Name: Un test pour mesurer les effets de léthanol sur la vitesse de Locomotion Caenorhabditis elegans /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Découvrez un test comportemental pour mesurer les effets de l'éthanol sur la vitesse de locomotion de Caenorhabditis elegans. Cette méthode quantifie la sensibilité initiale et le développement de la tolérance fonctionnelle aiguë.

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Ces études ont été soutenus par des subventions des Instituts nationaux de la santé, Institut national de l&#39;alcoolisme et l&#39;abus d&#39;alcool: R01AA016837 (JCB) et P20AA017828 (AGD et JCB).

1. Etapes à effectuer le jour avant la Assay <ol><li> Choisissez les vers de la scène à L4 milieu de croissance des nématodes frais (NGM) plaques ensemencées avec une pelouse de OP50 E. coli, et de la culture eux à 20 CO / N. Chaque condition d&#39;essai nécessite 10 vers; chercher un excès de vers pour permettre O / N perte de vers. <ol><li> Seuls les animaux dosage qui sont adultes premier jour; de nombreux mutants se développent à une vitesse plus lente que le type sauvage. Réglez le moment de la cueillette pour les souches qui ont des retards de développement, afin que tous les animaux testés sont adultes de la première jour. </li></ol></li></ol> 2. Etapes à effectuer sur le jour de l&#39;essai <ol><li> Préparation pour le test: <ol><li> Effectuer des essais sur 60 x 15 mm plaques NGM non ensemencés standard. Sécher toutes les plaques à utiliser à 37 ° C pendant 2 heures, avec des couvercles de congé. Pour chaque essai expérimental, utilisez quatre plaques NGM séchées; ce seront les 0 et 400 mm plaques de dosage de l&#39;éthanol et leurs plaques d&#39;acclimatation d&#39;accompagnement. NOTE:L&#39;utilisation de plaques NGM est important ici; différences dans la composition des plaques, en particulier leur osmolarité, peuvent affecter fortement la réponse à la dose d&#39;éthanol sur le comportement, ce est due, au moins en partie, à des changements dans la quantité d&#39;éthanol accumulé par les animaux 20. Agar NGM est de 160 mOsm. </li><li> Après séchage, peser chacune des plaques NGM non ensemencés pour être utilisé dans l&#39;essai et noter le poids. Déterminer le volume de milieu dans des plaques par rapport au poids d&#39;une plaque vide. Pour estimer le poids de conversion de la gélose au volume, supposons que le support pèse le même qu&#39;un volume égal d&#39;eau. NOTE: Nos résultats les plus constants ont été trouvés avec les médias NGM qui a suffisamment déshydratés qu&#39;un 10 volume d&#39;origine ml a un volume post-séchage entre 8.3 à 8.9 ml. Une alternative au temps de séchage de 2 heures est de sécher jusqu&#39;à ce que les plaques atteignent cette gamme de volume pour tenir compte des différences dans les incubateurs. </li><li> Faire fondre 4 anneaux de cuivre (diamètre interne de 1.6 cm) dans la surface de chacune des plaques d&#39;agir comme enclos pour les différents génotypes ou groupes de worms.Grasp chaque bague avec une pince, et le traitement thermique à flamme (une forte flamme d&#39;un brûleur Bunsen fonctionne bien) pour environ 3 sec. Placer immédiatement l&#39;anneau sur une plaque tout en maintenant la bague avec la pince pour l&#39;empêcher de «sauter». <ol><li> Assurez-vous que l&#39;anneau repose à plat sur la surface de la gélose en appuyant doucement avec la pince à plusieurs points sur l&#39;anneau. Lorsque vous placez l&#39;anneau, veillez à laisser de la place pour trois anneaux supplémentaires. </li><li> Faire fondre les trois anneaux de cuivre supplémentaires dans la surface de la plaque, en prenant soin de les placer aussi près que possible de sorte que tous les quatre seront dans le champ de vision de la caméra. NOTE: Faire une bonne étanchéité à l&#39;agar est essentiel de garder les vers dans les anneaux pendant l&#39;essai. Anneaux qui sautent autour sur la plaque sont peu susceptibles de faire l&#39;étanchéité correcte avec l&#39;agar etpeut cicatriser la gélose, qui permet aux vers de creuser et interfère avec la visualisation des vers. </li><li> Pour chaque plaque dosage préparer une plaque d&#39;accompagnement &quot;d&#39;acclimatation&quot;, qui devrait être séché et non ensemencées et recevra pas d&#39;éthanol. Placez quatre anneaux de cuivre sur ces plaques. </li></ol></li><li> Etiqueter le fond des assiettes à côté de l&#39;anneau avec la souche du ver à être utilisé dans le ring, en prenant soin de ne pas écrire dans le champ de vision de l&#39;anneau lui-même. Faites correspondre les étiquettes sur la plaque d&#39;essai avec sa plaque d&#39;acclimatation accompagnant. </li><li> Calculer la quantité de 100% d&#39;éthanol pour ajouter à chaque plaque de dosage de sorte que la concentration finale est de 0 mM ou 400 mM d&#39;éthanol (poids par volume). Pour chaque expérience (n = 1), il y aura une 0 mM et une plaque 400 mM d&#39;éthanol; plaques d&#39;acclimatation ne reçoivent pas l&#39;éthanol. Ajouter l&#39;éthanol, le pipetage autour de la surface de la plaque. Utilisez le film de laboratoire pour sceller la plaque et laisser se stabiliser sur la paillasse pendant 2 heures. </li><li> Lorsque 1,5 heure se est écoulée, commencer à l&#39;étape d&#39;acclimatation de l&#39;essai, l&#39;étape 2.2. </li></ol></li><li> Effectuer test de locomotion: plaques d&#39;essai <ol><li> Soigneusement transférer 10 vers de chaque groupe expérimental au centre d&#39;un anneau de cuivre sur la plaque d&#39;acclimatation. Enlevez tous les aliments qui est visible sur la gélose à ce point en grattant doucement avec le choix du ver. Variez l&#39;ordre dans lequel les groupes expérimentaux sont mis sur les plaques à travers des essais expérimentaux de sorte que les mêmes souches ne sont pas mis sur les plaques dans le même ordre entre les essais. NOTE: L&#39;objectif est de transférer les animaux à la plaque avec des quantités minimales de nourriture, parce que si la nourriture sur la plaque d&#39;acclimatation est transférée à la plaque de dosage, les vers vont se agréger autour de la nourriture et de l&#39;effet du médicament sur la locomotion sera obscurci. </li><li> Veillez à ne pas briser la surface de la gélose à la reprise, car cela va permettre aux vers de creuser et de perturber le test. Incuber les vers à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Assurez-vous que il ya un intervalle approprié entre les initiations de chaque plaque. Un expérimentateur expérimenté peut déplacer 40 animaux, 10 / ring pour quatre anneaux dans &lt;1,5 min, mais ne importe quel intervalle jusqu&#39;à 2 min est acceptable. Le test standard a l&#39;enregistrement de films à 10-12 min et 30-32 min d&#39;exposition à la fois pour 0 mM et de l&#39;éthanol 400 mM. </li><li> Initier la plaque d&#39;acclimatation pour l&#39;exposition 0 mM et la plaque d&#39;acclimatation pour l&#39;exposition de 400 mm environ 2 min et 30 sec en dehors pour permettre économie du premier fichier de film avant le deuxième film doit commencer. </li><li> Après la période d&#39;acclimatation de 30 minutes, les transférer vers des plaques d&#39;acclimatation aux plaques de dosage. Transférer les vers aux plaques d&#39;essai (0 mm ou 400 mm) éthanol dans le même ordre qu&#39;ils ont été ajoutés à la plaque d&#39;acclimatation, garder la trace de la synchronisation entre les finitions de chaque plaque. Sceller la plaque avec un film de laboratoire pour minimiser la perte d&#39;éthanol à la vaporisation. </li><li> USE mouvement d&#39;écopage avec un ver choix mince tranchant aplati pour recueillir vers le haut de la reprise aplatie. Effectuer le transfert de vers de la plaque d&#39;acclimatation non ensemencée à la plaque de dosage, sans l&#39;utilisation de bactéries, qui est couramment utilisé dans le transfert vers car il contribue à coller au ver de la reprise. NOTE: La vitesse à laquelle les animaux sont transférés à cette étape est très important parce que les premiers vers sur la plaque seront exposés à l&#39;éthanol plus que les derniers vers ajoutés à la plaque, et des points de temps antérieurs peut montrer certains effets dépendant du temps. Ce est la principale raison pour faire tourner les souches sont placés sur une première plaque travers répétitions expérimentales. </li></ol></li><li> Effectuer Locomotion Assay: Tournage <ol><li> Utiliser une combinaison microscope / de caméra qui permet de imagerie simultanée de tous les quatre anneaux dans le champ de vision (environ 42x42 mm 2 carré), tel qu&#39;un objectif de microscope 0,5x, 0,8x grossissement et une caméra avec un 2048x2048 7,481; m pixel CCD. </li><li> Utilisez un éclairage uniforme à travers le champ de vision, ce qui facilite la reconnaissance d&#39;objets à l&#39;étape de seuil d&#39;intensité (voir ci-dessous). A 3 &quot;x3&quot; rétro-éclairage fonctionne bien. </li><li> Image les vers sur une plaque positionnée médias vers le haut (couvercle vers le bas), ce qui génère contraste qui est perdue lorsque le rétroéclairage par rapport au microscope traditionnelle transmise source de lumière. </li><li> Préparer le logiciel d&#39;analyse d&#39;image pour capturer des films en accéléré des vers mobiles. Réglez le logiciel pour capturer des images 12 bits de gris toutes les 1 sec, comme un 2-min (120 images) film. Pour réduire la taille du fichier de sortie, tout en conservant une résolution d&#39;image suffisante, utiliser un mode de regroupement de 2x2 pour capturer des images de 1024x1024 pixels. </li><li> Enregistrer les films. Commencer l&#39;enregistrement d&#39;un film de 120 châssis de la première plaque (0 d&#39;éthanol mM) 10 min après la dernière des vers ont été placés sur cette plaque. Enregistrez le fichier de film. </li><li> Enregistrez la deuxième plaque (éthanol 400 mM). Répétez ce processus pourles deux plaques commençant 30 min après la dernière vers ont été placés sur la première plaque (0 mM d&#39;éthanol) pour capturer les points de temps de 30 à 32 min pour chaque exposition. NOTE: Prévoyez suffisamment de temps pour enregistrer les fichiers image après chaque session de capture avant de commencer l&#39;enregistrement de la plaque suivante à analyser. </li><li> Pour l&#39;avenir épreuvage des films archivés et pour permettre à ces films d&#39;être ouverts et analysés par d&#39;autres logiciels d&#39;imagerie open source dans le domaine public, tels que ImageJ 28, convertir une copie de chaque film à 8 bits 256 fichiers TIFF d&#39;échelle de gris. REMARQUE: Le logiciel d&#39;analyse d&#39;image décrit ici utilise un format de fichier propriétaire. </li></ol></li><li> Analyse des films en utilisant le logiciel ImagePro. <ol><li> Une fois capturé, analyser les films en utilisant plus le logiciel Image-Pro ou son équivalent. REMARQUE: Une variété d&#39;autres logiciels de suivi d&#39;objet est disponible qui a été utilisé pour suivre avec succès multiples C. elegans à un moment 29 et telslogiciel pourrait raisonnablement se substituer à celle décrite ici comme les étapes d&#39;identification de l&#39;objet sont fondées sur des principes similaires. La méthode décrite se rapporte aux versions Image-Pro Plus logiciels de 6,0 à 6,3 et 7,0, de nouvelles versions de Image-Pro Plus logiciels peut avoir des différences mineures. </li><li> Analyser les films dans les segments 2 min (120 images). En premier lieu, appliquer un filtre aux images pour aplatir le fond et à améliorer le contraste des objets à vis sans fin. Sélectionnez le filtre comme suit: Menu&gt; Processus&gt; Filtres&gt; Amélioration&gt; Aplatir: Paramètres: background = dark; Feature Largeur = 20 Pix. </li><li> Re-enregistrer les films après l&#39;étape de filtrage mais toujours garder le film original dans sa forme non filtré. <ol><li> Analyser le locomotion des animaux dans chaque cycle séparément avec une zone circulaire d&#39;intérêt (ROI) qui est placé et dimensionné pour recouvrir l&#39;anneau de cuivre. Identifier et suivre les vers avec le menu&gt; Mesure&gt; suivre les objets ... commande; cela soulève Tracking Dfenêtre de la table de ata. Le bouton Options de suivi permet pistes spécifiques à exclure et de limiter les artefacts expérimentaux. </li></ol></li><li> Sous l&#39;onglet Suivi automatique, utiliser les paramètres suivants: Paramètres Piste: limite de vitesse (recherche de rayon) = 400 um / cadre, Accélération limite = Auto, la longueur minimale d&#39;une plage totale = 400 um, le type de mouvement prédominante = chaotique; Objets dans les paramètres de pistes: Permettre aux pistes partielles = yes, longueur min = 21 cadres, suivi profondeur de prédiction = 1 cadre. </li><li> Pour lancer le processus de suivi, cliquez sur le Trouver toutes les pistes automatiquement touche fonction pour faire apparaître le / boîte de dialogue Options de taille de comte et la boîte de dialogue de suivi. Sélectionnez l&#39;option Manuel pour la sélection de gamme d&#39;intensité dans la boîte de dialogue comte / Taille, qui fournit l&#39;étape de seuil importante qui utilise l&#39;intensité d&#39;échelle de gris, le ver pixels de mettre en évidence un objet de ver pour analyse et d&#39;ignorer les légers fond pixels. <ol><li> Réglez le seuil d&#39;intensité sliDER (une pour définir la limite supérieure, une pour définir la limite inférieure) pour créer une gamme inclusive qui met en évidence tous les objets sombres. Une gamme de 0-1,500 sur une échelle de 0-4,095 est un bon point de départ pour le réglage plus fin. </li><li> Appliquer un filtre de taille pour exclure les objets qui sont plus grandes et plus petit qu&#39;un objet ver unique, comme l&#39;anneau de cuivre et tous les débris sur les plaques. Placer les deux paramètres de taille pour ce faire que couvrent tailles pour chaque ver dans une variété de postures avec la mesure&gt; sélectionner les mesures élément de menu sur la boîte de dialogue des options comte / Taille. (Gamme Area: 28,000-120,000 um 2 et la gamme Périmètre: 600-2,500 um). </li><li> Si une souche mutante est nettement plus petit ou plus grand que les autres animaux sur la plaque pour être analysé, élargir la gamme des paramètres de filtre pour la reconnaissance d&#39;objet pour accueillir les différentes tailles des souches avant de suivre les animaux afin que les paramètres ne ont pas besoin d&#39;être changé mi-analyse. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Achever le processus de suivi en cliquant sur Continuer dans la boîte de dialogue de suivi. Comparer visuellement les pistes de sortie avec les progrès de chaque ver dans le film afin de se assurer que chaque ver est représenté moins qu&#39;il y ait une raison valable pour exclure sur la base des réglages automatiques de filtrage. Supprimez manuellement les pistes qui ont été produites par la présence d&#39;objets non-ver confirmés qui répondaient aux critères de filtrage de taille. </li><li> Utilisez le logiciel pour calculer la vitesse de chaque ver entre chaque cadre (distance parcourue pour le centre de gravité d&#39;un objet par une sec entre les cadres) et afficher la vitesse moyenne pour chaque piste et la vitesse moyenne sur toutes les pistes pour la population de vers dans le anneau de cuivre. Considérez cette moyenne finale soit n = 1 en termes d&#39;essais expérimentaux. Exporter les données vers un tableur pour les analyses statistiques et l&#39;archivage des données. </li><li> Une fois que les données ont été enregistrées pour le premier anneau sur la plaque, déplacer le ROI à l&#39;anneau suivant etrépéter le processus de suivi, sans modifier les paramètres. </li><li> Calculer la vitesse relative de la locomotion à travers: </li><li> La vitesse relative (%) = traité (400 mM) de vitesse / non traitée (0 mm) Vitesse x 100. REMARQUE: les manipulations génétiques différentes modifient souvent le taux de la locomotion de base des animaux. Afin de déterminer l&#39;effet de l&#39;éthanol sur la vitesse de locomotion des animaux et d&#39;être en mesure de comparer ces effets à travers différents génotypes ou conditions, calculer une vitesse relative. </li></ol></li></ol>

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<li>Newlin, D., Thomson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+challenge+with+sons+of+alcoholics%3A+a+critical+review+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Alcohol challenge with sons of alcoholics: a critical review and analysis.</a> Psychol. Bull. 108, 383-402 (1990).</li>
<li>Ponomarev, I., Crabbe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+assess+initial+sensitivity+and+acute+functional+tolerance+to+hypnotic+effects+of+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">A novel method to assess initial sensitivity and acute functional tolerance to hypnotic effects of ethanol.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 257-263 (2002).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHusson%2C+SJ+%22WormBook%22">WormBook</a>. , The C. elegans Research Community. (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

La neurobiologie simple et des outils génétiques disponibles en C. elegans faire le ver un excellent modèle pour étudier les bases moléculaires des effets de l&#39;éthanol sur le comportement. Ici, nous décrivons un test qui a été utilisé pour identifier plusieurs médiateurs moléculaires et environnementaux de la réponse comportementale aiguë en éthanol 8,10,20,24,25. Cette méthode permet la différenciation et l&#39;examen simultané des deux phénotypes de comportement de réponse de l&#39;éthanol, dif...

Les troubles liés à l'alcool (AUD) sont répandus et produisent de graves problèmes de santé, sociaux et économiques. Chez les humains, la susceptibilité à développer un AUD est fortement influencée à la fois par la génétique et l'environnement1,2. Un fort prédicteur physiologique de la propension à l'abus est le niveau initial de réponse (LR) à l'alcool (éthanol) qui est démontré par les buveurs novices3-5. Ce phénotype LR est influencé par des composants génétiques et non génétiques6. La détermination des mécanismes moléculaires qui influencent la LR à l'éthanol est un objectif important de l'étude des comportements de réponse à l'éthanol.
Le nématode, Caenorhabditis elegans, a été de plus en plus utilisé comme modèle pour étudier les effets de l'éthanol sur le comportement7-9. Il existe une forte conservation moléculaire dans le mécanisme de la fonction du système nerveux entre les vers et les mammifères, et plusieurs gènes qui ont montré influencer la LR à l'éthanol chez les vers ont montré influencer la LR à l'éthanol chez les mammifères10-16, et ont été impliqués dans la propension à l'abus chez les humains17-19.
L'éthanol intoxique les vers, ce qui se reflète dans une diminution de leur vitesse de locomotion. Plusieurs laboratoires différents ont développé des tests comportementaux qui diffèrent de plusieurs façons, par exemple, le comportement de locomotion qu'ils étudient (rampement versus nage11,12,14,20,21) ou la composition des solutions dans lesquelles les tests sont effectués (milieu de croissance des nématodes versus solution saline de Dent20,22). Il est intéressant de noter que ces tests divers ont donné des profils de réponse à la dose quelque peu différents pour les effets de l'éthanol. Ces résultats ont mis en évidence d'importantes différences dans les comportements sous-jacents du rampement et de la nage9,23, ainsi qu'un rôle pour la variable environnementale osmolarité dans les réponses à l'éthanol20, et ont souligné l'importance de décrire les détails expérimentaux des divers tests.
Un test pour mesurer les effets aigus de l'éthanol sur le comportement de rampement est présenté ici. Ce test a été largement utilisé pour étudier les influences génétiques et environnementales sur la LR à l'éthanol8,10,20,24,25. Le phénotype LR chez les mammifères est un composite d'au moins deux composants, sensibilité initiale à l'éthanol et tolérance fonctionnelle aiguë à l'éthanol26,27. Chez les vers, le phénotype LR a été montré être séparable en ces deux composants grâce à l'utilisation de ce test comportemental. Les influences des manipulations génétiques et environnementales sur les deux phénotypes peuvent être examinées en utilisant ce seul test. Il est important de noter que ces deux phénotypes sont génétiquement séparables.

<table><tbody><tr><td>C. elegans strains</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm Petri plates, triple vented</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628161</td><td>D'autres marques de plaques feront l'affaire.</td></tr><tr><td>NGM agar</td><td>Various</td><td></td><td>NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2,5 g/L), 1 ml de cholestérol (5 mg/ml dans l'éthanol), 1 ml (1 M) de MgSO4, 1 ml (1 M) de CaCl2, 25 ml (1 M) de KPO4, pH=6, 975 ml d'H2O</td></tr><tr><td>Pinces</td><td>Various</td><td></td><td>par exemple, Fisher Scientific #10300</td></tr><tr><td>Incubateur à 37 &deg;C</td><td>Various</td><td></td><td>Pour le séchage de l'agar</td></tr><tr><td>Balance numérique</td><td>Various</td><td></td><td>Pour déterminer le poids des plaques et le volume d'agar</td></tr><tr><td>Anneaux en cuivre</td><td>Plumbmaster</td><td>STK#35583 (48 cap thread gasket)</td><td>Anneaux en cuivre de 1,6 cm de diamètre intérieur et 1,8 cm de diamètre extérieur</td></tr><tr><td>Éthanol à 100%</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Caméra CCD</td><td>QImaging</td><td>RET-4000R-F-M-12</td><td>Cette caméra a un large champ de vision.</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope avec montage C et objectif 0,5X</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Modèle abandonné, le M60 est l'équivalent actuel.</td></tr><tr><td>Source lumineuse</td><td>Schott</td><td>A08923</td><td>Rétroéclairage de 3&rdquo;x3&rdquo;&nbsp; pour une illumination uniforme sur le champ de vision</td></tr><tr><td>Logiciel d'imagerie et de suivi</td><td>Media Cybernetics</td><td>ImagePro-Plus v6.0-6.3</td><td>Les versions plus récentes du logiciel ont des fonctions de suivi.</td></tr></tbody></table>

un test pour mesurer les effets de l&#39;éthanol sur la vitesse de locomotion<em&gt; caenorhabditis elegans</em

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Les troubles liés à la consommation d'alcool constituent un problème de santé publique important, pour lequel il existe peu de stratégies de traitement efficaces. Une difficulté qui a retardé le développement de traitements plus efficaces est le manque relatif de compréhension des fondements moléculaires des effets de l'éthanol sur le comportement. Le nématode, Caenorhabditis elegans (C. elegans), fournit un modèle utile pour générer et tester des hypothèses sur les effets moléculaires de l'éthanol. Ici, nous décrivons un test qui a été développé et utilisé pour examiner les rôles de gènes particuliers et de facteurs environnementaux dans les réponses comportementales à l'éthanol, dans lequel la locomotion est la réponse comportementale. L'éthanol provoque de manière dose-dépendante une dépression aiguë du déplacement sur une surface de gélose. Les effets sont dynamiques ; les animaux exposés à une forte concentration démontrent une dépression initiale forte du déplacement, appelée ici sensibilité initiale, puis récupèrent partiellement la vitesse de déplacement malgré la présence continue du médicament. Cette plasticité comportementale induite par l'éthanol est appelée ici le développement d'une tolérance fonctionnelle aiguë. Ce test a été utilisé pour démontrer que ces deux phénotypes sont distincts et génétiquement séparables. Le test de locomotion simple décrit ici convient à l'examen des effets des manipulations génétiques et environnementales sur ces réponses comportementales aiguës à l'éthanol chez C. elegans.

Les données représentatives (figure 1) de plusieurs génotypes différents et leurs contrôles appariés sont présentés 8,24; données ont été spécifiquement choisis que les différences de mettre en évidence chez les animaux testés. Le degré d&#39;effet à 10 min de l&#39;exposition est considérée comme la sensibilité initiale d&#39;une souche, qui est représentée sur les axes de gauche de la figure 1B-G. Les souches mutantes avec une vitesse relative plus grande que le contrôle à ...

C. elegans est un modèle utile pour étudier les effets de l'éthanol sur le comportement. Nous présentons un test comportemental qui quantifie les effets de l'éthanol sur la vitesse de locomotion des vers rampants ; la sensibilité initiale et le développement d'une tolérance fonctionnelle aiguë à l'éthanol peuvent tous deux être mesurés avec ce test.

Un test pour mesurer les effets de l&#39;éthanol sur la vitesse de Locomotion<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

L'objectif global de cette procédure est de quantifier l'effet de l'alcool sur les organes CL de différents génotypes d'une manière cohérente. Cela est réalisé en créant d'abord une assiette d'agar contenant de l'alcool avec des anneaux de cuivre incrustés dans la surface pour regrouper les animaux. Ensuite, les différents génotypes sont regroupés séparément et exposés à l'alcool. Pendant l'exposition, des données vidéo sont collectées à des moments définis.La dernière étape est la mesure de la vitesse de chaque génotype à l'aide d'un logiciel de reconnaissance d'objets. Finalement, une comparaison des vitesses aux points de temps précoces et tardifs est utilisée pour découvrir une sensibilité anormale ou le développement d'une tolérance à l'alcool. Les génotypes spécifiques.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, qui comparent les génotypes sur différentes assiettes, est que la variation environnementale est réduite. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal à cueillir les vers à l'aide d'une pointe nue Le jour précédant l'analyse. Prenez quatre vers L de stade 4 sur des assiettes NGM fraîches Asseyez-vous avec une pelouse de culture E coli OP 50, les assiettes à 20 degrés Celsius toute la nuit, l'analyse nécessite des 60 par 15 millimètres standard non assis.Les assiettes NGM sèchent toutes les assiettes à utiliser à 37 degrés Celsius pendant deux heures avec leurs couvercles ouverts. Chaque essai nécessite quatre assiettes. L'utilisation d'assiettes NGM est importante ici.Les différences dans la composition des assiettes. En particulier, leur osmolarité peut fortement affecter l'éthanol réactif à la dose sur le comportement. Cela est dû au moins en partie aux changements dans la quantité d'éthanol accumulée par les animaux Une fois séchées, pesez chacune des assiettes NGM non assises.Utilisez ce poids pour déterminer le volume de milieu sur chaque assiette, en supposant que le milieu pèse autant que l'eau. Ensuite, prévoyez de faire fondre quatre anneaux de cuivre d'un diamètre intérieur de 1,6 centimètre dans chaque assiette, afin qu'ils puissent être vus par la caméra simultanément. En utilisant des pincettes.Mangez chaque anneau dans une flamme pendant environ trois secondes et mettez immédiatement l'anneau sur l'assiette sans le laisser tomber. Appuyez ensuite doucement l'anneau à quelques endroits pour le fixer le long de la périphérie. Étiquetez les assiettes avec la souche qui sera dans chaque anneau.Maintenant, calculez la quantité d'éthanol à 100% nécessaire pour obtenir une concentration pondérale de 400 millimolaires en volume sur l'assiette. Chargez ensuite la moitié des assiettes avec de l'éthanol en versant l'éthanol à partir d'une pipette. Laissez toutes les assiettes préparées s'équilibrer pendant deux heures avant de commencer l'expérience.Pour commencer, prenez deux minutes ou moins pour transférer 10 vers de chaque groupe expérimental au centre d'un anneau de cuivre sur une assiette d'acclimatation. C'est une assiette sans éthanol. Évitez de transférer de la nourriture avec les vers car cela réduira leur mouvement.Évitez également d'endommager la surface de l'agar car les vers se creuseront. Enregistrez l'heure de chargement sur l'assiette et assurez-vous d'espacer le transfert des vers sur chaque assiette de plus de deux minutes, afin que chaque assiette puisse être filmée individuellement à l'intervalle de temps approprié. Laissez chaque assiette d'acclimatation incuber à température ambiante pendant 30 minutes.Ensuite, transférez les vers sur l'assiette d'analyse en suivant l'ordre utilisé pour placer les vers sur l'assiette d'acclimatation à l'aide d'une pointe plate à bord fin. Prenez sans bactéries. Recueillez les vers sur le dessus de la pointe aplatie.En utilisant un mouvement de tasse, puis scellez les assiettes avec un film de laboratoire pour minimiser la perte d'éthanol par vaporisation. La vitesse à laquelle les animaux sont transférés à cette étape est très importante car le transfert vers les animaux sera exposé plus longtemps à l'éthanol, il est donc judicieux de faire tourner les souches placées sur la plaque. D'abord à travers les répliques expérimentales.Un microscope avec une caméra vidéo haute résolution est requis pour filmer les vers. Maintenant, une illumination uniforme, comme celle d'un rétroéclairage carré de trois pouces, est vitale pour l'analyse. Ensuite, pour maintenir le contraste, imagez la plaque côté milieu vers le haut, préparez le logiciel d'analyse d'image pour capturer 120.Filmez des films time-lapse de 12 bits en échelle de gris dans un cadre par seconde. Pour réduire la taille du fichier de sortie tout en conservant une résolution d'image suffisante, utilisez un mode de pliage deux par deux. Enregistrez maintenant des films de deux minutes à partir de chaque assiette.10 minutes après que les derniers vers aient été placés sur cette assiette. Ensuite, faites un deuxième enregistrement de deux minutes. 30 minutes après que les vers ont été placés sur l'assiette pour cette image de démonstration.Le logiciel Pro plus est utilisé, mais une grande variété d'autres logiciels peut être adaptée à la technique. Analysez les films en segments de deux minutes. Tout d'abord, appliquez un filtre aux images qui aplatit l'arrière-plan et améliore le contraste des objets du ver.Sous le menu, sélectionnez le processus. Ensuite, les filtres, puis l'amélioration, puis l'aplatissement. Réglez le paramètre pour un arrière-plan sombre et une largeur de caractéristique de 20 pics.Analysez maintenant la locomotion des animaux dans chaque anneau séparément avec une région d'intérêt circulaire qui chevauche l'anneau de cuivre. Identifiez et suivez les vers avec la commande de suivi des objets dans le sous-menu de mesure. Dans la fenêtre du tableau de données de suivi, utilisez le bouton d'options de suivi pour permettre l'exclusion de pistes spécifiques et pour limiter tout artefact expérimental.Sous l'onglet de suivi automatique, définissez les paramètres de suivi à une limite de vitesse de 400 microns par image. Réglez la limite d'accélération sur automatique, définissez la longueur totale minimale de piste à 400 microns et définissez le type de mouvement prédominant sur chaotique. Ensuite, sous le paramètre de piste, définissez les objets pour permettre aux pistes partielles d'avoir une longueur minimale de 21 images et d'avoir une profondeur de prédiction de suivi d'une image.Maintenant, pour initier le processus de suivi, cliquez d'abord sur le bouton de fonction de recherche automatique de toutes les pistes. Cela fait apparaître la boîte de dialogue des options de taille de décompte et la boîte de dialogue de suivi. Sélectionnez l'option manuelle pour la sélection de plage d'intensité dans la boîte de dialogue de taille de décompte.Cela fournit une étape de seuil importante. Ajustez ensuite les curseurs de seuil d'intensité pour créer une plage inclusive qui met en évidence les objets sombres. Un bon point de départ sur une échelle est entre zéro à 1 500.Applique

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