Sélection de la taille Gel automatisé pour améliorer la qualité des bibliothèques de séquençage de prochaine génération Préparé à partir d'échantillons d'eau de l'environnement

Ce vidéo montre l'utilisation d'un instrument automatisé de sélection par taille sur gel afin d'obtenir des lectures améliorées sur les plates-formes de séquençage de nouvelle génération. Des échantillons d'eau environnementale sont d'abord prélevés puis filtrés à l'aide d'une série de filtres permettant de séparer de manière systématique les particules de taille eucaryote, bactérienne et virale. Les bactéries retenues sont ensuite concentrées par centrifugation.

Ensuite, l'ADN bactérien est extrait. L'ADN extrait est utilisé pour préparer des bibliothèques dans lesquelles des adaptateurs et des index sont incorporés à l'ADN fragmenté. L'ADN est ensuite amplifié par PCR, et les échantillons sont chargés dans la station d'électrophorèse.

Des fragments d'ADN situés dans une plage spécifique sont ensuite sélectionnés automatiquement. L'analyse des tracés provenant de l'électrophorèse capillaire sur puce et des traitements bioinformatiques supplémentaires démontre que cette méthode fournit des quantités adéquates de fragments d'ADN pour des analyses ultérieures, avec un regroupement minimal de fragments indésirables de moins de 200 paires de bases. Le principal avantage du système automatisé Electrophoresis square station ou des billes paramagnétiques et d'autres systèmes commerciaux réside dans la possibilité d'obtenir une plage de sélection plus étroite, permettant ainsi de traiter jusqu'à 96 échantillons en un seul cycle.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les communautés microbiennes présentes dans des échantillons d'eau douce, elle peut être appliquée à d'autres systèmes tels que l'eau de mer, les eaux usées traitées, les échantillons végétaux, les sols sédimentaires ou les mats microbiens, en somme à tout échantillon d'ADN pour lequel on souhaite une sélection étroite de tailles. Nous avons eu l'idée de cette méthode en observant des fragments courts dans les séquences obtenues sur la plateforme MySEQ. Nous avons essayé plusieurs approches de sélection de taille, y compris différents types de billes para et différents rapports, ainsi qu'une méthode manuelle de sélection par gel.

Ensuite, nous avons commencé à collaborer avec Coastal Genomics, une société privée de la Colombie-Britannique proposant la technologie Ranger, afin de démontrer la procédure. Aujourd'hui, nous aurons Michael Chan, technicien de recherche de mon laboratoire, Miguel Yi, chercheur postdoctoral de mon laboratoire, et Jared Sloan, ingénieur chez Coastal Genomics. Dans cette vidéo, nous décrirons uniquement la purification et l'analyse du matériel récupéré sur les filtres de 0,2 micron, principalement des bactéries libres, mais gardez à l'esprit que des approches similaires peuvent être utilisées pour les autres particules récupérées sur les filtres.

Commencez cette procédure en prélevant 40 litres d'échantillons d'eau douce à partir de plusieurs sites environnementaux dans des fûts sanitaires de 20 litres. Préfiltrez les échantillons in situ à l'aide d'un filtre en polypropylène de 105 micromètres de maille. Ici, les échantillons sont prélevés dans des bassins versants urbains et influencés par l'agriculture.

Après le prélèvement, placez les échantillons dans des glacières et ramenez-les au laboratoire. Conservez les échantillons à quatre degrés Celsius. Le lendemain.

Installez un système de filtration composé d’un fût de collecte d’échantillons relié, au moyen d’une pompe péristaltique, à une capsule d’échantillonnage Enviro Check de un micron. Connectez la capsule d’échantillonnage à un filtre en disque de 0,2 micron, puis reliez ce dernier à un filtre tangentiel de 30 kilodaltons à l’aide d’une seconde pompe péristaltique. Mettez en marche les pompes péristaltiques pour faire passer les échantillons à travers une série de filtres ; les cellules eucaryotes seront isolées lorsqu’elles traverseront la capsule d’échantillonnage.

La fraction bactérienne sera isolée sur le filtre à disque membranaire, et les particules virales seront isolées sur le filtre à flux tangentiel. Retirez le ou les filtres membranaires de 0,2 micromètre du système de filtration d'eau. Ensuite, pliez le filtre en deux et placez-le dans un tube de 50 millilitres.

Avec le côté ouvert vers le haut. Ajouter cinq millilitres de PBS avec du tween dans le tube. Si plus d'un filtre a été utilisé lors de la filtration, utiliser un tube différent pour chaque filtre.

Les filtres peuvent ensuite être conservés à quatre degrés Celsius ou traités immédiatement comme suit. Ensuite, à l’aide de pinces stériles, retirez le filtre membraneux du tube de 50 millilitres et placez-le dans une boîte de Pétri à l’aide de pinces stériles et de ciseaux stériles. Coupez le filtre en morceaux d’un centimètre sur un centimètre entre chaque échantillon.

Désinfectez les instruments en les faisant tremper dans de l'isopropanol à 70 %, en les essuyant avec un décontaminant de surface pour ADN, puis en les rinçant avec de l'eau ultrapure de type 1. Replacez les morceaux de filtre dans le même tube de 50 millilitres. Ajoutez 10 millilitres de PBS avec du tween afin d'obtenir un volume total de tampon de 15 millilitres à l'aide de pinces stériles.

Ajoutez six billes de tungstène propres de trois millimètres de diamètre dans chaque tube de 50 millilitres. Fermez le tube avec du paraform et vortexez vigoureusement pendant 20 minutes.

Après vortexage, rassembler toutes les suspensions dans un seul tube propre de 50 millilitres pour chaque échantillon. Centrifuger les tubes à 3 300 ×g pendant 15 minutes à 4 °C. Après la centrifugation, éliminer le surnageant et resuspendre le culot.

Dans cinq millilitres de solution PBS, répartir les cellules bactériennes en aliquotes d'un millilitre dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre. Faire tourner dans une microcentrifugeuse à 10 000 ×g pendant 10 minutes. Après la centrifugation, utiliser une pipette pour éliminer tout le surnageant sauf 200 microlitres. Conserver les échantillons à moins 80 degrés Celsius ou poursuivre l'extraction de l'ADN bactérien à l'aide d'un kit d'isolement d'ADN disponible dans le commerce.

Lors de l'extraction de l'ADN bactérien, utilisez soit du PBS soit de l'eau comme témoin négatif d'extraction et e coli comme témoin positif d'extraction. Après la procédure d'extraction de l'ADN, regroupez les aliquots provenant du même échantillon dans un tube de deux millilitres contenant un tampon tris à 10 millimolaire. Ensuite, effectuez une précipitation nocturne en ajoutant une solution composée de 10 % de trois molar acétate de sodium, de deux volumes d'éthanol à 100 % et de cinq microlitres d'acrylamide linéaire. Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius.

Le lendemain, centrifuger les échantillons à 17 000 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, laver le culot avec un millilitre d'éthanol glacé à 70 % et laisser sécher à l'air libre dans une cabine de sécurité biologique pendant pas plus de cinq minutes.

Ensuite, resuspendre le culot d'ADN dans du Tris 10 millimolaire. Enfin, déterminer la quantité et la qualité de l'ADN en réalisant un dosage de quantification d'acides nucléiques par fluorescence à haute sensibilité, suivi d'une spectrométrie en microvolume. Après avoir déterminé la quantité d'ADN dans chaque échantillon, ajouter la quantité appropriée d'eau dans chaque tube afin d'ajuster la concentration à environ 0,2 nanogramme par microlitre.

À l'aide d'un kit disponible dans le commerce, préparez une bibliothèque d'ADN constituée de fragments indexés à partir d'un nanogramme d'ADN bactérien. Ici, une méthode basée sur une transposition, appelée mentation, est utilisée pour fragmenter simultanément l'ADN et y incorporer des séquences adaptatrices. Ensuite, une PCR est réalisée afin d'amplifier et d'indexer simultanément les échantillons d'ADN, fournissant ainsi des codes-barres spécifiques sur chaque fragment ainsi que les séquences nécessaires à la formation de clusters, qui peuvent être lus par la plateforme de séquençage.

Après la fin de la PCR, omettez l'étape standard de purification post-PCR et ajoutez 3,5 µL de tampon de charge à chaque échantillon pour un volume total de 28,5 µL. Transférez ensuite les échantillons dans une plaque de 96 puits. Placez la plaque de 96 puits dans une station d'électrophorèse équipée d'une cassette d'agarose préformée à 1,5 % dans l'interface utilisateur du logiciel Ranger.

Spécifiez une taille cible de sélection comprise entre 500 et 800 paires de bases. Réglez le volume d'extraction à 300 microlitres. Lancez l'exécution.

La station d'électrophorèse chargera automatiquement les échantillons dans les cassettes aros. Ensuite, une tension est appliquée aux cassettes, et un système d'imagerie monté sur un portique est utilisé pour identifier l'emplacement de l'ADN de l'échantillon dans les aros tout au long de la course.

Le logiciel Ranger capture des images et, à l'aide d'étalons internes, estime la position de la cible de taille sélectionnée dans chaque échantillon. Une fois les cibles identifiées, le logiciel Ranger varie. La tension appliquée à chaque échantillon permet de synchroniser l'arrivée des cibles dans les puits d'extraction de la cassette.

Enfin, la station d'électrophorèse aspire les cibles dans le tampon TBE à partir des puits d'extraction et les dépose dans une nouvelle plaque de 96 puits afin de concentrer le matériel brut, puis précipite le volume brut d'élution à l'aide d'acétate de sodium et d'éthanol en présence d'acrylamide linéaire, par incubation toute la nuit à moins 80 degrés Celsius. Centrifuger à nouveau les échantillons à 17 000 ×g pendant 30 minutes. Après la centrifugation, éliminer les surnageants et procéder au lavage du culot d'ADN avec un millilitre d'éthanol glacé à 70 %, puis centrifuger.

Les échantillons sont centrifugés à 17 000 ×g pendant 30 minutes, le surnageant est éliminé, les échantillons sont séchés, puis le culot d'ADN est resuspendu dans du Tris 10 millimolaire CL. Procéder à la normalisation des échantillons à l'aide de billes de normalisation de bibliothèque, fournies dans le kit de préparation de bibliothèque transpose on base. Enfin, effectuer le séquençage de l'ADN à l'aide d'une plateforme de séquençage de nouvelle génération afin d'obtenir des lectures plus informatives sur les plateformes de séquençage de nouvelle génération, en améliorant la qualité des bibliothèques de séquençage.

Des échantillons d'eau ont été prélevés sur huit sites différents de bassin versant et des bibliothèques d'ADN indices ont été préparées à partir de la fraction bactérienne isolée, comme indiqué sur cet électrophérogramme. Les bibliothèques d'ADN générées à partir d'échantillons d'eau douce après PCR, mais avant la sélection automatisée par taille, étaient composées de fragments dont la taille variait de 50 paires de bases à 3000 paires de bases. Après sélection par taille à l'aide de la plateforme automatisée à haut débit, les échantillons présentaient une gamme étroite de fragments d'ADN compris entre 500 et 800 paires de bases. Ainsi, l'utilisation de cette plateforme automatisée de sélection par taille sur gel a permis d'obtenir des rendements adéquats et de minimiser l'agencement de fragments indésirables de moins de 200 paires de bases.

Le séquençage de l'ADN de cette bibliothèque sur le MiSeq en aluminium a généré une densité de clusters de 1198 K par millimètre carré. Le pourcentage de clusters ayant passé les filtres était de 84,2 %, avec un rendement estimé de 9,2 gigaoctets. De plus, 7,4 gigaoctets, soit 82,8 % des lectures, présentaient un score de qualité supérieur ou égal à 30.

Cela signifie qu'environ 83 % des bases séquencées à l'aide de ce protocole modifié appliqué à des échantillons d'eau environnementale présentaient une précision d'appel de base d'au moins 99,9 %. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir des données plus informatives à partir de bibliothèques de séquençage. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit la fraction microbienne visée, le choix de la préparation de la bibliothèque, la longueur cible des fragments et les plateformes de séquençage.