Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

L'objectif général de cette procédure est de proposer un dosage in vitro, semi-automatisé et tridimensionnel de l'envahissement cellulaire tumorale en microplaque. Cette approche consiste, dans un premier temps, à générer de façon reproductible des stéroïdes tumoraux de taille contrôlée en suspension, dans des plaques ultrabasse adhérence à fond rond de 96 puits, avec un stéroïde par puits. La deuxième étape consiste à prélever une partie du milieu et à ajouter directement dans chaque puits une matrice semblable à la membrane basale, ou BMM, afin de former une matrice semi-solide dans laquelle les cellules tumorales peuvent s'invaginer à partir du corps stéroïdien.

Ensuite, l'invasion tumorale par les stéroïdes est surveillée à intervalles réguliers sur une période de 72 à 96 heures, durant laquelle l'acquisition d'images est effectuée soit automatiquement sur un cytomètre, soit manuellement au microscope. La dernière étape consiste à analyser l'invasion des cellules tumorales à l'aide d'un cytomètre automatisé ou d'un logiciel d'imagerie. En définitive, le test d'invasion tumorale par les stéroïdes en 3D est utilisé pour modéliser l'invasion cancéreuse in vitro selon un format plus proche de la physiologie, et adapté aux études de validation de cibles et de criblage de médicaments.

Nous pensons que cette technique est complémentaire aux essais simples de prolifération cellulaire en deux dimensions habituellement utilisés pour la validation de cibles et le criblage de médicaments en recherche contre le cancer, car elle nous permet également d'étudier l'envahissement, un aspect clé de la progression tumorale, dans un format tridimensionnel physiologiquement pertinent. J'ai eu l'idée de cette méthode lorsque j'ai optimisé la phénomène de tumeur en 3D, la croissance en microplaque. J'ai pensé qu'il serait intéressant d'utiliser le même dispositif et d'examiner également l'envahissement, et le résultat s'est avéré simple : il suffit de retirer une partie du milieu de chaque puits et de le remplacer par une matrice analogue à la membrane basale.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car maintenir les stéroïdes en position centrale dans chaque puits après la tradition des BMM peut s'avérer difficile au départ. Cela peut entraîner une analyse d'image sous-optimale en raison de la présence des stéroïdes dans des plans de focalisation différents. Avec l'expérience.

Cela arrive rarement, mais si nécessaire, le processus peut être facilité par une centrifugation douce de la plaque. Pour commencer, laissez toutes les BMM sur de la glace pendant la nuit, conservez un jeu de pipettes stériles avec embouts filtrants pour les pipettes P 10 E 200 et P 1000, ainsi que des tubes stériles à moins 20 degrés Celsius. Placez également les plaques 96 puits à ultra faible adhérence contenant des stéroïdes âgés de quatre jours sur de la glace.

À l’aide d’une pipette multicanal, retirez délicatement 100 microlitres par puits de milieu de croissance provenant des plaques de moineaux. Pour cette étape, orientez la pointe vers la paroi interne du fond en U, en évitant soigneusement tout contact avec le fond du puits et l'emplacement de la sphère.

Afin de minimiser la perturbation des stéroïdes, utilisez des embouts glacés pour transférer les BMM dans des tubes préalablement refroidis sur glace. Pour les études d'envahissement induit par des cytokines ou d'évaluation de médicaments, ajoutez les réactifs aux BMM à l'aide d'embouts glacés. Par exemple, utilisez le facteur de croissance épidermique ou EGF pour stimuler l'envahissement des cellules de carcinome épidermoïde Cal S et cal r.

Ensuite, dispensez délicatement 100 microlitres de BMM dans le puits. Orientez soigneusement la pointe vers la paroi interne du puits. Cette étape est la plus critique.

En ce qui concerne l'analyse d'image optique, les stéroïdes doivent rester au centre du, eh bien. Répétez cette étape pour tous les puits requis, en prévoyant cinq à six réplicats par condition. Si nécessaire, remplacez par une nouvelle pointe préalablement refroidie à l’aide d’une aiguille stérile.

Éliminer les bulles s'il y en a. Utiliser un microscope pour vérifier visuellement que les stéroïdes sont en position centrale ; sinon, centrifuger la plaque à 300 × g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Cela garantira que les stéroïdes se trouvent au centre de chaque puits.

Ensuite, transférez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et laissez le BMM durcir pendant une heure. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter délicatement 100 microlitres par puits de milieu de croissance complet. Milieu ou études d'envahissement induit par cytokine ou d'évaluation de médicaments.

Ajoutez des cytokines ou des inhibiteurs dans le milieu pour l'acquisition automatisée d'images. Analysez les plaques sur le cytomètre à intervalles réguliers. À partir de l'instant zéro, sélectionnez l'application de confluence.

Ensuite, vérifiez que le stéroïde est en netteté. Si nécessaire, ajustez manuellement la mise au point et corrigez le décalage de mise au point. Dans les paramètres d'échantillonnage.

Analyser un champ de vision central à l’aide du sélecteur. Après l’ajout de BMM, les stéroïdes tumoraux doivent être restés en position centrale. Ainsi, il n’est pas nécessaire d’analyser la totalité de la cavité dans le logiciel.

Définissez les puits à analyser en les surlignant sur la carte de la plaque. Ensuite, cliquez sur démarrer l'analyse. Pour l'analyse d'image automatisée, sélectionnez l'application de confluence.

Dans l'onglet d'analyse, ajustez les paramètres de l'application pour obtenir une segmentation précise autour du stéroïde, incluant les prolongements cellulaires et les podia des envahisseurs s'étendant dans la matrice osseuse. Ajustez les paramètres pour chaque lignée cellulaire tumorale et/ou à différents points temporels. Vérifiez que les paramètres d'analyse conviennent à d'autres stéroïdes dans la plaque en cliquant sur quelques puits différents.

Si la segmentation ne délimite pas correctement un stéroïde, ajustez davantage les paramètres de l'application. Cliquez sur Démarrer l'analyse dans l'onglet Résultats. Vérifiez plusieurs puits pour confirmer la qualité de l'analyse avant d'exporter les données au niveau des puits vers un programme de feuille de calcul.

Répétez l'analyse pour tous les points temporels, puis calculez le pourcentage moyen de confluence pour les puits réplicats et représentez l'invasion en fonction du temps sur un diagramme à barres. À l'aide d'un logiciel scientifique de graphisme et de statistiques au choix pour l'acquisition manuelle des images, utilisez un microscope inversé équipé d'un objectif 10 x pour enregistrer une image pour chaque stéroïde tumoral à intervalles réguliers. Commencez à T égal à zéro jusqu'à T égal à entre 72 et 96 heures.

En fonction de la vitesse d'envahissement de la muqueuse cellulaire en question, utilisez un objectif Forex lorsque la zone envahie est trop grande pour être entièrement capturée dans le champ de vision à 10 x. Enregistrez chaque image individuelle acquise pour une analyse d'image manuelle. Ouvrez les images du graphe de la platine dans l'analyse d'image.

Le logiciel de choix pour l'étalonnage utilise des images d'un graphique de stage prises à l'aide des objectifs 10 x et 4 x. Saisissez les mesures graphiques, les unités et les objectifs utilisés, puis effectuez l'étalonnage.

Cette étape n'est requise qu'une seule fois pour les analyses d'images ultérieures. Rechargez simplement les paramètres d'étalonnage nécessaires. Ensuite, ouvrez les images de l'essai d'invasion et sélectionnez les paramètres d'étalonnage en fonction de l'objectif du microscope utilisé pour obtenir les images.

Mesurez la surface couverte par les stéroïdes dans le logiciel utilisé ici. Allez dans Mesurer et sélectionnez Compter la taille. Choisissez Ensuite, chargez les paramètres et sélectionnez les paramètres de dosage prédéterminés.

Ensuite, sélectionnez le décompte. Le stéroïde doit alors être segmenté avec précision. Exportez les mesures, qui correspondent à différents paramètres, vers une feuille de calcul et enregistrez les informations d'image pertinentes dans cette feuille de calcul.

Enfin, tracez la surface moyenne des stéroïdes ou de l'invasion répliqués en fonction du temps à l'aide d'un logiciel scientifique de représentation graphique et d'analyse statistique. Ce graphique illustre ici un exemple d'invasion de cellules cancéreuses observée dans la lignée cellulaire de glioblastome U 87 MG, qui peut servir à illustrer l'invasion des tumeurs cérébrales. Une fois intégrées dans la matrice, les cellules se dispersent selon un motif d'invasion caractéristique en étoile, processus suivi sur une période de 72 heures.

Analyse d'image entièrement automatisée. L'utilisation d'un cytomètre à image permet une segmentation autour des prolongements cellulaires et autorise une quantification précise de l'invasion des cellules tumorales. Remarquez que, pour cette lignée cellulaire, le corps stéroïde est exclu de la mesure de la surface envahie.

L'analyse d'image entièrement automatisée est facilement réalisée et permet la quantification de l'invasion des cellules tumorales au fil du temps. Un motif différent d'invasion cellulaire est observé chez les lignées isogéniques de cancer humain épidermoïde de la tête et du cou. Les lignées cellulaires cancéreuses Cal S sont sensibles, tandis que CAL R est résistante aux inhibiteurs de la tyrosine kinase du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR).

En l'absence de FEG, aucune des deux lignées cellulaires n'a envahi la MBM en présence de protrusions en forme de doigts induites par le FEG, extrudées à partir du corps principal des cellules Cal ars stéroïdes. Alors que les cellules Cal s étaient moins invasives après 72 heures, les images ont été acquises rapidement dans ce cas à l’aide d’un cytomètre d’images, et afin d’illustrer une méthode alternative, le degré d’invasion a été quantifié manuellement à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images autonome. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l’esprit que chaque lignée cellulaire doit être optimisée en fonction de sa capacité à former des stéroïdes, de la densité d’ensemencement cellulaire, de la composition de la matrice et des paramètres d’imagerie et d’analyse, suite à cette procédure. La même méthode pourrait également être adaptée pour évaluer une invasion tissulaire en 3D en utilisant, par exemple, des tumeurs en co-culture avec des embryons pour imiter un tissu complexe ou d'autres organoïdes tels que les astrocytes pour le gliome, des cultures de cryptes pour les cancers gastro-intestinaux, ou le foie pour le carcinome hépatocellulaire et les métastases du cancer colorectal.