Name: Une In Vitro Modèle dormance du cancer du sein sensible aux œstrogènes dans la moelle osseuse: un outil pour les études de mécanisme moléculaire et Hypothèse Generation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Découvrez un modèle in vitro de dormance pour les cellules de cancer du sein sensibles aux œstrogènes dans la moelle osseuse. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes moléculaires et de générer des hypothèses pour des tests in vivo.

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1. Test clonogénique <ol><li> Préparer un seul suspensions de cellules de lignées de cellules de cancer du sein oestrogène-dépendante des cellules MCF-7 et T47D en suivant les étapes décrites ci-dessous <ol><li> Aspirer le milieu de culture (DMEM / 10% inactivé par la chaleur sérum de veau foetal / glutamine et pen / strep) à partir d&#39;une boîte de culture tissulaire de 10 cm qui est non confluentes de cellules MCF-7 ou les cellules T-47D plus de 50%. Rincer avec du PBS. Incuber avec de la trypsine 0,25% / 2,21 mM EDTA dissout dans du DMEM riche en glucose à 37 ° C pendant 1-4 min. </li><li> Voir les cellules à des intervalles de 1 min sous un microscope à contraste de phase pour garantir une répartition de la cellule unique. Remettre les cellules avec une pipette de 2 ml par aspiration et à plusieurs reprises de perturber contact cellule-cellule pour obtenir un statut de cellules presque invariable, unique. </li><li> Continuer à incuber les cellules dans la trypsine à 37 ° C pendant 4 min si vous observez des amas de cellules après seulement 2 min d&#39;incubation. Ne pas utiliser ces cellules pour des études clonogènes si elles restent adhérentes à l&#39;each autre bout de 4 min de la trypsine parce que l&#39;erreur sera introduit dans le rendement de nombre de colonie. NOTE: Si les cellules sont agglutinées, le nombre de colonies formées reflétera le produit de moins de cellules que le nombre incubés. Si les cellules sont trop trypsinisées, leur potentiel clonogénique peut être diminuée. </li><li> Préparer une suspension cellulaire unique de 1.500 cellules / ml de milieu de culture pour les plaques à 24 puits, ou moins, (+ 500 cellules / ml, en fonction du type cellulaire ou du nombre de passage), par des dilutions en série dans un tube principal contenant la totalité du volume nécessaire pour toutes les variables dans l&#39;expérience. NOTE: L&#39;objectif est une densité cellulaire finale de 800 cellules / cm 2 (gamme d&#39;environ 500 à 1100 cellules / cm 2). L&#39;objectif est de produire environ 100 + 50 colonies, qui permet le comptage relativement facile, empêche l&#39;encombrement et permet colonies suffisantes pour entraîner des différences statistiques significatives lorsque les colonies sont augmenté ou diminué de perturba expérimentaletions. </li></ol></li><li> Incuber les cellules à clonogénique densité en utilisant les étapes décrites ci-dessous <ol><li> Incuber les cellules dans des puits quadruples sur 24 plaques revêtues de fibronectine puits à une densité clonogénique de 1500 cellules / puits à partir d&#39;un seul tube de suspension de cellules de maître de 1500 cellules / ml. Triturer le milieu contenant des cellules avec une pipette de 5 ml en dressant 3 ml et 1 ml de milieu de distribution dans chacun des 2 puits. NOTE: fibronectine plaques doivent être achetés pré-revêtu d&#39;un fournisseur commercial. des plaques de revêtement à l&#39;extérieur d&#39;un contrôle de qualité, des résultats de processus automatisés dans une surface inégale inadapté pour ce dosage. </li><li> Mélanger la suspension par pipetage de haut en bas avec une pipette de 5 ml, dresser 3 ml de suspension cellulaire et remplir 2 puits avec 1 ml chacun. Remplissez seulement 2 puits à tout moment d&#39;une pipette. Retour le volume restant dans la pipette à la suspension de cellules dans le tube de maître, remettre les cellules à nouveau par aspiration et refoulement et d&#39;élaborer un autre 3 ml pour remplir une autre 2 wells avec 1 ml chacune. NOTE: Le mélange continu du tube de maître est nécessaire parce que les cellules seront en permanence sédimenter. Rédaction volume suffisant pour remplir seulement 2 puits est nécessaire d&#39;ajouter le nombre de cellules semblables à chaque puits parce que les cellules sédimentent dans la pipette ainsi. </li><li> Travaillez rapidement pour distribuer les grands volumes de cellules parce que les cellules permettant de siéger en suspension à la température ambiante et de la concentration de CO 2 va moduler leurs potentiels (observations non publiées) clonogéniques. </li><li> Optimiser la distribution spatiale des cellules pendant l&#39;acte d&#39;entre eux pipetage dans des puits pour des essais de la colonie. Faire par pipetage lentement la suspension contenant la concentration cellulaire finale dans le milieu du puits. Ne pas soumettre la plaque pour faire avancer le mouvement avant que les cellules se déposent au fond. Ne pas agiter la plaque parce mélange circulaire sera effectivement centrifuger les cellules à la périphérie du puits créant de fortes densités cellulaires et colonies confluentes innombrables à 6 jours. NOTE: Ne pas mélanger moins nécessaire car cela est moins souhaitable que pas de mélange du tout après l&#39;introduction du volume avec les cellules en suspension. Si il est nécessaire de mélanger des cellules, le faire en déplaçant la plaque avant et en arrière dans des directions perpendiculaires alors qu&#39;il repose sur une surface plane. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C 5% de CO 2, sans changement de support pour 6 jours. Le petit nombre de cellules dans un puits après six jours ne sera pas un impact significatif sur la composition en nutriments ou cytokine ni le pH du milieu d&#39;origine. </li><li> Concevoir le cours du temps de l&#39;analyse comme suit: incuber les cellules sur la fibronectine revêtu substrats le jour 1. Remplacer support existant avec 1 ml de milieu frais ou milieu frais contenant le FGF-2 10 ng / ml au jour 0. cellules tache sur la journée 6 ci-dessous en 1.4). Mener des perturbations expérimentales au jour 3, comme ci-dessous au point 1.3). </li></ol></li><li> Set Up perturbations expérimentales de signalisation moléculaire ou molécules d&#39;adhésion <ol><li> Au jour 3, ajouter 10056; l d&#39;une solution contenant de 10 fois la concentration finale voulue de l&#39;agent perturbateur au moyen de 1 ml dans les puits. Ne pas mélanger. Continuer à incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 3 jours. NOTE: les agents Perturber peut inclure une variété d&#39;inhibiteurs et des agents de blocage de molécules d&#39;adhésion, des récepteurs ou d&#39;autres protéines de surface, des inhibiteurs de voies intracellulaires de signalisation, des molécules, des facteurs, des cofacteurs ou des protéines structurelles, qui peuvent jouer un rôle dans le soutien de l&#39;état de dormance. </li><li> colonies de tache sur 6 jours, comme suit. </li></ol></li><li> Colonies de Stain <ol><li> les taches cellules après 6 jours de culture avec un cristal violette fraîchement préparé 0,1% dans l&#39;éthanol à 2% / borate de sodium 10 mM (pH 9,0) solution. Aspirer médias et ajouter une solution de cristal violet à une ml à chaque puits pendant 20 min. </li><li> Lavez assiettes en les immergeant avec les ouvertures de puits orientés vers le bas à un angle aigu dans un seau à glace débordant de robinet en continul&#39;eau dans l&#39;évier. Inclinez la plaque à un angle horizontal une fois sous l&#39;eau, et l&#39;ouverture vers le bas, puis inclinez revenir à un angle aigu lors du retrait dans un mouvement fluide douce. </li><li> Répéter l&#39;immersion deux ou trois fois jusqu&#39;à ce que l&#39;eau au fond des puits est plus bleue. Lavages vigoureux peuvent éliminer les cellules ou colonies qui sont moins adhérentes due à l&#39;intervention expérimentale, ajoutant de manière significative à l&#39;erreur dans le comptage et les données. </li><li> Plaques sécher pendant la nuit en les plaçant à l&#39;envers sur des serviettes sur la paillasse à côté de leurs couvertures marqué correspondant. </li></ol></li><li> Compter les colonies <ol><li> Comptez le nombre de colonies croissance et de dormance dans chaque puits après 6 jours d&#39;incubation, la coloration et le séchage. Compter les colonies de façon optimale à 40X dans un inversé microscope à contraste de phase. Compter les colonies de&gt; 30 cellules en culture et des colonies de 12 cellules ou moins, avec l&#39;aspect morphologique de très grande taille par rapport à la croissance de cellules, grande expacytoplasme DEMVSO avec grande cytoplasme au noyau rapports, présentés dans la figure 1 7,15. NOTE: Des grappes de 13-29 cellules ne sont pas normalement considérés comme ils ne sont pas très fréquents dans les essais de dormance simples. Ils peuvent être comptés si les perturbations se déplacent le potentiel de croissance ou soit des cellules dormantes croissance. Ces résultats devront ensuite être corrélé avec une signification biologique. </li></ol></li></ol> 2. clonogénique incubation d&#39;études immunofluorescence <ol><li> Ajuster le nombre de cellules à environ 7,500-8,000 cellules / puits dans des plaques à 6 puits, à correspondre à la cellule numéros / aire de surface analogue à des expériences 24 puits. </li><li> Placez un rond, stérile, lamelle de fibronectine dans chaque base ainsi des plaques de 6 puits pour les études d&#39;imagerie avant l&#39;addition de la cellule. Pipet cellules dans 3 ml volumes dans chaque puits 2 puits à la fois à des concentrations décrites, comme décrit pour les expériences clonogènes ci-dessus en 1.2). </li><li> Incuber les cellulespendant 6 jours, comme ci-dessus en 1.2.4 et 1.2.5. Ajouter facteurs perturbateurs sur trois jours à des concentrations de 10 x 300 pi de volumes, comme décrit dans les procédures d&#39;essai de colonie à 1,3). </li><li> cellules tache sur la journée 6 avec des anticorps à la cellule des molécules d&#39;adhésion comme les intégrines α4, α5, α6, β1, β3, par exemple, l&#39;adhésion focale molécules complexes FAK, paxillin et vinculine, par exemple, des protéines impliquées dans la motilité tels que α-tubuline, par exemple, de signalisation éléments de voie tels que la phospho-Akt, phospho-ERK, phospho-p38, phospho-JNK, par exemple, ou toute autre protéine qui est la cible d&#39;une enquête pour son rôle dans la dormance, en utilisant des techniques standard pour direct ou indirect immunofluorescence. <ol><li> Retirer les lames avec une pince jour 6. Fix dans l&#39;acétone / méthanol 1: 1 à -20 ° C pendant 20 min et l&#39;air sec. Un fixateur de remplacement, tel que le paraformaldehyde, peuvent être utilisés, si nécessaire. Perméabiliser les cellules avec 0,1% de Triton X-100, le citrate de sodium à 0,1% pendant 2 min fou la détection d&#39;antigènes intracellulaires. Laver les cellules avec du PBS. </li><li> Pour la coloration de immunofluorecence indirect, les lames de bloc pendant 1 heure à température ambiante avec 5% de BSA ou avec 10% de sérum pré-immun de l&#39;espèce dans laquelle l&#39;anticorps secondaire a été généré. </li><li> Incuber une nuit à 4 ° C avec des anticorps primaires à la cellule des molécules d&#39;adhésion, des molécules complexes focaux, signalisation membres de la voie ou de toute autre protéine qui est la cible d&#39;une enquête pour son rôle dans la dormance dilué à dilutions spécifiques recommandées par le fabricant dans du PBS 0,1% de Triton X -100. </li><li> Laver 3 fois avec du PBS. Incuber lamelles avec des anticorps de fluorophore conjugué à la température ambiante pendant 2 heures. A titre d&#39;exemple, Alexa Fluor 488 âne anti-IgG de souris d&#39;anticorps peut être utilisé pour détecter des anticorps primaires monoclonaux de souris. Mont lamelles de côté cellule vers le bas sur des lames de verre à l&#39;aide d&#39;un agent de antifade avec Dapi. Sceller les périmètres avec du vernis à ongles. </li><li> Pour immunofluorescence directe, effectuer la BSAbloquant comme ci-dessus au paragraphe 2.4.2), incuber avec l&#39;anticorps primaire fluorophore conjugué nuit à 4 ° C. Laver 3 fois avec du PBS. Incuber les lames avec un agent de antifade et Dapi et joint avec du vernis à ongles. </li><li> Couverture plateaux coulissants avec une feuille d&#39;aluminium et conserver à 4 ° C pour l&#39;imagerie et la photographie à tout moment jusqu&#39;à plusieurs semaines plus tard. Voir et photographie cellules en utilisant des systèmes d&#39;imagerie microscopique fluorescence équipés d&#39;une caméra à 1,000x grossissement. </li><li> Pour la coloration de l&#39;actine fibrillaire, les lames de blocs dans 1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) pendant 30 minutes et on incube dans BODIPY FL-phallacidine (vert) ou la rhodamine phalloïdine (rouge) à la température ambiante pendant 20 min. Ajouter un agent de antifade et sceller comme ci-dessus. </li></ol></li></ol> 3. clonogénique incubation pour les études moléculaires <ol><li> Western Blot <ol><li> Incuber ER + cancer du sein cellules MCF-7 ou T47D à des densités clonogéniques de 20.000 cellules / plaque de 60 mm et de 50 000 cellules / plaque de 100 mm sur fibronecrevêtu d&#39;étain plaques à 37 ° C dans 5% de CO2. </li><li> Incuber les cellules à des densités légèrement plus élevés de 75 000 cellules / plaque de 100 mm pour les études moléculaires nécessitant des quantités mg de protéines à partir de lysats. Utilisez jusqu&#39;à dix plaques par point expérimental pour recueillir suffisamment de protéines pour les études moléculaires en utilisant des empreintes occidentaux ou pour l&#39;isolation de l&#39;ARN pour des transferts de Northern. </li><li> Le nombre de cellules gel à base de chargement est un complément nécessaire pour comparer l&#39;expression des protéines dans les cellules de croissance et de dormance très différentes taille. Recueillir des cellules par trypsinisation et compter une aliquote dans un hémocytomètre dans 0,2% Trypan Bleu pour la préparation de lysats pour des transferts de Western lieu de racler les cellules avec une seule lame de bord. </li><li> Centrifuger les cellules à 10.000 g pendant 2 min, retirez les médias par aspiration, ajouter 200 tampon de lyse, soniquer les cellules dans un tampon de lyse et de déterminer la concentration en protéines. </li><li> Calculer la quantité de protéine par cellule en divisant le rendement de la protéine par le nombre de cellulesqui a généré ce montant. Charger le lysat dans chaque puits de gels de polyacrylamide séparées qui représente à la fois a) des quantités équivalentes de la protéine et b) des quantités de protéines représentant des nombres équivalents de cellules. Au moins 25 pg de protéine doit être chargé dans chaque puits. NOTE: Ce sera de permettre des comparaisons entre croissance et de dormance des cellules, qui sont significativement différents en taille et en teneur en protéines (figure 1). </li></ol></li><li> Cytométrie en flux <ol><li> Recueillir des cellules de plaques de 100 mm par trypsinisation, comme en 3.1 et d&#39;analyser par cellulaire activé par fluorescence tri standard (FACS) en utilisant des protocoles coloration par immunofluorescence primaire ou secondaire pour des antigènes intracellulaires ou extracellulaires, comme indiqué dans 2.4. REMARQUE: Retrait de cellules à partir de plaques de culture tissulaire par traitement à la trypsine n&#39;a pas d&#39;incidence sur la concentration des protéines membranaires, comme déterminé par marquage de l&#39;anticorps. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Soutenu par le ministère de la Défense subventions DAMD17-01-C-0343 et DAMD17-03-1-0524, la Commission d&#39;État du New Jersey sur la recherche sur le cancer 02-1140-CCR-E0 et le Mémorial Goldberg Ruth Estrin for Cancer Research (RW)

Notre modèle se compose de plusieurs éléments essentiels de dormance dans la moelle osseuse. Il se compose d&#39;oestrogènes des cellules sensibles, qui sont du type susceptible de rester en sommeil dans la moelle pendant des périodes prolongées 10, il se compose de la fibronectine, un élément structurel clé de la moelle, le FGF-2, un facteur de croissance abondamment synthétisée par le stroma de la moelle osseuse et fortement déposé dans la matrice extracellulaire de la moelle osseuse et 31,32 inc...

des cellules de cancer du sein à métastases de la moelle osseuse avant que la maladie est détectable 1, dès que les tumeurs se développent de petits vaisseaux sanguins 2,3. Le processus métastatique est rapide, mais inefficaces. Cellules entrent dans les nouveaux vaisseaux sanguins rapidement, à des millions par jour 4 mais peu survivent au voyage à des organes éloignés 5. Néanmoins, certains micrométastases survivre dans l&#39;os et peuvent être trouvés comme des cellules individuelles ou de petits amas de cellules dans les ponctions de moelle osseuse de patients nouvellement diagnostiqués 1. Ces cellules résistent à la chimiothérapie adjuvante, qui est administré par l&#39;objet même de les éliminer 6. Cette résistance est dotée, sensiblement, par la survie de signalisation initiée par les interactions avec le microenvironnement de la moelle osseuse 7,8. Micrométastases peuvent être trouvés dans environ un tiers des femmes atteintes du cancer du sein localisé et représentent un indicateur indépendant de survie lorsqu&#39;il est analysé par analyse univariée 9. Certains micrometastases sont la croissance amorcée, mais les schémas de récidive dépendent du type de cellule. Les patients atteints de cancer du sein triple négatif ont tendance à réapparaître entre 1 à 4 ans, ce qui suggère un mauvais contrôle de l&#39;état de dormance. Autres types de cellules, y compris ER / PR + cellules, peuvent rester en dormance pendant jusqu&#39;à 20 ans, avec un taux stable et continu de récidive 10. Alors que les différences de dormance signatures d&#39;expression génique entre ER + et RE- lignes et les tumeurs des cellules mammaires reflètent différents potentiels de dormance 11, les interactions avec le stroma de la moelle osseuse représentent probablement une contribution significative à la dormance. L&#39;étude de dormance in vivo est exceptionnellement difficile parce micrométastases sont rares et sont plus nombreux que les cellules hématopoïétiques de plus de 10 6 -fois. Par conséquent, les modèles concernés doivent être générés qui fournissent des données in vitro qui peuvent proposer des mécanismes et générer des hypothèses testables in vivo. Un certain nombre de modèles de dormance, y compris mathe12,13 matiques modèles, des modèles in vitro, in vivo 7,8,14,15 modèles de xénogreffe, des combinaisons de 16 in vitro et des modèles de xénogreffes 17,18 et modèles spontanés de métastases tumorales et 19, ont donné un aperçu de la dormance des cellules cancéreuses 20 . Chacun de ces modèles ont leurs propres limites et sont d&#39;eux-mêmes principalement utile pour générer des hypothèses en ce qui concerne la signalisation moléculaire et interactions qui régissent la dormance à tester dans des modèles plus biologiquement pertinentes. Avec l&#39;objectif général de définir les mécanismes moléculaires de la dormance, les interactions avec le microenvironnement qui se traduit par l&#39;arrêt du cycle, redifférentiation et de résistance et mécanismes thérapeutique qui résultent de la récidive dans ER + cellules, nous avons développé un modèle in vitro qui fournit sélectionné les éléments pertinents de la microenvironnement stromal 7. Ce modèle, bien que relativement rares dans sa composants, est suffisamment robuste pour permettre aux enquêteurs de déterminer des mécanismes moléculaires spécifiques qui affectent les fonctions importantes de dormance. Ces expériences génèrent des hypothèses qui peuvent être directement testés in vivo. Le modèle repose sur quelques éléments clés que nous avons démontré pour être pertinent dans la dormance. Elles comprennent l&#39;utilisation de cellules de cancer du sein oestrogéno-dépendants, la culture de cellules à une densité clonogénique où leur interaction est principalement avec le substrat et les composants solubles du milieu, un substrat de la fibronectine et de la présence de facteur de croissance basique des fibroblastes (FGF-2) dans le milieu. Nous avons caractérisé les mécanismes qui régissent le système in vitro, y compris l&#39;induction de l&#39;arrêt du cycle cellulaire par le FGF-2 21, à médiation par 22 le TGFß, la survie par l&#39;intermédiaire de signalisation PI3 kinase ERK 7,8 et 8 et de la différenciation morphogénétique à un phénotype épithélial, qui dépendait RhoA inactivation, l&#39;intégrine45; 5β1 régulation à la hausse et la ligature de stroma pour la survie de la fibronectine 7,15 (Figure 1). Les effets du cycle cellulaire in vitro de FGF-2 sur les cellules MCF-7 commencent à des concentrations d&#39;au moins un log-dessous de 10 ng / ml 21,23. Le raisonnement était basé sur le contrôle temporel de FGF-2 expression régissant mammaire morphogenèse canalaire, l&#39;expansion cyclique et la récession dans un certain nombre de systèmes de mammifères 24-27. Nous avons démontré que le FGF-2 induit la différenciation, y compris la morphogenèse canalaire in culture 3D 28, et que le FGF-2 expression sont généralement perdue avec la transformation maligne des tumeurs humaines 29. L&#39;expression de FGR1 resté intact dans les carcinomes mammaires interrogés 29 et MCF-7 cellules continuer à exprimer les 4 récepteurs FGF 30. Dans le contexte de la dormance, FGF-2 est exportée par et fortement déposée sur stroma de moelle osseuse 31,32 où il fonctionne dans le maintien de cellules souches hématopoïétiques 33. Nous demtré que le FGF-2 induit un état ​​de dormance dans ER + cancer du sein cellules cultivées sur la fibronectine substrats, également abondants dans la moelle osseuse, où il induit la différenciation morphogénétique 7. Dans le modèle, les cellules de cancer du sein sont la croissance inhibée, Rho A à inactiver le RhoGAP GRAF, pour redifférencier un phénotype épithélial et ré-exprimer des intégrines lost avec la progression maligne. Ils se lient à travers la fibronectine intégrine α5β1 et d&#39;activer la survie de signalisation qui les rendent résistantes à la thérapie cytotoxique 7,8,15 (figure 1). Inhibition de GTPases Rho de classe a été démontré précédemment pour induire un phénotype dormant 34. Ici, nous allons décrire les procédures spécifiques qui permettront aux enquêteurs d&#39;établir le modèle et étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires spécifiques régissant la dormance des cellules ER + cancer du sein. Dans les expériences présentées ici pour illustrer l&#39;utilisation du modèle, Nous avons ciblé la voie de la PI3K (figure 1B) avec un inhibiteur de l&#39;Akt et un inhibiteur de la PI3K et de tous les membres de la famille Rho (figure 1B) avec un inhibiteur pan-Rho et un Rho kinase (ROCK) inhibiteur.

<table><tbody><tr><td>Cellules MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>Cellules T47D&nbsp ;</td><td>ATCC</td><td>HTB-123</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronectine 24 puits clair à fond plat traité TC Plaque multipuits</td><td>Corning</td><td>354411</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronectine 60 mm Boîtes de culture</td><td>Corning</td><td>354403</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronectine 100 mm Boîtes de culture</td><td>Corning</td><td>354451</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat 22x22mm #1 Couverture en verre avec une application uniforme de fibronectine</td> <td>humaineCorning</td><td>354088</td><td></td></tr><tr><td>6 Well Plaque de culture tissulaire</td><td>CellTreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder</td><td>Corning Life Sciences</td><td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>Inactivé par la chaleur, fœtal Sérum sérique</td><td>Source International</td><td>FB02-500HI</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine/2,21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine, 100X</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine, 100x, Liquide</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>FGF humain recombinant&nbsp ; R& de base</td><td> D Systems</td><td>234-FSE-025</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur d’Akt (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycérocarbonate)</td><td>CalBiochem</td><td>124005</td><td></td></tr><tr><td>LY294002&nbsp ;</td><td>CalBiochem</td><td>19-142</td><td>Inhibiteur chenical de PI3K</td></tr><tr><td>C3 transférase&nbsp ;</td><td>Le cytosquelette</td><td>CTO3</td><td>inhibe RhoA, RhoB et RhoC, mais pas les GTPases apparentées telles que le dichlorhydrate Cdc42 ou Rac1</td></tr><tr><td>Y-27632.</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>129830-28-2</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY FL-Phallacidin (vert)&nbsp ;</td><td>Sondes moléculaires</td><td>B607</td><td>Fluorochrome pour la coloration de l’actine fibrillaire</td></tr><tr><td>BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (rouge)&nbsp ;</td><td>Sondes moléculaires</td><td>R415</td><td>Fluorochrome pour la coloration de l’actine fibrillaire</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Souris IgG Anticorps réactif, réactif ReadyProbes&nbsp ;</td><td>Sondes moléculaires</td><td>R37114</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant avec DAPI&nbsp ;</td><td>Sondes moléculaires</td><td>P-36931</td><td></td></tr></tbody></table>

une<em&gt; in vitro</em&gt; modèle dormance du cancer du sein sensible aux œstrogènes dans la moelle osseuse: un outil pour les études de mécanisme moléculaire et hypothèse generation

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

L’étude de la dormance du cancer du sein dans la moelle osseuse est une entreprise exceptionnellement difficile en raison de la complexité des interactions des cellules dormantes avec leur microenvironnement, de leur rareté et de l’excès écrasant de cellules hématopoïétiques. À cette fin, nous avons développé un modèle clonogénique 2D in vitro de la dormance de cellules cancéreuses du sein sensibles aux œstrogènes dans la moelle osseuse. Le modèle se compose de quelques éléments clés nécessaires à la dormance. Il s’agit notamment de 1) l’utilisation de cellules cancéreuses du sein sensibles aux œstrogènes, qui sont susceptibles de rester dormantes pendant de longues périodes, 2) l’incubation de cellules à densité clonogène, où l’interaction structurelle de chaque cellule se fait principalement avec le substrat, 3) la fibronectine, un élément structurel clé de la moelle osseuse et 4) le FGF-2, un facteur de croissance abondamment synthétisé par les cellules stromales de la moelle osseuse et fortement déposé dans la matrice extracellulaire. Les cellules incubées avec le FGF-2 forment des clones dormants après 6 jours, qui se composent de 12 cellules ou moins qui ont un aspect plat distinct, sont significativement plus grandes et plus étalées que les cellules en croissance et ont de grands rapports cytoplasme/noyau. En revanche, les cellules incubées sans FGF-2 forment principalement des colonies en croissance composées de >30 cellules relativement petites. Les perturbations du système avec des anticorps, des inhibiteurs, des peptides ou des acides nucléiques le 3e jour après l’incubation peuvent affecter de manière significative divers aspects phénotypiques et moléculaires des cellules dormantes à 6 jours et peuvent être utilisées pour évaluer les rôles des molécules localisées ou intracellulaires, des facteurs ou des voies de signalisation sur l’état dormant ou la survie des cellules dormantes. Tout en reconnaissant la nature in vitro de l’essai, il peut fonctionner comme un outil très utile pour recueillir des informations importantes sur les mécanismes moléculaires nécessaires à l’établissement et à la survie des cellules dormantes. Ces données peuvent être utilisées pour générer des hypothèses à tester sur des modèles in vivo.

<html> Des expériences ont été menées afin de récapituler l&#39;essai. L&#39;évolution dans le temps de l&#39;expérience est représenté sur la figure 2A. Les cellules sont incubées à une densité clonogénique le jour -1, FGF-2 dans un milieu frais est ajouté au jour 0 et les cellules sont cultivées jusqu&#39;au jour 6 quand ils sont colorés et les colonies sont comptées. Tous les perturbations du système sont administrés au jour 3 dans des volumes de 100 pi à 10x concentrations finales souhaitée. ...

Nous avons développé un modèle in vitro de dormance dans la moelle osseuse pour des cellules cancéreuses du sein sensibles aux œstrogènes. L’objectif de ce protocole est de démontrer l’utilisation du modèle pour l’étude de la biologie moléculaire et cellulaire de la dormance et pour la génération d’hypothèses pour des tests ultérieurs in vivo.

Une<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle dormance du cancer du sein sensible aux œstrogènes dans la moelle osseuse: un outil pour les études de mécanisme moléculaire et Hypothèse Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'appliquer ce modèle de dormance in vitro afin d'étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires et de générer des hypothèses à tester dans des modèles in vivo plus complexes sur le plan biologique. Cela est réalisé en cultivant des cellules cancéreuses du sein positives pour les œstrogènes dans des plaques de culture tissulaire à matrice de fibrine à densité confluente, où leurs interactions se font principalement avec le substrat et non entre elles. Dans une deuxième étape, un état de dormance est activé dans certaines des cellules positives pour les œstrogènes, état soutenu et maintenu par le FGF-2 et la fibronectine, représentatifs des cellules cancéreuses du sein présentes dans la moelle osseuse.Ensuite, le système est perturbé par l'ajout d'anticorps, d'inhibiteurs, de peptides ou d'acides nucléiques afin de perturber divers aspects phénotypiques et moléculaires des cellules dormantes et déterminer leur rôle dans le maintien de l'état de dormance. Les résultats montrent le nombre et l'apparence des colonies en croissance et des colonies dormantes, qui résultent du traitement des cellules incubées avec le FGF deux sur des pla

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Une modification en 3-D in vitro du système est présenté dans lequel les caractéristiques de croissance de plusieurs lignées cellulaires tumorales dans la membrane basale reconstituée en corrélation avec le comportement en sommeil ou de prolifération de cellules tumorales dans un site métastatique...

Une In Vitro Système d&#39;étude dormance tumorale et le commutateur à la croissance métastatique

Les modèles animaux sont fréquemment utilisés pour étudier la métastase du cancer de l'os. Dans ce protocole, nous allons décrire deux méthodes courantes de inoculation de la tumeur pour les études de métastases osseuses et décrire brièvement quelques-unes des analyses utilisés pour surveiller et quantifier ces modèles.

Modèles de métastases osseuses

Le cancer est une maladie complexe qui est influencé par les tissus entourant la tumeur ainsi que locale pro- et anti-inflammatoires des médiateurs. Par conséquent, les modèles d'injection orthotropes, plutôt que sous-cutanées modèles peuvent être utiles pour étudier la progression du cancer d'une manière qui imite mieux de pathologie humaine.

Injection Orthotopique des cellules du cancer du sein dans le Fat Pad mammaire de souris pour étudier la croissance de la tumeur.

Nous avons développé un nouveau modèle ex vivo pour étudier l'action des hormones dans le sein humain. Il est basé sur les microstructures de tissu isolé à partir d'échantillons de tissus mammaires chirurgicales qui conservent l'architecture des tissus, des interactions intercellulaires, et la signalisation paracrine.

Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle pour étudier action hormone dans le sein humain

Les protocoles sont décrits pour l'étude de la migration des cellules de cancer du sein, de la prolifération et de la colonisation dans un système de modèle d'expiant de tissu osseux humain.

Méthodes pour explants de tissus en culture fémur humain pour étudier le cancer du sein cellulaire colonisation de la Niche métastatique

Le présent rapport résume un protocole qui peut être utilisé pour modéliser l’influence de la niche du microenvironnement de la moelle osseuse sur les cellules leucémiques en mettant l’accent sur l’enrichissement de la sous-population la plus chimiorésistante.

Modélisation chimiothérapie leucémie résistant<em&gt; In Vitro</em

Ce manuscrit décrit le développement d’un modèle animal qui permet de tester directement les effets de l’hypoxie tumorale sur les métastases et de déchiffrer les mécanismes de son action. Bien que les expériences décrites ici se concentrent sur le sarcome d’Ewing, une approche similaire peut être appliquée à d’autres types de tumeurs.

Modèle in vivo pour tester l&#39; effet de l&#39; hypoxie sur la tumeur métastase

Ce protocole décrit le développement d’un in vitro humain modèle préclinique d’osteoclastogenesis de monocytes du sang périphérique, cultivées avec des lignées de cellules cancéreuses du sein pour imiter l’interaction cellule-ostéoclastes de cancer. Le modèle pourrait être utilisé pour approfondir nos connaissances de la formation de métastases osseuse et améliorer les options thérapeutiques.

Développement d’un humain modèle préclinique de Osteoclastogenesis de Monocytes du sang périphérique conjointement mis en culture avec des lignées cellulaires de Cancer du sein

Le modèle de la matrice extracellulaire (BEM) OS pour l’ostéosarcome (OS) est bien établie et illustré ici. Il peut être utilisé comme un échafaudage approprié pour imiter tumeur primitive la croissance in vitro et fournissant un modèle idéal pour l’étude de l’hétérogénéité histologique et cytogéniques des OS.

Modèle de matrice extracellulaire OS en trois dimensions pour l’ostéosarcome

Les modèles de xénogreffes dérivées de patients (PDX) et les modèles murins génétiquement modifiés transplantables récapitulent fidèlement les maladies humaines et sont des modèles préférés pour la recherche fondamentale et translationnelle sur le cancer du sein. Ici, une méthode est décrite pour transplanter orthotopiquement des fragments de tumeur mammaire dans le coussinet adipeux mammaire afin d’étudier la biologie tumorale et d’évaluer la réponse médicamenteuse.

Transplantation orthotopique de tumeurs mammaires comme modèles précliniques pour le cancer du sein

La diaphonie entre les cellules épithéliales mammaires et les cellules endothéliales contribue de manière importante à la progression du cancer du sein, à la croissance tumorale et aux métastases. Dans cette étude, les sphéroïdes ont été fabriqués à partir de cellules cancéreuses du sein avec des cellules endothéliales vasculaires et / ou lymphatiques et démontrent leur applicabilité en tant que système in vitro pour la recherche sur le cancer du sein.

Les sphéroïdes épithéliaux et endothéliaux mammaires comme modèle fonctionnel in vitro potentiel pour la recherche sur le cancer du sein

Découvrez un modèle in vitro de dormance pour les cellules de cancer du sein sensibles aux œstrogènes dans la moelle osseuse. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes moléculaires et de générer des hypothèses pour des tests in vivo.

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