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L'objectif général de l'expérience suivante est d'appliquer ce modèle de dormance in vitro afin d'étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires et de générer des hypothèses à tester dans des modèles in vivo plus complexes sur le plan biologique. Cela est réalisé en cultivant des cellules cancéreuses du sein positives pour les œstrogènes dans des plaques de culture tissulaire à matrice de fibrine à densité confluente, où leurs interactions se font principalement avec le substrat et non entre elles. Dans une deuxième étape, un état de dormance est activé dans certaines des cellules positives pour les œstrogènes, état soutenu et maintenu par le FGF-2 et la fibronectine, représentatifs des cellules cancéreuses du sein présentes dans la moelle osseuse.

Ensuite, le système est perturbé par l'ajout d'anticorps, d'inhibiteurs, de peptides ou d'acides nucléiques afin de perturber divers aspects phénotypiques et moléculaires des cellules dormantes et déterminer leur rôle dans le maintien de l'état de dormance. Les résultats montrent le nombre et l'apparence des colonies en croissance et des colonies dormantes, qui résultent du traitement des cellules incubées avec le FGF deux sur des plaques revêtues de fibronectine. Cette méthode peut aider à identifier les voies de signalisation, les molécules d'adhésion ou d'autres mécanismes moléculaires spécifiques responsables du développement et du maintien de la dormance dans les cellules cancéreuses du sein dépendantes des œstrogènes situées dans le microenvironnement de la moelle osseuse.

Pour commencer, aspirez le milieu de culture à partir de plaques présentant environ 50 % de confluence avec les lignées cellulaires CF sept et rincez-les avec du PBS préchauffé. Ajoutez ensuite un millilitre de solution de trypsine-EDTA 0,25 % dissoute dans du milieu DMEM à forte teneur en glucose et sans sérum de veau fœtal. Incubez les plaques de une à quatre minutes à 37 degrés Celsius, le temps que les cellules commencent à se détacher.

Une fois que les cellules se sont détachées de la plaque et commencent à former une suspension monocellulaire, dispersez les agrégats cellulaires résiduels en pipetant plusieurs fois de haut en bas avec une pipette de deux millilitres. Si des agrégats cellulaires persistent après quatre minutes de trypsine, jetez les cellules et préparez de nouvelles cellules en culture, car les cellules restant adhérentes entre elles après quatre minutes risquent d'introduire une erreur lors du décompte du nombre de colonies. Plaquez les cellules trypsinisées et remettez-les en suspension à raison de 1 500 cellules par millilitre dans le milieu de culture. Utilisez une pipette de cinq millilitres pour mélanger délicatement la suspension cellulaire en pipetant doucement de haut en bas. Comptez les cellules et vérifiez qu’elles sont principalement sous forme monocellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé.

Cela peut également être effectué manuellement à l’aide d’une chambre de comptage au microscope à contraste de phase. Prélevez ensuite trois millilitres de la suspension cellulaire et répartissez un millilitre dans deux puits d’une plaque de 24 puits revêtue de fibronectine à la fois. Pour optimiser la distribution spatiale des cellules, veillez à pipeter la suspension au centre du puits et à ne pas déplacer davantage la plaque avant que les cellules ne se déposent et n’adhèrent.

Replacer la suspension cellulaire restante dans le mélange cellulaire principal et mélanger à nouveau les cellules avant de prélever trois autres millilitres. Cette procédure permet de réduire la variabilité du nombre de cellules, car celles-ci sédimentent continuellement dans le tube, et la pipette travaille rapidement pour distribuer les grands volumes de cellules, étant donné que laisser les cellules en suspension à température ambiante et sous concentration de CO₂ modifie leur potentiel congénique. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de CO₂. Ceci correspond au jour moins un.

Dans l'échéancier de l'expérience. Au jour zéro du test, remplacer le milieu par un millilitre de milieu frais ou de milieu frais contenant 10 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance des fibroblastes. Le faible nombre de cellules dans un puits après six jours n'aura pas d'incidence significative sur la composition en nutriments ou en cytokines, ni sur le pH du milieu initial.

Le troisième jour, ajouter 100 microlitres d'une solution contenant 10 x la concentration finale prévue d'un agent perturbateur, tel qu'un inhibiteur de la PI 3-kinase, le contrôle négatif LY 2 9 4 0 0 2, le LY 3 0 3 5 1 1 ou un contrôle de milieu, au millilitre de milieu déjà présent dans les puits, et laisser les solutions se mélanger par diffusion. Remettre la plaque dans l'incubateur pendant trois jours supplémentaires. Le sixième jour, dissoudre 0,1 % de violet de crésyl dans une solution composée de deux pour cent d'éthanol et de 10 millimolaires de borate de sodium.

À pH 9, aspirez ensuite le milieu des puits et ajoutez un millilitre de solution de violet de crésyl dans chaque puits pendant 20 minutes. Configurez la station de rinçage en plaçant un seau à glace dans l'évier et en faisant couler continuellement de l'eau dans le seau ; lavez les plaques en les immergeant dans l'eau, les ouvertures des puits orientées vers le bas selon un angle aigu par rapport au seau. Inclinez la plaque à un angle horizontal une fois sous l'eau afin que les ouvertures des puits soient dirigées vers le bas.

Ensuite, inclinez la plaque de manière à former un angle aigu et retirez-la d’un seul mouvement doux et continu. Répétez l’immersion deux ou trois fois jusqu’à ce que l’eau au fond des puits n’apparaisse plus bleue. Puis placez les plaques à l’envers sur des essuies en papier sur le plan de travail pour les laisser sécher toute la nuit.

Une fois sec, placer la plaque sous un microscope inversé à contraste de phase et compter le nombre de colonies en croissance et de colonies dormantes dans chaque puits. À un grossissement de 40 x, compter comme colonies en croissance celles composées de plus de 30 cellules et comme colonies dormantes celles composées de 12 cellules ou moins. Voici l'aspect typique d'une colonie en croissance et d'une colonie dormante.

Les colonies en croissance contiennent plus de 30 cellules, tandis que les colonies dormantes en comptent 12 ou moins, ces dernières étant plusieurs fois plus grandes que les cellules en croissance, avec des rapports cytoplasme/noyau élevés, en l'absence d'ajout de FGF deux au milieu de culture. Les colonies sont principalement constituées de clones en croissance. En présence de FGF deux, la grande majorité des clones deviennent dormants ; l'effet d'agents supplémentaires peut également être évalué à l'aide de ce système. Ici, deux agents perturbateurs, à des concentrations préalablement déterminées, ont été ajoutés aux puits au troisième jour du test congénique.

La figure illustre une inhibition préférentielle des clones dormants par l'inhibiteur de la PI 3-kinase LY 294 002, mais aucun effet avec le témoin négatif LY 303 511. Ces expériences peuvent aider à comprendre les éléments régissant la dormance et la résistance aux traitements. Ici, les cellules dormantes survivantes traitées avec l'inhibiteur de la PI 3-kinase ont perdu leur aspect étalé, sont devenues petites et dendritiques, et présentaient un aspect altéré.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mettre en place ce dosage congénique pour faire croître des cellules en dormance, comment perturber les cellules en ajoutant des inhibiteurs spécifiques ou des agents perturbateurs après l’établissement de la dormance, et comment quantifier l’effet de ces agents perturbateurs. Ce dosage permet d’évaluer à la fois des résultats quantitatifs et qualitatifs en comptant les colonies dormantes ou en mesurant un grand nombre d’événements ultrastructuraux, immunophénotypiques ou moléculaires dans les cellules dormantes et perturbées. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.