Name: Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Apprenez un test d'invasion tumorale 3D semi-automatisé utilisant une matrice de membrane basale. Cette méthode permet d'étudier le comportement des cellules cancéreuses dans un environnement physiologiquement pertinent pour la recherche oncologique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été financé par le National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) et l’Oracle Cancer Trust. SE est soutenu par l’Institut de recherche sur le cancer et Cancer Research UK (numéro de subvention C309/A8274). Nous reconnaissons le financement du NHS au Centre de recherche biomédicale du NIHR.

1. Génération de reproductible Sphéroïdes tumorales Sized <ol><li> Laver les monocouches de cellules tumorales avec un tampon phosphate salin (PBS, 5 ml d&#39;une 25 cm 2 ou 8 à 10 ml pour un 2 flacon de 75 cm), ajouter dissociation cellulaire enzymatique (1 ml pour 25 cm 2 ou 2 ml d&#39;une 75 cm 2 fiole) et on incube les cellules à 37 ° C pendant 2-5 min. </li><li> Vérifier le détachement des cellules au microscope et neutraliser la dissociation enzymatique des cellules avec du milieu de croissance complet (5 ml pour une 25 cm 2 ou 8 ml pour un flacon de 2 75 cm). </li><li> Centrifugeuse suspension de cellules à 500 g pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant, tapoter le tube et remettre en suspension culot cellulaire dans 1 ml de milieu de croissance complet en utilisant une pipette P1000. Cela devrait donner une suspension de cellule unique sans amas de cellules. </li><li> Compter les cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre et on dilue la suspension de cellules pour obtenir de 0,5 à 2 x 10 4 cellules / ml (densité cellulaire optimale doit être déterminée pour chaque lignée cellulaire en order pour obtenir des sphéroïdes tumoraux de 300 à 500 um diamètre de 4 jours après l&#39;ensemencement cellulaire 12,13). </li><li> Transférer la suspension cellulaire à un réservoir stérile et, à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux, distribuer 200 pl / puits dans ultra-faible attachement (ULA) plaques à 96 puits à fond rond 12. </li><li> Transférer les plaques dans un incubateur (37 ° C, 5% de CO2, 95% d&#39;humidité). Quatre jours plus tard, confirmer visuellement la formation sphéroïde de la tumeur et de procéder à l&#39;essai d&#39;invasion 3D. </li></ol> 2. 3D tumeur Spheroid Invasion Assay <ol><li> Décongeler BMM sur la glace. </li><li> Gardez un ensemble de bouts filtres stériles pour P10, P200 et P1000 pipettes et tubes stériles (1,5 ml de volume ou plus en fonction du volume total requis) à -20 ° C. </li><li> Placez les ULA plaques à 96 puits contenant âgées de 4 jours sphéroïdes sur la glace. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, retirez délicatement 100 pl / puits de milieu de croissance à partir des plaques de sphéroïde. Pour cette angle de pas les conseils vers le inside paroi des puits à fond en U, en évitant tout contact avec le fond du puits et l&#39;emplacement des sphéroïdes; minimiser la perturbation des sphéroïdes. </li><li> En utilisant des pointes glacées, transférer BMM à tubes glacés. Pour invasion induite par les cytokines ou pour des études d&#39;évaluation des médicaments, ajoutera des réactifs (à 2x la concentration finale) à l&#39;aide de conseils BMM glacées. Par exemple, utiliser le facteur de croissance épidermique (EGF) pour stimuler l&#39;invasion des cellules de carcinome épidermoïde CAL S et R CAL. Bien mélanger en agitant doucement, en évitant la formation de bulles. </li><li> Passer doucement 100 pi de BMM dans le puits à fond en U, visant la pointe vers la paroi intérieure du puits. Cette étape est la plus critique que, par analyse d&#39;image optimale, des sphéroïdes doivent rester dans le centre du puits 12. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.6 pour tous les puits nécessaires, permettant 5-6 répétitions / état. Si nécessaire, changez à une pointe fraîchement réfrigérés. REMARQUE: Lorsque plus expérimenté, DISPENBMM soi à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux. </li><li> Utiliser une aiguille stérile, enlever les bulles, si elle est présente. <ol><li> En utilisant un microscope, vérifier visuellement que sphéroïdes sont dans une position centrale. Si non, centrifuger la plaque à 300 g pendant 3 min à 4 ° C. Cela permettra d&#39;assurer que les sphéroïdes sont situés au centre de chaque puits. </li></ol></li><li> Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et laisser se solidifier le BMM. </li><li> 1 h plus tard, à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux, ajouter doucement 100 ul / puits de milieu de croissance complet. Pour invasion ou d&#39;évaluation des médicaments études induite par des cytokines, inclure des cytokines ou des inhibiteurs dans le milieu (1x concentration finale). Alternativement, si les réactifs ne sont pas ajoutés à la BMM à l&#39;étape 2.5, ajoutez-les au milieu à ce point (3x la concentration finale souhaitée). </li></ol> 3. automatisé Image Acquisition <ol><li> Plaques de numérisation sur le cytomètre (pour spécifications, voir le tableau de l&#39;équipement et des matériaux) à intervalles starter de temps zéro (t0 = jour de l&#39;essai d&#39;invasion mis en place, immédiatement après l&#39;étape 2.10 jusqu&#39;à 72 h ou 96 h pour les lignes d&#39;invasion de cellules tumorales plus lents. </li><li> Sélectionnez l&#39;application «Confluence». </li><li> Vérifiez que le sphéroïde est au point et, si nécessaire, régler et modifier manuellement le «Focus off-set». </li><li> Sous la rubrique «paramètres échantillonnage», sélectionnez pour balayer une zone centrale de vision (FOV). Après l&#39;addition BMM, sphéroïdes tumoraux auraient dû rester dans une position centrale, il n&#39;y a donc pas besoin de balayer l&#39;ensemble bien. </li><li> Dans le logiciel, définissent les puits pour être numérisés en les sélectionnant sur la carte de la plaque. Cliquez sur &quot;Lancer la numérisation &#39;. REMARQUE: La numérisation est automatiquement sauvegardé et peut être revue ultérieurement hors ligne. </li></ol> 4. Analyse d&#39;image automatisé <ol><li> Sélectionnez l&#39;application «Confluence». </li><li> Dans l&#39;onglet &#39;Analyse de, ajuster applicparamètres de ation (par exemple, «précision»: bas haut, normal,; &quot;seuil d&#39;intensité&quot;: 1 - 15) pour produire une segmentation précise autour de la sphéroïde, y compris les processus cellulaires et invadopodia étendant dans le BMM (voir Figure 1). Régler les paramètres de chaque lignée de cellules de tumeur et / ou à différents points dans le temps. Mesures d&#39;application de la «Confluence» de l&#39;% de la superficie de bien couverts par les cellules envahissantes, dans le FOV sélectionné. </li><li> Vérifiez que les paramètres d&#39;analyse sont appropriées (par exemple, la segmentation est exacte) pour les autres sphéroïdes dans la plaque en cliquant sur ​​quelques puits différents. Si la segmentation ne précise pas exactement un sphéroïde, ajuster les paramètres de l&#39;application plus loin. </li><li> Cliquez sur &quot;Lancer l&#39;analyse&quot;. </li><li> Dans l&#39;onglet &quot;Résultats&quot;, vérifier plusieurs puits pour vérifier la qualité de l&#39;analyse. Export &#39;Eh bien les données de niveau »à un tableur. </li><li> REPEAanalyse de t pour tous les points dans le temps. Calculer la moyenne% de confluence pour les puits répétés et l&#39;invasion de la parcelle (% de confluence) contre le temps dans un graphique à barres, à l&#39;aide de graphiques scientifique et logiciel statistique de choix. </li></ol> 5. Acquisition manuel de l&#39;image <ol><li> Enregistrer une image pour chaque sphéroïde de tumeur à des intervalles à partir de t = 0 jusqu&#39;à 72 à 96 heures, en fonction de la vitesse de l&#39;invasion de la lignée cellulaire en question, en utilisant un microscope inversé (pour une plaque de 96 puits cela prend environ 20 - 30 min). Utilisez un objectif 10X. Utilisez un objectif 4X quand une zone envahie est trop grande pour être complètement capturé dans le champ 10X de vue. </li><li> Enregistrer chaque image acquise. </li><li> Pour l&#39;étalonnage, prendre des images d&#39;un réticule de l&#39;étape (1 mm) en utilisant les deux objectifs 10X et 4X (et enregistrer des images). </li></ol> 6. Manuel Analyse d&#39;Image <ol><li> Ouvrez les images du réticule de la scène dans le logiciel d&#39;analyse d&#39;image de votre choix. </li><li> Entrez le gratmesures icule, les unités (um), les objectifs utilisés (10X ou 4X) et d&#39;effectuer l&#39;étalonnage. Cette étape est nécessaire qu&#39;une seule fois. Pour l&#39;analyse de l&#39;image suivante, rechargez simplement les paramètres de calibrage requis. </li><li> Ouvrez les images de dosage d&#39;invasion et sélectionnez les paramètres d&#39;étalonnage en fonction de l&#39;objectif du microscope (10X ou 4X) utilisé pour obtenir les images. <ol><li> Alternativement, importer des images obtenues sur un cytomètre imagerie (étape 3) et d&#39;analyser manuellement, comme décrit pour les images obtenues à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé (voir résultats de la figure 3 et la figure 4). </li></ol></li><li> Mesurer la zone couverte par les sphéroïdes. <ol><li> Dans le logiciel utilisé ici pour les résultats représentatifs (pour spécifications, voir le tableau de l&#39;équipement et des matériaux), aller à «Mesure» et sélectionnez «comte / size &#39;. Choisissez «Fichier» puis «Charger les paramètres &#39;et sélectionnez pré-déterminée assaparamètres y. Ensuite, choisissez &quot;Count&quot;. Le sphéroïde devrait alors être segmenté avec précision. </li><li> Sinon aller à &quot;Modifier&quot;, puis &quot;Dessiner / fusionner des objets &#39;pour ouvrir la fenêtre&quot; Magic Wand / Trace &quot;. Utilisez le curseur de la baguette de cliquer sur l&#39;image sphéroïde et d&#39;obtenir la segmentation. Sélectionnez &#39;Trace&#39; (dans la fenêtre &#39;Magic Wand &quot;) pour décrire manuellement le sphéroïde aide d&#39;une souris. </li></ol></li><li> les mesures à l&#39;exportation de différents paramètres (surface, diamètre, le périmètre etc.) à une feuille de calcul. Enregistrer sur la feuille de calcul des informations d&#39;image pertinente (par exemple, nombre bien, point de temps relatif). </li><li> Tracer la surface moyenne de sphéroïdes répétées (de l&#39;invasion) en fonction du temps à l&#39;aide de graphiques scientifiques et des logiciels statistiques. Alternativement, calculer la variation dans la zone sphéroïde à chaque point de temps, par rapport à la zone à t = 0. Alors invasion de la parcelle (% t0) en fonction du temps comme un gra linéaireph. </li></ol>

<ol><li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+therapeutics%22%5BJournal%5D)">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology & therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li>
<li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Dimensional+vs.+Three-Dimensional+In+Vitro+Tumor+Migration+and+Invasion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays.</a> Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).</li>
<li>Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia+formation+in+oral+squamous+cell+carcinoma%3A+the+role+of+epidermal+growth+factor+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Oral.+Biol%22%5BJournal%5D)">Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling.</a> Arch. Oral. Biol. 57 (4), 335-343 (2012).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+on+invadopodia+formation+for+lung+carcinoma+invasion+with+a+microfluidic+3D+culture+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device.</a> PLoS One. 8 (2), e56448(2013).</li>
<li>Friedl, P., Alexander, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+invasion+and+the+microenvironment%3A+plasticity+and+reciprocity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity.</a> Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).</li>
<li>Brekhman, V., Neufeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+asymmetric+3D+in-vitro+assay+for+the+study+of+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion.</a> BMC Cancer. 9, 415(2009).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin. Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> The Journal of pathology. 205 (4), 468-475 (2005).</li>
<li>Deisboeck, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+self-organization+in+tumour+systems%3A+complex+growth+dynamics+in+a+novel+brain+tumour+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model.</a> Cell Prolif. 34 (2), 115-134 (2001).</li>
<li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth%2C+invasion+and+drug+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), e10431(2010).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29(2012).</li>
<li>Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods and Protocols. , 253-266 (2013).</li>
<li>Box, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+serum+protein+signature+associated+with+resistance+to+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Eur. J. Cancer. 49 (11), 2512-2521 (2013).</li>
<li>Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+growth+factors+on+invasion+and+proliferation+of+endocrine+resistant+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (7), e41847(2012).</li>
<li>Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenascin-C+is+expressed+by+human+glioma+in+vivo+and+shows+a+strong+association+with+tumor+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+tissue+research%22%5BJournal%5D)">Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels.</a> Cell and tissue research. 354 (2), 409-430 (2013).</li>
<li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li>
<li>Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+glioblastoma+cells+acquire+stemness+and+increased+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation.</a> Neoplasia. 12 (6), 453-463 (2010).</li>
</ol>

Tous les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêt en concurrence.

Les deux modèles de tumeurs décrites ici (glioblastome et SCCHN) ont été spécifiquement choisis pour illustrer notre test de 3D ​​comme ils sont cliniquement cancers localement invasives pertinents ayant un besoin non satisfait de thérapies efficaces 12. Suite à un traitement médicamenteux, l&#39;évaluation de vitro changements de pharmacodynamique (PD) de biomarqueurs peut être effectuée facilement par blot ou analyses immunologiques de lysats western suite à l&#39;utilisation de réactifs disponibles dans le commerce spécifiques pour permettre la récupération des cellules à partir de BMM et / ou l&#39;analyse par immunofluorescence de l&#39;invasion des sphéroïdes de tumeur par toute coloration monture. Cet essai d&#39;invasion est une technique utile pour l&#39;évaluation rapide et reproductible de l&#39;invasion des cellules tumorales dans un milieu semi-solide et donc particulièrement approprié pour l&#39;avenir dans le dépistage de la drogue vitro. Les cellules cancéreuses envahissent la matrice 3D d&#39;une manière qui se propagent à partir d&#39;un &quot;micro-tumeur», représentée par le sphéroïde de tumeur, et se prolongent dans une extracellulenvironnement matriciel comme ar. Le vrai tridimensionnalité de l&#39;essai est évident dans la morphologie cellulaire, qui est différente de la morphologie des cellules adhérentes plat supposent lors du déplacement sur un substrat solide. Le degré d&#39;invasion est facilement quantifiée en utilisant soit un cytomètre de formation d&#39;image, ce qui permet une lecture automatique, ou en utilisant un microscope standard en combinaison avec un logiciel d&#39;imagerie. En outre, cette méthode est adaptée pour l&#39;imagerie de fluorescence 13 (par exemple avec des lignées cellulaires exprimant des protéines fluorescentes ou pré-marqués avec des colorants fluorescents). Le procédé est simple à réaliser avec la seule étape critique représenté par l&#39;addition du BMM, quand il existe un risque de perturber la position centrale de l&#39;ellipsoïde dans le puits en forme de U. Cela peut se traduire par analyse d&#39;image optimale, avec des sphéroïdes dans différents plans focaux. Il est donc essentiel d&#39;ajouter le BMM soigneusement et lentement à chaque puits. Après addition BMM il est conseillé de consulter la plaquesous un microscope et si la localisation est considéré comme inacceptable, on peut y remédier par centrifugation douce. Avec l&#39;expérience, ce qui est rarement nécessaire. Alors que cette méthode est robuste et très reproductible, la variation inter-expérimentale pourrait se produire avec différents lots de BMM. Pour éviter cela, il est conseillé d&#39;acheter suffisamment de BMM à partir d&#39;un seul lot pour compléter une série d&#39;études. Une limitation de la méthode (comme pour toutes ces essais) est la difficulté de distinguer entre l&#39;invasion et la prolifération, qui les cellules tumorales subissent probablement au cours de la période d&#39;essai. Bien que le temps de doublement des cellules peut être prise en compte, ou des inhibiteurs du cycle cellulaire tels que la cytochalasine D a introduit, il est difficile de contrôler ou de clairement distinguer entre ces deux aspects différents de progression tumorale, en particulier pour les cellules tumorales en croissance rapide et pour ceux qui avoir un motif d&#39;invasion plus &quot;large&quot;, plutôt que d&#39;infiltration. Pour cette raisonil est suggéré que le test de croissance 3D parallèle est effectué pour évaluer les effets spécifiques de tous les agents inhibiteurs ou stimulants. Si les études de dose-réponse attention sont effectuées, il peut être possible de sélectionner les concentrations qui minimisent les effets sur la prolifération. Par exemple, nous avons montré que l&#39;inhibiteur de HSP90 17-AAG inhibe U-87 MG 3D invasion de sphéroïde de tumeur déjà à 24 h et à des concentrations inférieures à la concentration inhibant la croissance de 50% en 3D (GI 50) 12. D&#39;autre part, l&#39;importance de ce test par rapport à d&#39;autres essais d&#39;invasion standard (par exemple, filtres à base de dosages ou l&#39;invasion des cellules individuelles dans des matrices 3D 1), est que les cellules tumorales envahissent la matrice environnante de la sphéroïde, qui ressemble à un &quot; micro-tumorale &quot;ou un&quot; micro-métastases &quot;, et prend donc en compte les aspects importants de la physiopathologie d&#39;une masse tumorale. La méthode que nous présentons fournit des informations sur lacomportement collectif des cellules tumorales, au moment de quitter d&#39;abord les sphéroïdes, et aussi séparément, lorsque les cellules simples atteindre des régions plus éloignées dans le BMM. En outre, les cellules tumorales à l&#39;intérieur des sphéroïdes peuvent subir une hypoxie et nutritif privation qui, grâce à des changements dans l&#39;expression génique, peut favoriser la migration et l&#39;invasion; ces caractéristiques sont absentes dans les analyses 2D. En outre, tout cela est disponible dans un format à haut débit à travers l&#39;utilisation des plaques à 96 puits spécifiques et les dernières technologies d&#39;imagerie, permettant un test de 3D plus complexe pour être facilement utilisé dans la validation des cibles et de la découverte de médicaments. La méthode que nous présentons peut accueillir d&#39;autres applications pour traiter des aspects supplémentaires de l&#39;invasion des cellules tumorales. En particulier, la complexité supplémentaire peut être envisagé par l&#39;addition de cellules hôtes, telles que les fibroblastes et / ou des cellules endothéliales, dans la sphéroïde lui-même ou la matrice environnante. Cela peut également être modifié, non seulement en termes de rigidité (par l&#39;utilisation de différents concentrations de BMM), mais aussi en termes de composition (par l&#39;addition d&#39;autres composants à charge spécifique sur le tissu / organe du modèle adopté des tumeurs: par exemple, la ténascine pour les cancers du cerveau et du collagène 16 de carcinome du sein 17). Un set-up (génération de sphéroïdes et imagerie) similaire peuvent également être adaptées pour évaluer l&#39;invasion des tissus en 3D, où sphéroïdes tumoraux sont co-cultivées avec des corps embryoïdes ressemblant à un tissu complexe 12 ou avec d&#39;autres organites cellulaires spécifiques (par exemple, les astrocytes pour gliome 18 ou crypte cultures pour les cancers gastro-intestinaux), mais d&#39;autres travaux sont nécessaires pour permettre l&#39;analyse d&#39;image automatisée.

Classique développement de médicaments anticancéreux est largement axé sur l&#39;utilisation des essais in vitro à base de cellules à l&#39;écran pour les agents cytotoxiques qui inhibent la prolifération cellulaire tumorale et / ou favorisent la mort cellulaire programmée (apoptose). Plus récemment, des efforts ont évolué vers des thérapies ciblées avec le développement d&#39;inhibiteurs des causes moléculaires sous-jacents de la prolifération des cellules malignes. En dépit de quelques résultats spectaculaires, ces agents sont souvent associés avec le développement rapide de la résistance aux médicaments. Étant donné qu&#39;il est le potentiel invasif et métastatique des cellules tumorales qui est responsable de la majorité des décès par cancer, maladie récidivante et qui présente souvent un phénotype plus agressif, il est logique de considérer également complémentaire dans des modèles expérimentaux in vitro pour identifier de nouvelles 1,2 agents qui inhibent ces «caractéristiques» clés supplémentaires de cancer. Au cours de la progression maligne, les cellules tumorales acquièrentla capacité d&#39;envahir les tissus environnants et / ou la propagation dans des organes distants (métastases). Les cellules cancéreuses pénètrent dans la membrane basale par la formation de invadopodia 3,4. Ces structures sont enrichies avec des filaments d&#39;actine, des protéines d&#39;adhérence et de proteinases spécifiques et sont collectivement responsables de la motilité des cellules tumorales et de la dégradation de la matrice extracellulaire (ECM) 5. Invadopodia étendre dans l&#39;ECM et sont jugées importantes pour l&#39;invasion des cellules de la tumeur et une extravasation également dans les canaux vasculaires, facilitant hématogène (ou lymphatique) la diffusion et la métastase. Méthodes standards actuelles pour évaluer l&#39;invasion des cellules tumorales in vitro comprennent ce qui suit. Transwell base d&#39;essais ou de la chambre de Boyden 2,6 où suspensions de cellules isolées sont ensemencées sur un filtre revêtu d&#39;une épaisse couche de protéines de la MEC dérivés. Cellules envahissent ensuite et se déplacent dans la chambre inférieure en réponse à une chimio-attractif. Communément utilisé ECMles protéines sont collagène de type I, ou une membrane analogue à matrice de sous-sol (BMM, par exemple, de Matrigel, dérivé de la tumeur EHS 7) qui imite la composition naturelle de membranes basales. Comme une alternative aux essais de type chambre Boyden à filtre 8, les cellules peuvent être ensemencées sur le dessus d&#39;un gel d&#39;ECM (à laquelle peuvent être ajoutés des fibroblastes), où ils forment une monocouche et ensuite envahir individuellement ou collectivement dans le gel. Invasion peut être mesurée en termes de nombre de cellules et / ou de la distance envahisseurs venus de la surface du gel 9. Les cellules tumorales peuvent également être entièrement noyées dans une matrice soit sous forme de suspension de cellules individuelles ou sous forme de sphéroïdes - habituellement placées entre deux couches de gel-ECM permettant d&#39;envahir les cellules de la masse tumorale dans la matrice environnante 2,6,10,11. Les trois dimensions (3D) sphéroïde de tumeur dosage d&#39;invasion décrite ici fournit un système d&#39;invasion rapide, automatisable utilisant un highly reproductible, méthode standardisée 12 dans un format de plaque de 96 puits avec un sphéroïde par puits. BMM est ajouté directement à chaque puits pour donner une matrice semi-solide dans laquelle les cellules tumorales envahissent du corps sphéroïde. L&#39;étendue de l&#39;invasion des cellules tumorales est surveillé à des intervalles sur une période de 72-96 heures. Cette méthode présente les avantages suivants au cours des essais in vitro courants d&#39;invasion mentionnés ci-dessus: la tumeur des cellules sont organisées en une structure 3D imitant une micro-région de la tumeur ou une micro-métastase; les sphéroïdes tumoraux sont hautement reproductibles en taille; le dosage d&#39;invasion est réalisée in situ dans la même plaque que le développement de sphéroïde de tumeur, sans qu&#39;il soit nécessaire de les déplacer à des plaques secondaires; la méthode, combinée avec les dernières technologies de l&#39;analyse automatique de l&#39;image, permet à la fois de haute teneur et analyse à haut débit de l&#39;invasion des cellules tumorales. L&#39;analyse d&#39;image est réalisée en utilisant un cytomètre imagerie, qui balaye un 96 puitsplaque dans les 10 minutes. En utilisant l&#39;application de confluence, l&#39;étendue et le taux d&#39;invasion atteints soit par des cellules individuelles ou par des amas de cellules étendent depuis les sphéroïdes de tumeur et invasion dans la matrice peut être mesurée de façon dynamique. Pour un débit plus faible, un autre procédé pour l&#39;analyse d&#39;images est présentée, sur la base de l&#39;utilisation d&#39;un microscope inversé et un logiciel d&#39;imagerie standard.

<table><tbody><tr><td>Matrice de membrane basale Corning Matrigel</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>354234</td><td>Conserver à 4 &amp;deg;C pour éviter la solidification et distribuer à l’aide de pointes de pipette refroidies</td></tr><tr><td>Extrait de membrane basale Cultrex, PathClear</td><td><a href="http://www.trevigen.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Trevigen</a></td><td>3432-005-01</td><td>Conserver à 4 &amp;deg;C pour éviter la solidification et distribuer à l’aide de pointes de pipette refroidies</td></tr><tr><td>Plaque 96 puits à attachement ultra-faible</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td><a href="http://www.miltenyibiotec.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Miltenyi Biotec</a></td><td>130-093-825</td><td>Ajouter 100 &amp;mu;l de BSA à 1 % (p/v) dans l’eau à 100 &amp;mu;g d’EGF. À 25 &amp;mu;l de cette solution, ajouter 4 975 &amp;mu;l de milieu RHB-A pour obtenir un stock de travail à 5 &amp;mu;g/ml. Aliquoter et conserver à -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Milieu RHB-A</td><td><a href="http://www.stemcellsinc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Stem Cells Inc.</a></td><td>SCS-SF-NB-01</td><td>Pour la dilution de l’EGF</td></tr><tr><td>DMEM</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>31966-021</td><td>Chauffer au bain-marie à 37 &amp;deg;C avant utilisation</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td><a href="http://www.biosera.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Biosera</a></td><td>1001/500</td><td>Chauffer à 56 &amp;deg;C pour inactiver le complément avant utilisation</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>12605</td><td>Solution de dissociation cellulaire</td></tr><tr><td>Cytomètre Celigo</td><td><a href="http://www.nexcelom.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Nexcelom Bioscience</a></td><td>n/a</td><td>Équipement spécialisé pour la capture et l’analyse d’images. La capture d’images manuelle par microscopie et un logiciel d’analyse d’images indépendant constituent une alternative</td></tr><tr><td>Microscope inversé IX70</td><td><a href="http://www.olympus.co.uk/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Olympus</a></td><td>n/a</td><td>Utilisé avec une caméra pour la capture d’images manuelle</td></tr><tr><td>Caméra numérique Retiga Exi Fast 1394</td><td><a href="http://www.qimaging.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Qimaging</a></td><td>n/a</td><td>Fixée au microscope pour la capture d’images manuelle</td></tr><tr><td>Image-Pro Plus 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td>n/a</td><td>Logiciel utilisé pour contrôler la caméra et le microscope lors de la capture d’images manuelle</td></tr><tr><td>Image-Pro Analyzer 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td>n/a</td><td>Logiciel autonome d’analyse d’images pour la mesure manuelle de la taille des sphéroïdes</td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td><a href="http://www.microsoft.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Microsoft</a></td><td>n/a</td><td>Logiciel scientifique de graphisme et d’analyse statistique</td></tr><tr><td>Prism 6.0</td><td><a href="http://www.graphpad.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GraphPad</a></td><td>n/a</td><td>Logiciel scientifique de graphisme et d’analyse statistique</td></tr></tbody></table>

tridimensionnelle (3d) tumor spheroid invasion assay

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

L&#39;invasion des tissus normaux environnants est généralement considéré comme une caractéristique clé de maligne (par opposition à des tumeurs bénignes). Pour certains cancers, en particulier (par exemple, les tumeurs cérébrales telles que glioblastome multiforme et le carcinome spinocellulaire de la tête et du cou -. SCCHN), il est une cause de morbidité grave et peut être mortelle, même en l&#39;absence de métastases à distance. En outre, les cancers qui ont rechuté après un traitement malheureusement souvent présent avec un phénotype plus agressif. Par conséquent, il est possible de cibler le processus d&#39;invasion de fournir de nouvelles thérapies qui peuvent être complémentaires à des agents anti-prolifératifs standard. Jusqu&#39;à présent, cette stratégie a été entravée par le manque de tests robustes, reproductibles appropriés pour une analyse détaillée de l&#39;invasion et de dépistage de drogue. Ici nous fournissons une méthode micro-plaque simple (basé sur uniforme, auto-assemblage sphéroïdes tumoraux 3D), qui a un grand potentiel pour une telle stumeurt. Nous illustrons la plate-forme de test utilisant une lignée cellulaire de glioblastome humain et également un modèle SCCHN où le développement de la résistance contre le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR ciblé inhibiteurs) est associée à un potentiel de matrice renforcée invasive. Nous fournissons également des deux autres méthodes de quantification semi-automatique: une en utilisant une imagerie cytomètre et un deuxième qui exige simplement la capture de microscopie et de l&#39;image standard avec analyse d&#39;image numérique.

3D sphéroïde invasion tumorale est évaluée en utilisant un reproductible, procédé simple, automatisé illustré schématiquement sur ​​la figure 1: sphéroïdes de tumeur de taille reproductible sont obtenus par étalement des cellules dans ULA plaques à 96 puits à fond rond. 4 jours post-initiation sphéroïdes sont intégrés dans BMM. Ceci permet d&#39;obtenir une structure semi-solide dans laquelle les cellules tumorales envahissent et répartis de la sphéroïde. Sphéroïdes sont situés au centre à la base de chaque puits et l&#39;invasion dans le BMM est aisément contrôlée à intervalles à partir de t = 0 jusqu&#39;à 72 à 96 h en utilisant une imagerie cytomètre. Cela peut fournir entièrement automatisé d&#39;analyse d&#39;image. Des exemples de différents types d&#39;invasion des cellules cancéreuses sont illustrés sur les figures 2 -. 4 Le glioblastome multiforme humain (GBM) lignée de cellules hautement malignes U-87 MG, forme une structure en 3D étanche, de forme sphérique et est utilisée ici pour illustrer des tumeurs du cerveau dans lesquelles locale invasion est une clé mortellefonctionnalité. Une fois incorporé dans BMM, les cellules de sphéroïdes U-87 MG, réparties avec un modèle d&#39;invasion &quot;starburst&quot; typique 12. Les cellules tumorales étendent radialement dans la matrice dans laquelle elles maintiennent une forme à 3 dimensions. Le procédé est suivi sur une période de 72 heures comme représenté sur la Figure 2 pour U-87 MG, des sphéroïdes, lors de la mesure de l&#39;invasion de cellules tumorales, avec des détails sur les processus cellulaires et se prolongeant dans la invadopodia BMM est clairement évidente. Analyse d&#39;image en utilisant un cytomètre d&#39;image permet la quantification précise de l&#39;invasion des cellules tumorales au fil du temps entièrement automatisé. La quantification de la figure 2 est obtenu comme illustré sur la figure 1, où l&#39;analyse automatisée segmentation produit autour des saillies pénétrant dans la cellule de la BMM U-87 MG corps sphéroïde. A noter que pour cette lignée cellulaire, le corps de sphéroïde de tumeur est exclu de la mesure de la zone envahie. Un modèle différent de invasion est affichée par des lignes squameuses humaines de cellules cancéreuses de la tête et du cou. CAL S et R sont CAL isogène, mais CAL S est sensible à, et CAL R résistants aux inhibiteurs de la tyrosine kinase EGFR 14. En l&#39;absence d&#39;EGF, ni lignée cellulaire a envahi dans la BMM (Figure 3) Toutefois, comme la concentration de EGF a été augmentée (à 2,5 ng / ml), les sphéroïdes semblent «bud». Aux concentrations plus élevées de l&#39;EGF (40 et 80 ng / ml) le degré d&#39;invasion a été réduite. Ceci est cohérent avec la réponse à la dose classique en forme de cloche à l&#39;EGF en termes d&#39;invasion qui a été précédemment rapporté 15. Dans 20 ng / ml d&#39;EGF, saillies en forme de doigts extrudées à partir du corps principal de sphéroïdes CAL R tandis que les cellules CAL S étaient moins invasive après 72 h (Figure 3). Cette invasion différentielle était évidente 48 heures après sphéroïdes ont été placés dans BMM (contenant 20 ng / ml d&#39;EGF de distinction maximal entre des lignes de cellules) Et le plus grand après 72 h (Figure 4). Ces images ont été acquises rapidement à l&#39;aide d&#39;un cytomètre imagerie, comme pour U-87 MG. Cependant, dans ce cas, pour illustrer un autre procédé, le degré d&#39;invasion a été quantifiée manuellement en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image autonome et est présentée sous forme graphique (figures 3 et 4). Ces résultats illustrent une différence phénotypique entre les cellules sensibles aux médicaments et résistantes qui pourraient être utilisés pour cribler des composés qui antagonisent spécifiquement le médicament résistant, phénotype invasif. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" /> Figure 1. Aperçu schématique de la 3D sphéroïde tumeur dosage d&#39;invasion. Le flux de travail montre les étapes de la méthode consiste à inclure des images représentatives de sphéroïdes U-87 MG glioblastome juste après incorporation dans BMM (panneau supérieur; t = 0) et après l&#39;invasion<html> dans BMM (panneau de fond; t = 72 h) avec et sans la segmentation qui mesure la zone couverte par les cellules envahissantes. Bar = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" /> Figure 2. Le cours du temps invasion U-87 MG glioblastome sphéroïde dans BMM. U-87 MG sphéroïde invasion 3D dans BMM a été surveillée et quantifiée jusqu&#39;à 72 heures en utilisant un cytomètre imagerie. (A) Des images représentatives et (B) la quantification des invasion des cellules tumorales sont indiquées. Bar = 500 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> re 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg &quot;/&gt; Figure 3. CAL R (résistant) et CAL S (sensible) invasion sphéroïde de la tumeur. (A) Des images représentatives et (B) la quantification manuel de l&#39;EGF dose-dépendante CAL R et S CAL sphéroïde invasion tumorale sont présentés. Bar = 500 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" /> Figure 4. Les cellules de CAL R (résistants) sphéroïdes sont plus invasive que S sphéroïdes tumoraux CAL (sensibles) lorsqu&#39;il est placé dans BMM. Sur sphéroïdes tumorales EGF stimulation CAL R montrent une invasion plus prononcée que CAL S. (A) Des images représentatives et (B) la quantification manuel d&#39;invasion sont représentés. Bar = 500 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

L’invasion des tissus normaux environnants est une caractéristique déterminante des tumeurs malignes. Nous fournissons ici un test simple et semi-automatisé sur microplaque d’invasion dans une biomatrice 3D naturelle qui a été illustré par un certain nombre de modèles de cancers humains avancés.

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

L'objectif général de cette procédure est de proposer un dosage in vitro, semi-automatisé et tridimensionnel de l'envahissement cellulaire tumorale en microplaque. Cette approche consiste, dans un premier temps, à générer de façon reproductible des stéroïdes tumoraux de taille contrôlée en suspension, dans des plaques ultrabasse adhérence à fond rond de 96 puits, avec un stéroïde par puits. La deuxième étape consiste à prélever une partie du milieu et à ajouter directement dans chaque puits une matrice semblable à la membrane basale, ou BMM, afin de former une matrice semi-solide dans laquelle les cellules tumorales peuvent s'invaginer à partir du corps stéroïdien.Ensuite, l'invasion tumorale par les stéroïdes est surveillée à intervalles réguliers sur une période de 72 à 96 heures, durant laquelle l'acquisition d'images est effectuée soit automatiquement sur un cytomètre, soit manuellement au microscope. La dernière étape consiste à analyser l'invasion des cellules tumorales à l'aide d'un cytomètre automatisé ou d'un logiciel d'imagerie. En définitive, le test d'invasion tumorale par les stéroïdes en 3D est utilisé pour modéliser l'invasion cancéreuse in vitro selon un format plus proche de la physiologie, et adapté aux études de validation de cibles et de criblage de médicaments.Nous pensons que cette technique est complémentaire aux essais simples de prolifération cellulaire en deux dimensions habituellement utilisés pour la validation de cibles et le criblage de médicaments en recherche contre le cancer, car elle nous permet également d'étudier l'envahissement, un aspect clé de la progression tumorale, dans un format tridimensionnel physiologiquement pertinent. J'ai eu l'idée de cette méthode lorsque j'ai optimisé la phénomène de tumeur en 3D, la croissance en microplaque. J'ai pensé qu'il serait intéressant d'utiliser le même dispositif et d'examiner également l'envahissement, et le résultat s'est avéré simple : il suffit de retirer une partie du milieu de chaque puits et de le remplacer par une matrice analogue à la membrane basale.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car maintenir les stéroïdes en position centrale dans chaque puits après la tradition des BMM peut s'avérer difficile au départ. Cela peut entraîner une analyse d'image sous-optimale en raison de la présence des stéroïdes dans des plans de focalisation différents. Avec l'expérience.Cela arrive rarement, mais si nécessaire, le processus peut être facilité par une centrifugation douce de la plaque. Pour commencer, laissez toutes les BMM sur de la glace pendant la nuit, conservez un jeu de pipettes stériles avec embouts filtrants pour les pipettes P 10 E 200 et P 1000, ainsi que des tubes stériles à moins 20 degrés Celsius. Placez également les plaques 96 puits à ultra faible adhérence contenant des stéroïdes âgés de quatre jours sur de la glace.À l’aide d’une pipette multicanal, retirez délicatement 100 microlitres par puits de milieu de croissance provenant des plaques de moineaux. Pour cette étape, orientez la pointe vers la paroi interne du fond en U, en évitant soigneusement tout contact avec le fond du puits et l'emplacement de la sphère.Afin de minimiser la perturbation des stéroïdes, utilisez des embouts glacés pour transférer les BMM dans des tubes préalablement refroidis sur glace. Pour les études d'envahissement induit par des cytokines ou d'évaluation de médicaments, ajoutez les réactifs aux BMM à l'aide d'embouts glacés. Par exemple, utilisez le facteur de croissance épidermique ou EGF pour stimuler l'envahissement des cellules de carcinome épidermoïde Cal S et cal r.Ensuite, dispensez délicatement 100 microlitres de BMM dans le puits. Orientez soigneusement la pointe vers la paroi interne du puits. Cette étape est la plus critique.En ce qui concerne l'analyse d'image optique, les stéroïdes doivent rester au centre du, eh bien. Répétez cette étape pour tous les puits requis, en prévoyant cinq à six réplicats par condition. Si nécessaire, remplacez par une nouvelle pointe préalablement refroidie à l’aide d’une aiguille stérile.Éliminer les bulles s'il y en a. Utiliser un microscope pour vérifier visuellement que les stéroïdes sont en position centrale ; sinon, centrifuger la plaque à 300 × g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Cela garantira que les stéroïdes se trouvent au centre de chaque puits.Ensuite, transférez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et laissez le BMM durcir pendant une heure. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter délicatement 100 microlitres par puits de milieu de croissance complet. Milieu ou études d'envahissement induit par cytokine ou d'évaluation de médicaments.Ajoutez des cytokines ou des inhibiteurs dans le milieu pour l'acquisition automatisée d'images. Analysez les plaques sur le cytomètre à intervalles réguliers. À partir de l'instant zéro, sélectionnez l'application de confluence.Ensuite, vérifiez que le stéroïde est en netteté. Si nécessaire, ajustez manuellement la mise au point et corrigez le décalage de mise au point. Dans les paramètres d'échantillonnage.Analyser un champ de vision central à l’aide du sélecteur. Après l’ajout de BMM, les stéroïdes tumoraux doivent être restés en position centrale. Ainsi, il n’est pas nécessaire d’analyser la totalité de la cavité dans le logiciel.Définissez les puits à analyser en les surlignant sur la carte de la plaque. Ensuite, cliquez sur démarrer l'analyse. Pour l'analyse d'image automatisée, sélectionnez l'application de confluence.Dans l'onglet d'analyse, ajustez les paramètres de l'application pour obtenir une segmentation précise autour du stéroïde, incluant les prolongements cellulaires et les podia des envahisseurs s'étendant dans la matrice osseuse. Ajustez les paramètres pour chaque lignée cellulaire tumorale et/ou à différents points temporels. Vérifiez que les paramètres d'analyse conviennent à d'autres stéroïdes dans la plaque en cliquant sur quelques puits différents.Si la segmentation ne délimite pas correctement un stéroïde, ajustez davantage les paramètres de l'application. Cliquez sur Démarrer l'analyse dans l'onglet Résultats. Vérifiez plusieurs puits pour confirmer la qualité de l'analyse avant d'exporter les données au niveau des puits vers un programme de feuille de calcul.Répétez l'analyse pour tous les points temporels, puis calculez le pourcentage moyen de confluence pour les puits réplicats et représentez l'invasion en fonction du temps sur un diagramme à barres. À l'aide d'un logiciel scientifique de graphisme et de statistiques au choix pour l'acquisition manuelle des images, utilisez un microscope inversé équipé d'un objectif 10 x pour enregistrer une image pour chaque stéroïde tumoral à intervalles réguliers. Commencez à T égal à zéro jusqu'à T égal à entre 72 et 96 heures.En fonction de la vitesse d'envahissement de la muqueuse cellulaire en question, utilisez un objectif Forex lorsque la zone envahie est trop grande pour être entièrement capturée dans le champ de vision à 10 x. Enregistrez chaque image individuelle acquise pour une analyse d'image manuelle. Ouvrez les images du graphe de la platine dans l'analyse d'image.Le logiciel de choix pour l'étalonnage utilise des images d'un graphique de stage prises à l'aide des objectifs 10 x et 4 x. Saisissez les mesures graphiques, les unités et les objectifs utilisés, puis effectuez l'étalonnage.Cette étape n'est requise qu'une seule fois pour les analyses d'images ultérieures. Rechargez simplement les paramètres d'étalonnage nécessaires. Ensuite, ouvrez les images de l'essai d'invasion et sélectionnez les paramètres d'étalonnage en fonction de l'objectif du microscope utilisé pour obtenir les images.Mesurez la surface couverte par les stéroïdes dans le logiciel utilisé ici. Allez dans Mesurer et sélectionnez Compter la taille. Choisissez Ensuite, chargez les paramètres et sélectionnez les paramètres de dosage prédéterminés.Ensuite, sélectionnez le décompte. Le stéroïde doit alors être segmenté avec précision. Exportez les mesures, qui correspondent à différents paramètres, vers une feuille de calcul et enregistrez les informations d'image pertinentes dans cette feuille de calcul.Enfin, tracez la surface moyenne des stéroïdes ou de l'invasion répliqués en fonction du temps à l'aide d'un logiciel scientifique de représentation graphique et d'analyse statistique. Ce graphique illustre ici un exemple d'invasion de cellules cancéreuses observée dans la lignée cellulaire de glioblastome U 87 MG, qui peut servir à illustrer l'invasion des tumeurs cérébrales. Une fois intégrées dans la matrice, les cellules se dispersent selon un motif d'invasion caractéristique en étoile, processus suivi sur une période de 72 heures.Analyse d'image entièrement automatisée. L'utilisation d'un cytomètre à image permet une segmentation autour des prolongements cellulaires et autorise une quantification précise de l'invasion des cellules tumorales. Remarquez que, pour cette lignée cellulaire, le corps stéroïde est exclu de la mesure de la surface envahie.L'analyse d'image entièrement automatisée est facilement réalisée et permet la quantification de l'invasion des cellules tumorales au fil du temps. Un motif différent d'invasion cellulaire est observé chez les lignées isogéniques de cancer humain épidermoïde de la tête et du cou. Les lignées cellulaires cancéreuses Cal S sont sensibles, tandis que CAL R est résistante aux inhibiteurs de la tyrosine kinase du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR).En l'absence de FEG, aucune des deux lignées cellulaires n'a envahi la MBM en présence de protrusions en forme de doigts induites par le FEG, extrudées à partir du corps principal des cellules Cal ars stéroïdes. Alors que les cellules Cal s étaient moins invasives après 72 heures, les images ont été acquises rapidement dans ce cas à l’aide d’un cytomètre d’images, et afin d’illustrer une méthode alternative, le degré d’invasion a été quantifié manuellement à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images autonome. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l’esprit que chaque lignée cellulaire doit être optimisée en fonction de sa capacité à former des stéroïdes, de la densité d’ensemencement cellulaire, de la composition de la matrice et des paramètres d’imagerie et d’analyse, suite à cette procédure. La même méthode pourrait également être adaptée pour évaluer une invasion tissulaire en 3D en utilisant, par exemple, des tumeurs en co-culture avec des embryons pour imiter un tissu complexe ou d'autres organoïdes tels que les astrocytes pour le gliome, des cultures de cryptes pour les cancers gastro-intestinaux, ou le foie pour le carcinome hépatocellulaire et les métastases du cancer colorectal.

three-dimensional-3d-tumor-spheroid-invasion-assay

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Un test pour mesurer quantitativement Transforming Growth Factor (TGF)-β-induite invasion dans des gels de collagène en 3 dimensions est décrite. Ce test prend avantage de la série MCF10A de lignées cellulaires, qui représentent les différentes étapes du développement du cancer du sein. Cette méthode peut être adoptée pour être utilisé avec d'autres lignées cellulaires et pourraient être utilisées pour étudier d'autres activateurs ou des inhibiteurs potentiels de l'invasion.

Assay Sphéroïde pour mesurer le TGF-β induit Invasion

Cette vidéo présente une méthode permettant d’établir une co-culture tridimensionnelle de sphéroïdes tumoraux et de lymphocytes T. Un moulage à l’agarose avec des micropuits contenant des sphéroïdes tumoraux est préparé, suivi de l’ajout de lymphocytes T. Après l’incubation, cette configuration permet d’étudier l’interaction des lymphocytes T avec les sphéroïdes tumoraux dans un environnement tridimensionnel contrôlé.

Un modèle de co-culture tridimensionnelle de lymphocytes T infiltrants dans des sphéroïdes tumoraux

Source : Guyon, J., et al. Un modèle sphéroïde 3D pour le glioblastome. J. Vis. Exp. (2020)La vidéo démontre la génération d’un modèle sphéroïde tridimensionnel de l’invasion des cellules tumorales. Les sphéroïdes sont formés à partir de cellules tumorales du cerveau humain et intégrés dans une matrice de collagène. Les cellules tumorales à la périphérie des sphéroïdes adoptent un phénotype invasif, sécrétant des protéases pour dégrader le collagène et progressant pour envahir la matrice...

Génération d’un modèle sphéroïde tridimensionnel d’invasion de cellules tumorales

Cette méthode évalue l’invasion des cellules cancéreuses des sphéroïdes dans une matrice 3D environnante.  Les sphéroïdes sont générés par la méthode de culture de gouttes suspendues, puis intégrés dans une matrice composée de matériaux de membrane basale et de collagène de type I.  L’invasion des sphéroïdes est ensuite surveillée.

Une cellule cancéreuse Spheroid test pour évaluer Invasion dans un Cadre 3D

Les processus d’invasion du cancer de la vessie représentent des occasions de biomarqueurs et de développement thérapeutique. Ici, nous présentons un modèle d’invasion de cancer de la vessie qui intègre la culture 3D des sphéroïdes de tumeur, Time-lapse imagerie et microscopie confocale. Cette technique est utile pour définir les caractéristiques du processus invasif et pour le dépistage des agents thérapeutiques.

Système de Culture cellulaire 3D pour étudier l’Invasion et l’évaluation thérapeutique dans le Cancer de la vessie

Le microenvironnement tumoral est une partie essentielle de la croissance du cancer et de l’invasion. Pour imiter la progression du carcinome, une matrice humaine biologiquement pertinente est nécessaire. Ce protocole introduit une amélioration pour le test in vitro d’invasion de sphéroïdes en trois dimensions en appliquant une matrice humaine à base de leiomyoma. Le protocole introduit également une analyse d’invasion cellulaire basée sur ordinateur.

Matrice entièrement humaine basée sur la tumeur dans l’essai d’invasion de sphéroïdes en trois dimensions

L'objectif de ce protocole est d'établir un modèle in vitro 3D pour étudier la différenciation des fibroblastes associés au cancer (CAF) dans un environnement en vrac tumoral, qui peut être abordé dans différents systèmes d'analyse, tels que l'immunofluorescence, la transcription l'analyse et l'imagerie des cellules de vie.

Un modèle sphéroïde 3D comme un système plus physiologique pour les fibroblastes associés au cancer différenciation et l'invasion des études in vitro

Ici, nous décrivons un essai d’invasion facile à utiliser pour le glioblastome. Cet essai convient aux cellules souches du glioblastome. Une macro fidjienne pour faciliter la quantification de l’invasion, de la migration et de la prolifération est également décrite.

Un modèle sphéroïde 3D pour le Glioblastome

L’approche présentée évalue simultanément l’invasion de cellules cancéreuses dans les essais sphéroïdes 3D et la cytotoxicité de cellule T. Les sphéroïdes sont générés dans un jet de multi-microwell sans échafaudage. La co-culture et l’intégration dans la matrice de collagène de type I sont effectuées dans le même dispositif qui permet de surveiller l’invasion des cellules cancéreuses et la cytotoxicité médiée par cellules T.

Surveillance de l’invasion des cellules cancéreuses et de la cytotoxicité des lymphocytes T dans la culture 3D

Présenté ici est un protocole pour la fabrication d’un dispositif d’imagerie sphéroïde. Ce dispositif permet l’imagerie dynamique ou longitudinale de fluorescence des sphéroïdes de cellules cancéreuses. Le protocole offre également une procédure simple de traitement d’image pour l’analyse de l’invasion des cellules cancéreuses.

Imagerie et analyse de fluorescence résolues dans le temps de l’invasion des cellules cancéreuses dans le modèle sphéroïde 3D

L’invasion est un phénomène biologique majeur dans le développement et la progression du cancer. Ce processus est influencé par les cellules non néoplasiques et les composants du microenvironnement tumoral. Le but de cette étude est de décrire une méthode alternative pour analyser l’invasion des cellules tumorales in vitro à l’aide de cultures tridimensionnelles (3D).

Stratégie alternative pour analyser l’invasion cellulaire in vitro de cultures 3D

Apprenez un test d'invasion tumorale 3D semi-automatisé utilisant une matrice de membrane basale. Cette méthode permet d'étudier le comportement des cellules cancéreuses dans un environnement physiologiquement pertinent pour la recherche oncologique.

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Explorer plus de vidéos