaque millilitre de milieu de culture ou utilisez 500 microlitres de néomycine par millilitre pour le lentivirus EGFP disponible dans le commerce après deux semaines de sélection, recherchez des amas de cellules exprimant EGFP. Collectez, flottez ou adhérez des amas de cellules en les suspendant soigneusement dans une pastille de tube à centrifuger, des cellules D-E-G-F-P à 1000 GS pendant cinq minutes et étendez-les en sous-lignes. Après la sélection et la propagation de cellules myélomateuses multiples exprimant la GFP, vérifiez toujours leur capacité avant de les utiliser pour d’autres expériences.

Pour commencer, refroidissez un peu de collagène de type une solution et 10 XDMM sur de la glace. Une fois refroidi, mélangez un à dix volumes du milieu 10 X-D-M-E-M dans la solution de collagène. Ajoutez ensuite 0,2 hydroxyde de sodium normal goutte à goutte pour neutraliser la solution à un pH de 7,4.

Gardez la solution sur de la glace et confirmez le pH avec une bandelette de test. Ensuite, mélangez les lignées cellulaires transgéniques du myélome multiple avec les cellules mésenchymateuses humaines. Maintenant, centrifugez le mélange cellulaire dans des tubes de 15 millilitres à 1000 G.Pendant cinq minutes, jetez le surnageant et, à l’aide d’une pipette P 1000, mettez en suspension la pastille dans un millilitre du mélange de collagène froid.

À l’aide d’un embout P 100, transférez immédiatement 30 microlitres d’aliquotes du mélange sur de la paraffine stérile. Dans une plaque de culture de 24 puits, laissez le mélange polymériser pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, formant ainsi des stéroïdes. Ensuite, superposez les stéroïdes avec un millilitre de milieu préparé avec différents traitements.

Par exemple, un médicament peut être appliqué à différentes concentrations. Après 72 heures d’incubation à 37 degrés Celsius, documenter le PHE par stéréomicroscopie fluorescente. Ensuite, à l’aide d’une pince à mâchoire plate large, transférez chaque stéroïde dans un tube de réaction pour mesurer l’expression de la GFP.

En préparation de cette procédure, incubez les œufs de poule dans un incubateur d’œufs à 37 degrés Celsius et 70 % d’humidité pendant trois jours. Ensuite, ouvrez les ovules et transférez les embryons dans du plastique carré stérilisé de 10 centimètres, en pesant des bateaux avec des plaquettes de culture cellulaire Pour obtenir des taux de survie plus élevés d’embryons de poulet dans la culture X OVO. Utilisez des bateaux en plastique au lieu de 10 centimètres de tissu de culture.

De plus, stérilisez et prévêtez avec de longs bateaux d’attente PBS avant utilisation. Continuez à couver les œufs X ovo pendant six jours supplémentaires au cours desquels le CAM se développera. Préparez maintenant le myélome multiple et la PHE à cellules mésenchymateuses comme dans la procédure précédente, mais dans une plaque à six puits, puis à l’aide de pinces, transférez le stéroïde comme sur les plantes sur la surface non traitée de la came à environ deux centimètres de l’embryon d’embryons de poulet âgés de neuf jours.

Placez-en quatre sur des plantes sur chaque embryon de poulet. Laissez les embryons ex ovo avec les plantes reposer dans l’incubateur d’œufs pendant cinq jours. Documentez ensuite les xénogreffes par stéréomicroscopie fluorescente.

Après la documentation, utilisez des ciseaux ophtalmiques et des pinces pour retirer les xénogreffes avec un peu de tissu de camp adjacent. Pour mesurer l’expression de la GFP ou pour effectuer une analyse immunohistochimique, commencez par transférer chaque stéroïde ou xénogreffe d’excise du myélome multiple dans 0,5 millilitre de RIPA avec inhibiteurs de protéase. Ensuite, utilisez un homogénéisateur sur glace pour mélanger les tissus une fois homogénéisés, congelez et décongelez les homogénats à l’aide d’azote liquide, puis d’un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Faites-le trois fois, puis centrifugez les homogénats à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes à 12 000 G et stockez les surnageants. Ensuite, diluez un peu de surnageant à un à 20 dans le tampon de dosage du kit ELIZA. Mesurez ensuite les niveaux de GFP avec des anticorps anti-GFP biotinylés à l’aide d’un kit.

Commencez par une fixation nocturne des xénogreffes d’accise dans du para formaldéhyde. Le lendemain, déshydratez et encastrez les xénogreffes fixées. Tout d’abord, chargez-les dans des cassettes.

Déplacez ensuite les cassettes à travers une série d’alcool classée. Laissez chaque bain persister pendant une heure complète et terminez le processus par l’incorporation de paraffine. Ensuite, faites des xénogreffes de cinq microns à l’aide d’un microtome rotatif de paillasse, faites cuire les sections de paraffine collectées sur des lames de verre pendant la nuit à 56 degrés Celsius.

Le lendemain, séparez les sections à l’aide d’une série d’alcool graduée décroissante en eau distillée deux fois. La lame doit être dans chaque bain pendant seulement 10 minutes. Suivez maintenant le protocole textuel pour incuber avec les anticorps primaires et secondaires respectifs et effectuer une détection métrique calor avec une enzyme et un substrat après la coloration des anticorps, contre-coloration avec de l’hématine et des dissections de montage avec un milieu de montage synthétique.

Deux EGFP exprimant un myélome multiple. Des lignées cellulaires ont été établies en culture pendant trois jours en présence du médicament. Les cellules tumorales de bortézomib et les stéroïdes ont ensuite été visualisés par l’expression de la GFP sur un microscope à stéréofluorescence.

La masse cellulaire tumorale après traitement médicamenteux a été quantifiée après homogénéisation de PHE et mesure des teneurs en EGFP par A GFP Eliza. Dans une autre expérience, des embryons de poulet âgés de trois jours ont été cultivés X ovo pendant six jours. Au neuvième jour, des cellules de myélome multiple ont été greffées.

Quatre greffons de plantes ont été attachés à chaque embryon. La substance cible bortézomib a été appliquée localement à un mol après cinq jours, les plantes ont formé des tumeurs par rapport aux témoins. Le bortézomib a inhibé la croissance des cellules myélomateuses multiples dans le greffon sur la base de la visualisation de la masse tumorale fluorescente.

Des greffons uniques provenant de trois animaux différents ont ensuite été excisés, homogénéisés et ensuite mesurés par GFP Eliza. Comparativement aux témoins, les tissus traités au bortézomib avaient une masse cellulaire myélomateuse significativement inférieure. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser des expériences si vos cellules cancéreuses d’intérêt dans les embryons de poulet cultivés pour analyser la croissance et la genèse de la tumeur et l’invasion dans le tissu hôte après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du myélome multiple pour explorer des composés nobles ou des médicaments dans un organisme modèle facile à manipuler, ce qui est nécessaire pour les tests précliniques de médicaments.