Quantification de la protection neurovasculaire Après répétitive hypoxique préconditionnement et transitoire Moyen Cerebral Artery Occlusion chez la souris

L'objectif général de l'expérience suivante est de quantifier la neuroprotection après un conditionnement hypoxique répétitif, ou RHP, en mesurant simultanément le volume de l'infarctus et l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Ceci est réalisé en soumettant des souris à neuf expositions hypoxiques stochastiques, variant en durée et en intensité, afin d'assurer une protection neurovasculaire contre l'ischémie cérébrale. Un accident vasculaire cérébral est ensuite provoqué chez la souris, suivi d'une injection de bleu d'Evans.

Le bleu d’Evan se lie sélectivement à l’albumine et permet la quantification de la rupture de la barrière hémato-encéphalique après sacrifice de l’animal suite à l’injection. Le cerveau est prélevé et coloré au TTC afin de quantifier le volume d’infarctus. Les résultats montrent les effets neuroprotecteurs d’un conditionnement préalable répété à l’hypoxie chez la souris après un accident vasculaire cérébral ischémique.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la préconditionnement hypoxique par exposition unique, est que le RHP produit une neuroprotection pendant au moins huit semaines chez la souris. Cette méthode de quantification double permet de répondre à des questions clés dans la recherche sur l'accident vasculaire cérébral, telles que la manière de mesurer simultanément les volumes d'infarctus et la rupture de la barrière hémato-encéphalique. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour fournir des informations sur l'accident vasculaire cérébral ischémique, le RHP peut également être appliqué à d'autres affections inflammatoires systémiques et au système nerveux central. Pour commencer, diviser les souris en deux groupes.

Le groupe RHP, qui reçoit des expositions à 8 % et 11 % d'oxygène, et le groupe témoin, qui reçoit simultanément des expositions à 21 % d'oxygène, retirent le couvercle supérieur du filtre de chaque cage et placent la cage, avec ses bouteilles d'eau et de nourriture intactes, dans les chambres raccordées à leurs réservoirs d'oxygène respectifs. Fermez et fixez le couvercle de la chambre. Ouvrez la vanne principale du gaz pour les réservoirs et réglez le débit initial pour chaque chambre d'induction à deux litres par minute, ou LPM.

Après cinq minutes d'exposition, réduire le débit à un litre par minute pour la durée restante de l'exposition. À la fin de l'exposition, réduire le débit à zéro litre par minute et fermer la vanne de gaz. Pour les réservoirs.

Ouvrir les couvercles des chambres et remplacer le couvercle supérieur à filtre sur chaque cage. Placer les cages dans un logement standard jusqu’à la prochaine exposition hypoxique. Vaporiser chaque chambre d’induction avec un désinfectant et un désodorisant après chaque utilisation.

Exposer les souris RHP et les souris témoins au même moment de la journée pendant les deux semaines du protocole. Ensuite, réaliser une occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne ou A-T-M-C-A-O comme décrit dans le texte. L'injection d'EB doit être effectuée 22 heures après la reperfusion et doit circuler dans la circulation sanguine pendant deux heures avant la coloration NTTC et l'euthanasie.

Préparez la quantité d'EB nécessaire pour l'injection. Ensuite, aspirez la quantité souhaitée à température ambiante dans une seringue à insuline de 0,3 cm³. À l’aide d’une aiguille de 29 gauge, immobilisez la souris à l’aide d’un réticulateur à fond plat.

Tenez la queue de manière à ce que la veine latérale soit en position supérieure. Les veines latérales se situent de chaque côté de la ligne médiane de la queue. Maintenez la pointe de la queue afin de stabiliser la souris pendant l'injection.

Insérez l'aiguille dans la veine sur une distance d'environ trois à cinq millimètres. En prenant soin de ne pas perforer la veine, injectez tout le colorant sur une période d'une minute. Si la solution pénètre correctement dans la veine, il devrait y avoir une résistance minimale lorsqu'une pression est appliquée sur la seringue.

Confirmer une administration veineuse systémique réussie d'EB par un changement de couleur immédiat des membres caudaux et des yeux de la souris. Retirer l'aiguille de la queue et appliquer doucement une pression à l'aide d'une compresse propre afin d'arrêter le saignement. Commencer le chronométrage.

Lorsque la peau de la souris devient bleue, laissez circuler l'EB pendant deux heures afin qu'il pénètre la barrière hémato-encéphalique affaiblie. La perfusion et la coloration au TTC doivent être réalisées 24 heures après la reperfusion, soit 24 heures après l'occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne (T-M-C-A-O), et deux heures après l'administration de l'EB. Sacrifiez l'animal par une surdose d'isoflurane dans une petite chambre d'induction. La perfusion doit commencer immédiatement après le sacrifice afin de minimiser l'autolyse, qui débute en l'absence d'oxygène après la mort.

Fixez rapidement l'animal sur une plateforme en polystyrène, les avant-bras immobilisés par les pattes. Pratiquez une incision latérale à travers la paroi abdominale depuis la ligne médiane, juste sous la cage thoracique. Coupez soigneusement à travers le diaphragme pour exposer le cœur.

Démarrez la pompe de perfusion à un débit de cinq millilitres par minute avec une seringue de 60 cm³ remplie de solution saline tamponnée au phosphate glacée 0,01 molaire ou PBS, reliée à une aiguille d'infusion ailetée de calibre 27. Insérez l'extrémité de l'aiguille d'environ 0,5 centimètre dans le ventricule gauche du cœur et sectionnez l'oreillette droite. Un flux sanguin veineux progressivement dilué doit s'écouler de l'oreillette durant la perfusion jusqu'à ce que le sang veineux apparaisse. Une fois le cœur parfaitement perfusé, faites circuler 30 millilitres de PBS 0,01 molaire incolore à travers le cœur.

Ensuite, ajoutez cinq millilitres de solution de TTC dans des flacons scintillants transparents de 20. Immédiatement après la perfusion, décapitez les animaux et retirez les cerveaux à l’aide de petites ciseaux et, si nécessaire, d’une spatule. Vérifiez que l’hémisphère controlatéral par rapport à l’artère cérébrale moyenne obstruée apparaît pâle, sans fuite notable de bleu d’Evan (EB) ni œdème.

Ensuite, versez du PBS dans une matrice cérébrale en acrylique conçue pour réaliser des coupes coronales de 1,0 millimètre d'épaisseur d'un cerveau de souris. Placez le cerveau, côté dorsal vers le haut, dans la matrice et versez immédiatement du PBS sur le cerveau. Gardez le cerveau humide.

Retirez les bulbes olfactifs en insérant une lame en acier inoxydable de 0,21 millimètre d'épaisseur dans la deuxième fente à partir du côté rostral de la matrice. Ensuite, retirez le cervelet en insérant une lame dans la quatrième fente à partir du côté caudal de la matrice. Insérez une lame dans la fente centrale parmi les fentes restantes de la matrice.

Insérez ensuite les lames restantes de manière à diviser uniformément les tissus restants afin d'assurer une répartition aussi homogène que possible du tissu pendant la découpe. Une fois toutes les lames insérées, ajoutez une à deux gouttes de PBS sur le cerveau pour l'humidifier. Ensuite, retirez les lames une par une de la matrice en commençant par la région rostrale.

Garder les sept premières tranches pour l'analyse au TTC. Après T-M-C-A-O, utiliser une petite spatule pour transférer délicatement les tranches de la lame vers le flacon rempli de TTC. Une fois toutes les sections placées dans le flacon, le boucher et le placer dans un bain-marie tiède jusqu'à ce que les sections deviennent roses.

Retournez délicatement le flacon dans le bain si nécessaire afin d'éviter le chevauchement des sections, ce qui pourrait entraîner une coloration inégale. Éliminez ensuite le TTC et versez une solution de paraformaldéhyde à 4 % dans le flacon pour recouvrir les sections cérébrales. Cette étape met fin à la réaction chimique du TTC.

Disposez immédiatement les sections sur une lame en verre propre de dimensions une sur trois pouces et orientez-les de la partie rostrale à la partie caudale lorsque vous les placez sur la lame. Numérisez la lame. À l’aide d’un scanner standard, réglez la résolution à un minimum de 600 DPI pour l’analyse d’image.

Veillez à inclure le nom de l'animal et une règle métrique sur l'image numérisée. Enfin, retournez la lame et numérisez le verso afin de vous assurer que toutes les données sont recueillies. Le RHP réduit les volumes d'infarctus de 46 % par rapport aux souris témoins, mais n'a aucun effet sur le gonflement hémisphérique dérivé des données TTC obtenues chez les mêmes animaux.

Le RHP réduit la perturbation de la barrière hémato-encéphalique définie par la fuite de bleu d'Évans normalisée par rapport à l'hémisphère controlatéral, avec des colorations TTC représentatives provenant à la fois des souris traitées au RHP et des témoins exposés à 21 % d'oxygène. Les souris sont présentées avec les volumes d'infarctus correspondants et la fuite de bleu d'Évans indiquée sous chaque échantillon. L'ipsilatéral désigne l'hémisphère cérébral ischémique et le controlatéral, le côté non affecté du cerveau.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'injecter le bleu d’Evan 22 heures après la fusion et de permettre sa circulation pendant deux heures avant la mise à mort de l’animal après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche préclinique sur les accidents vasculaires cérébraux pour explorer les mécanismes de protection endogène contre l’AVC chez les souris. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension claire de la manière de mesurer l’effet neuroprotecteur du RHP grâce à la double quantification de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique et des volumes d’infarctus.