Name: Simplifié droits de neutrophiles extracellulaires Piège (NET) Isolement et Manipulation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Apprenez à isoler les pièges extracellulaires de neutrophiles (NETs) à partir de sang humain total. Cette méthode simple utilise une centrifugation différentielle et la stimulation au PMA pour étudier l'adhésion des cellules cancéreuses.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Paul Kubes pour ses conseils et son mentorat qui ont joué un rôle central dans la construction de ce travail.

NOTE: Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux lignes directrices éthiques institutionnels locaux. 1. Dessin de sang <ol><li> Grâce venipucture coude, de recueillir 14 tubes de sang à partir d&#39;un volontaire sain en Top Green tubes (héparine) et inverser chaque tube avant de se installer sur la glace. Prélever le sang dans les 10 à 15 min de l&#39;expérience pour assurer un rendement optimal des neutrophiles. </li></ol> 2. Isolement des neutrophiles du sang total <ol><li> Laver chaque tube vert en haut de sang avec 5 ml de PBS sans Ca et Mg à diluer le sang. Dans chacun des 4 x 50 ml tubes coniques, ajouter 15 ml de séparation de lymphocytes Media (LSM) à température ambiante. En utilisant une aiguille 18 G monté sur une seringue de 60 ml, couche attentivement le sang dilué sur la LSM, créant une interface LSM-sang forte. REMARQUE: Éviter de mélanger des couches autant que possible. </li><li> Centrifuger à 800 g pendant 30 min à 21 ° C sans interruption. NOTE: Sudden pauses peutprovoquer le mélange des différentes couches. </li><li> Observez le érythrocytes et des neutrophiles sédiments au fond. Aspirer et jeter les deux couches supérieures (plasma et LSM) en veillant à se débarrasser de l&#39;interface entre ces couches qui contient les lymphocytes et les cellules mononucléaires, ne laissant que la couche rouge en bas. </li><li> Pour chaque tube, ajouter 20 ml de tampon phosphate salin (PBS) et une solution de Dextran 20 ml de 6%. Retourner doucement chaque tube pour mélanger avec la couche d&#39;érythrocytes et des neutrophiles et laisser reposer à température ambiante pendant 30 min. NOTE: Cela permettra de globules rouges (hématies) dans les sédiments au fond. </li><li> Après 30 minutes, transférer le surnageant riche en polynucléaires neutrophiles dans des tubes frais et jeter les pastilles RBC. surnageants de centrifuger à 450 g à 4 ° C pendant 5 min. Après centrifugation, éliminer le surnageant. Le culot contient principalement des neutrophiles et quelques globules rouges. </li><li> Préparer une solution de lyse par addition de 0,5 ml de tampon de lyse pour 4,5 ml d&#39;eau stérile. Lyse reste RBC til a préparé 5 ml de solution de lyse, le transfert de tous les culots remis en suspension dans un tube. Autoriser lyse à la température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 10 min. </li><li> Centrifuger à 450 xg à 4 ° C pendant 5 min. Rejeter le surnageant et laver culot avec 5 ml de PBS sans Ca et Mg et centrifuger à nouveau à 450 g à 4 ° C pour se débarrasser de toute solution de lyse restant. Le culot obtenu à ce stade contient les neutrophiles. Reprendre le culot dans 30 ml de froid 3% RPMI et de mettre sur la glace. NOTE: 3% RPMI est faite en complétant un milieu RPMI avec 3% de sérum fœtal bovin (FBS) </li><li> Vérifiez la pureté de l&#39;échantillon en utilisant une coloration au bleu de méthylène. &gt; 95% des cellules doit être granulocytes avec des noyaux multi-lobaires. Utilisez Trypan coloration au bleu de vérifier&gt; 95% la viabilité des cellules et compter le rendement des neutrophiles finale. Diluer neutrophiles dans la glace froide 3% du RPMI pour obtenir une concentration finale de 5 x 10 6 / ml neutrophiles. </li></ol> 3. NET Generation <ol><li> Stimuler neutrophiles avec 500 nM de PMA (par 30 ml d&#39;une solution de neutrophiles) et incuber sur un tissu plat plat 150 x 25 mm de culture de 20 mm grille pendant 4 heures à 37 ° C 5% CO 2. Cela permettra NETosis. </li><li> Après 4 heures de stimulation, aspirer délicatement et jeter les médias, laissant la couche de filets et de neutrophiles adhéré au fond. Ne pas perturber cette couche. </li><li> Utilisation d&#39;un total de 15 ml de PBS froid sans Ca et Mg par boîte, laver la partie inférieure de chaque boîte en pipetant 15 ml de PBS sur le fond de la boîte pour enlever toutes les matières adhérentes à partir du bas. </li><li> Recueillir la solution obtenue à partir de chaque boîte de lavage (étape 3.3) dans un tube conique de 15 ml et on centrifuge pendant 10 minutes à 450 xg à 4 ° C. Neutrophiles et toutes les cellules restantes seront culot au fond, laissant un riche NET surnageant acellulaire. </li><li> Diviser surnageant dans 1,5 ml tubes micro-centrifugeuse et de spin pendant 10 min à 18 000 g à 4 ° C. Cela permettra à tout l&#39;ADN à Pellet. REMARQUE: La centrifugation à plus grande tubes est plus facile et moins de temps si de telles vitesses élevées sont réalisables sur la centrifugeuse régulière, sinon devront diviser surnageants dans des tubes plus petits afin d&#39;utiliser à grande vitesse micro-centrifugeuse. </li><li> Rejeter le surnageant et remettre en suspension les culots obtenus ensemble dans du PBS froid sur glace à une concentration correspondant à 2 x 10 7 cellules neutrophiles par 100 ul de PBS. Cela donnera le stock net franco-cellule qui peut être utilisé pour des expériences ultérieures. </li><li> Mesurer la concentration d&#39;ADN dans l&#39;échantillon obtenu par spectrophotométrie ou suppléant outil de quantification de l&#39;ADN. Une concentration adéquate dans l&#39;échantillon doit être comprise entre 140 à 180 ng / ul. </li></ol> 4. NET-cancer cellule statique Essai d&#39;adhésion <ol><li> Ajouter 100 ul du stock NET précédemment obtenue par puits dans une plaque de fond bien à plat 96 et laisser manteau puits O / N à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Entre 12 et 20 heures plus tard, vérifier la formation d&#39;une monocouche de cellule uniformeNET gratuits au fond des puits au microscope (Figure 1). À ce stade, aspirer délicatement toutes les matières non-adhérentes sur les puits, en veillant à ne pas perturber la monocouche NET au fond. </li><li> Ajouter 100 ul de 1% de sérumalbumine bovine (BSA) une solution de blocage à chaque puits et laisser reposer pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Détacher les cellules du cancer de la A549 à partir d&#39;un flacon T-75 à l&#39;aide de 2 ml de solution de trypsine à 0,25%. Une fois détachée, ajouter 10 ml de milieu de cellules A549 traitées à la trypsine et centrifuger à 450 xg à 4 ° C pendant 5 min. Jeter les cellules du surnageant et remettre en suspension dans un milieu pour obtenir une concentration de 2 x 10 4 cellules cancéreuses par 100 ul de médias. REMARQUE: Les cellules A549 ont été cultivées séparément. Brièvement, les cellules ont été cultivées et maintenues dans du DMEM F12 contenant 10% de FBS et 1% de pénicilline streptomycine et on incube à 37 ° C 5% CO 2. Une fois que 70 à 80% de confluence de cellules a été atteint, ils ont été détachées en utilisant 0,25% de trypsine-EDTA et remises en suspension dans le même milieudécrit ci-dessus. </li><li> cellules de cancer du CFSE par tache en utilisant l&#39;ajout d&#39;une pi de CFSE par ml de milieu et laisser tache à TA pendant 10 min. Après coloration, la centrifugeuse vers le bas à 450 xg à 4 ° C pendant 5 min puis jeter cellules surnageant et remettre en suspension dans le volume initial de médias pour obtenir une concentration de 2 x 10 4 cellules cancéreuses par 100 ul de médias. </li><li> Après 1 h de NET de blocage, doucement bloquant aspiration solution et ajouter 2 x10 4 cellules cancéreuses dans les médias, ce qui équivaut à 100 pi par puits sur la monocouche NET et laisser adhérer pendant 90 min à 37 ° C 5% de CO 2. Aspirer délicatement les cellules et ajouter 100 pi de PBS à chaque puits pour laver toutes les cellules non-adhérentes. </li><li> Dans certains puits, ajouter des 1000U DNAse1 par puits pendant 10 minutes avant de les laver à dégrader NET. Cela servira de témoin négatif. En d&#39;autres puits, ajouter 100 pl d&#39;eau stérile par puits pendant 10 min, ce qui servira de commande de véhicule (VC). NOTE: trois répétitions par condition sont généralement effectués pour augmenter la taille de l&#39;échantillon. </li><li> Aspirer et jeter toute la solution dans les puits ne laissant que NET et les cellules cancéreuses adhérentes au fond. Ajouter 100 pi de solution de formaldéhyde 4% par puits pour fixer les cellules cancéreuses adhérentes aux filets et lire dosage sous le microscope de fluorescence (Figure 1). Terrain et analyser les résultats (Figure 3). </li></ol>

<ol><li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+mediate+a+host+defense+response+to+human+immunodeficiency+virus-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).</li>
<li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+extracellular+traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+infected+lung+tissue+is+dependent+on+invading+neutrophils+and+influenced+by+hydrophobin+RodA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6 (4), e1000873(2010).</li>
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<li>Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETs%3A+a+new+strategy+for+using+old+weapons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">NETs: a new strategy for using old weapons.</a> Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).</li>
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<li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li>
<li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage%2C+infiltrate+tissues%2C+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).</li>
<li>Khandpur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETs+are+a+source+of+citrullinated+autoantigens+and+stimulate+inflammatory+responses+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis.</a> Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140(2013).</li>
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<li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> J Clin Invest. , (2013).</li>
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<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li>
<li>Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+laboratory+procedures+for+isolating+human+peripheral+blood+derived+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Med+J+Malaysia%22%5BJournal%5D)">Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils.</a> Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+lymphocytes%2C+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages.</a> Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).</li>
<li>Calado, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+hormones%2C+acting+on+the+TERT+gene%2C+increase+telomerase+activity+in+human+primary+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells.</a> Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).</li>
<li>Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+regulation+of+bv8+in+human+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization and regulation of bv8 in human blood cells.</a> Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).</li>
<li>Wu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+leukocyte+labeling+with+intravenous+ferumoxides%2Fprotamine+sulfate+complex+and+in+vitro+characterization+for+cellular+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).</li>
<li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+directly+induce+epithelial+and+endothelial+cell+death%3A+a+predominant+role+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones.</a> PLoS One. 7 (2), e32366(2012).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer

Le protocole d&#39;isolement de neutrophiles Piège extracellulaire démontré dans cette vidéo combine différentes techniques utilisées dans la littérature pour l&#39;isolement des neutrophiles et formation NET. Il simplifie un processus assez complexe et variable et offre un moyen très fiable et reproductible pour isoler NET sans cellules purifiées avec moins d&#39;étapes que les autres protocoles. En outre, des réactifs facilement disponibles sont employés ajoutent à la simplicité des protocoles et de réduire considérab...

Pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont nouvellement découvert des éléments de neutrophiles dérivés composées de brins d&#39;ADN extracellulaire décorées par des centaines de protéines et les histones. Elles sont sécrétées par les neutrophiles dans le contexte de l&#39;infection et l&#39;inflammation suivants stimuli spécifiques et ils ont été comptabilisés initialement faire partie des mécanismes de défense de l&#39;neutrophiles contre les infections. Ils ont d&#39;abord été présentés à promouvoir le piégeage de divers envahisseurs microbiens tels que les bactéries, virus et champignons 1-3. Le piégeage du microbe serait alors conduire à sa destruction à la fois directement par les protéines de NET-associé 3,4 et indirectement par le recrutement local des cellules phagocytaires 5,6. Le rôle des filets ne semble toutefois pas être limité à défense de l&#39;hôte. Plus récemment, ils ont été montré à jouer un rôle important dans les maladies auto-immunes 7,8, 9 thrombose, des troubles liés à la grossesse 10 et même la progression du cancer11,12. En conséquence, il apparaît que les filets jouent un rôle important dans un grand nombre de divers processus physiologiques. Toutefois, étant donné le roman nature de ces recherches, il reste beaucoup à élucider ce qui concerne les mécanismes par lesquels NET exercent leurs effets. Ici, nous présentons une méthode simplifiée pour l&#39;isolement de NET en l&#39;absence de neutrophiles. Dans la vidéo suivante, nous démontrons une technique simplifiée et facile à isoler NET au sang total humain. NET sans cellules peuvent ensuite être utilisés dans un certain nombre d&#39;expériences in vitro, y compris coloration, imuunofluorescence, effaçant ainsi que d&#39;un certain nombre d&#39;analyses telles que l&#39;adhérence, la prolifération et la migration. D&#39;autres protocoles existent 13, 19, mais ils sont généralement long, complexe, coûteux, et souvent, faible rendement 13. Ce protocole simplifié utilise des réactifs de base et diminue le nombre d&#39;étapes nécessaires pour isoler les neutrophiles, ce qui réduit donc la longueur du procre tout en maximisant le rendement. Procédé suivant combine différentes techniques pour l&#39;isolement des neutrophiles décrits précédemment dans la littérature pour obtenir un protocole simple qui donne un échantillon très pur de neutrophiles vivants. Comme suggéré dans la littérature, le sang veineux est recueilli dans des tubes EDTA et utilisé dans les 10 minutes pour éviter l&#39;activation des neutrophiles 14. Nous utilisons des médias de séparation de lymphocytes (LSM) centrifugation en gradient de densité pour isoler les granulocytes et les globules rouges à partir de sang entier héparinisé, une méthode adaptée de la technique de centrifugation par densité de Ficoll initialement décrite par Boyum 15 et al. LSM est une modification de la formulation Boyum qui substitue le diatrizoate de sodium pour le métrizoate de sodium et a été utilisé avec succès dans de nombreuses études pour isoler les neutrophiles 16-18. Après centrifugation différentielle de densité, les monocytes et les lymphocytes sont rejetés; les globules rouges sont ensuite sédimentéesen utilisant une solution de dextrane à 6% et 14 les globules rouges restants sont lysées pour obtenir une population de neutrophiles purs, ce qui est vérifié au bleu Trypan et une coloration au bleu de méthylène. De nombreux agents ont été utilisés pour induire NETosis la fois in vitro et in vivo, y compris un lipopolysaccharide (LPS) et de l&#39;acétate myristate de phorbol (PMA) et les interleukines (IL-8) 3,5,6. Dans le protocole suivant, les neutrophiles isolés sont stimulés avec 500 nM de PMA pendant 4 h, ce qui a été montré être une concentration suffisante pour permettre la formation NET cohérente et fiable sans favoriser l&#39;apoptose 19,20. Après isolement, nous montrons comment NET sans cellules obtenues à partir de ce protocole peuvent être utilisés dans un test d&#39;adhérence. DNAse1 est utilisé pour digérer et dégrader NET comme décrit précédemment et sert de témoin 2,3,11 ainsi. D&#39;autres options incluent l&#39;utilisation d&#39;un inhibiteur de l&#39;élastase neutrophile (IEN) pour inhiber formati NETsur, qui est une alternative acceptable lorsque l&#39;objectif est d&#39;inhiber la formation NET plutôt que de réaliser leur dégradation 11. Bien NEi a un certain nombre de fonctions variées, il a été précédemment montré que le dépôt NET peut être inhibée par NEi par blocage de la décondensation de la chromatine, la dégranulation des neutrophiles nucléaire et la mort 12

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate (PBS), modifiée, sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium</td><td>Wisent</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de séparation des lymphocytes (LSM)</td><td>Wisent</td><td>305-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de dextran (poudre)</td><td>Spectre</td><td>DE130</td><td>La solution de dextran à 6 % est obtenue en complétant le PBS avec du Ca et le Mg avec de la poudre de Dextran à 6 %</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Milieu avec de la L-glutamine</td><td>Wisent</td><td>La solution de 350-000-CL</td> à <td>3 % de RPMI est obtenue en complétant le RPMI avec 3 % de sérum de veau fœtal</td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse Buffer BD</td><td>Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)</td><td>Sigma-Alrdrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>DNAse1</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>F12 DMEM</td><td>Wisent</td><td>319-075-CL</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire Integrid avec grille de 20 mm (150 x 25 mm)</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr></tbody></table>

simplifié droits de neutrophiles extracellulaires piège (net) isolement et manipulation

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophiles extracellulaires Pièges (EVF) ont été récemment identifiés comme faisant partie de l&#39;arsenal antimicrobienne de neutrophiles. Outre leur rôle dans la lutte contre les infections, des recherches récentes ont démontré qu&#39;ils peuvent être impliqués dans de nombreux autres processus de la maladie, y compris la progression du cancer. Isoler NET purifiés est un élément crucial pour permettre l&#39;étude de ces fonctions. Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode simplifiée de l&#39;isolement de NET exempt de cellules du sang total humain en utilisant des réactifs facilement disponibles. NET isolés peuvent ensuite être utilisés pour immunofluorescence, buvard ou de divers tests fonctionnels. Cela permet une évaluation de leurs propriétés biologiques, en l&#39;absence des effets de confusion potentiels de neutrophiles eux-mêmes. Une technique de séparation en gradient de densité est utilisée pour isoler des neutrophiles à partir de sang entier de donneurs en bonne santé. Les neutrophiles isolés sont ensuite stimulées par du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) pour induire NETosis. Les neutrophiles activés sont ensuite rejetées, et un stock net sans cellules sont obtenues. Nous montrons ensuite comment TNE isolé peut être utilisé dans un essai d&#39;adhérence avec des cellules de cancer du poumon humain A549. Le stock net est utilisé pour recouvrir les puits d&#39;une 96 puits culture cellulaire plaque O N, et après s&#39;être assuré une formation de monocouche NET adéquate sur le fond des puits, CFSE étiquetés cellules / A549 sont ajoutés. Les cellules adhérentes sont quantifiés à l&#39;aide d&#39;un microscope à fluorescence Nikon TE300. Dans certains puits, 1000U DNAse1 est ajouté 10 min avant de compter à dégrader NET

La réalisation d&#39;un test d&#39;adhésion statique avec des filets nécessite revêtement adéquat des puits avec une monocouche de NET avant l&#39;addition des cellules cancéreuses (Figure 1). Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées avec soin de ne pas perturber cette couche. Lorsque une couche suffisante de NET est formé, on se attend à voir significative cellules cancéreuses adhérence aux filets comme on le voit dans la figure 2A et 2C. Cet effet est suppr...

Dans le protocole suivant, nous décrivons une façon très simple d&#39;isoler les pièges neutrophiles extracellulaires (EVF) de sang total humain en utilisant des réactifs facilement disponibles. Nous montrons ensuite comment les EVF isolées peuvent être utilisées dans un essai in vitro de l&#39;adhésion avec les cellules cancéreuses.

Simplifié droits de neutrophiles extracellulaires Piège (NET) Isolement et Manipulation

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de démontrer un protocole simple permettant d'isoler des pièges extracellulaires de neutrophiles, ou NET, à partir de sang total humain en utilisant des réactifs facilement accessibles. Cette procédure consiste d'abord à isoler les neutrophiles à partir de sang total humain, puis, dans une deuxième étape, à utiliser une technique de centrifugation différentielle. Les neutrophiles isolés sont stimulés par le PMA afin d'induire la formation de NET, également appelée NETose.Ensuite, une plaque est préparée avec un isolat de filet acellulaire et des cellules cancéreuses sont ajoutées afin de démontrer comment les filets influencent l'adhésion des cellules. Les résultats montrent que l'ajout d'une monocouche de filets améliore l'adhésion des cellules cancéreuses 5 49 et que cette adhérence est réduite lorsque les filets sont dégradés. L'utilisation de DNAS permet une démonstration visuelle essentielle de cette méthode.Étant donné le caractère novateur de cette technique, la manipulation des neutrophiles ou des pièges cellulaires, qui sont des réseaux extrêmement fragiles, est particulièrement délicate. Commencez par obtenir 80 millilitres

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Neutrophiles pièges extracellulaires (NET) sont un important mécanisme immunitaire inné pour combattre les bactéries pathogènes, champignons et parasites. Nous décrivons ici les méthodes d'isoler granulocytes neutrophiles dans le sang humain et de les activer pour former NET. Nous présentons les techniques de préparation de visualiser NET en microscopie optique et électronique.

Neutrophiles pièges extracellulaires: Comment générer et de les visualiser

Cette vidéo présente une technique in vitro pour générer et isoler des pièges extracellulaires neutrophiles (TNE). Les neutrophiles sont isolés du sang périphérique et stimulés avec de l’acétate de myristate de phorbol (PMA) pour produire des TNE. Au cours de l’incubation, les neutrophiles subissent un processus de mort cellulaire (NETosis) pour libérer des TNE composées de chromatine décondensée mélangée à des protéines cytoplasmiques granulaires.

Une technique in vitro pour générer des pièges extracellulaires de neutrophiles humains

Cette vidéo montre l’induction et la visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles ou TNE dans des neutrophiles pré-marqués à l’aide de sérum de patient contenant des anticorps cytoplasmiques anti-neutrophiles. De plus, l’utilisation d’un colorant d’ADN imperméable et la microscopie à fluorescence permettent de visualiser les TNE.

Induction et visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles dans des neutrophiles pré-marqués

Nous présentons ici une méthode dans laquelle neutrophiles humains de faible densités (LDN), récupérés du liquide de lavage péritonéal postopératoire, produisent massives pièges extracellulaires neutrophiles (filets) et efficacement emprisonnent quelques cellules tumorales gratuit qui poussent par la suite.

Neutrophiles pièges extracellulaires générées par les neutrophiles faible densité obtient du liquide de Lavage péritonéal médiat attachement et la croissance des cellules tumorales

Ici, nous présentons un protocole pour générer des pièges extracellulaires neutrophiles (NET) et l'exploitation de NETQUANT, une option logicielle entièrement automatique pour la quantification des NET dans les images d'immunofluorescence.

Quantification automatisée basée sur l'image des pièges extracellulaires neutrophiles à l'aide de NETQUANT

Ce protocole décrit un dosage très sensible et très haut débit de neutrophiles piège extracellulaire (NET) pour la quantification semi-automatisé des ex vivo NET formation par microscopie confocale tridimensionnelle par immunofluorescence. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer la formation nette et dégradation après différents stimuli et peut être utilisé pour l’étude des thérapies potentielles axés sur le NET.

Un test haut débit pour évaluer et quantifier les neutrophiles piège extracellulaire Formation

Les pièges extracellulaires de Neutrophile (NET) sont des structures tridimensionnelles produites par les granulocytes neutrophiles stimulés. Il est devenu clair ces dernières années que les ENe sont impliqués dans une grande variété de maladies. La détection des EAE dans les tissus peut avoir une pertinence diagnostique, de sorte que des protocoles normalisés pour l'étiquetage des composants NET sont nécessaires.

Immunofluorescence Étiquetage des pièges extracellulaires de l'homme et de la murine Neutrophil dans les tissus paraffins

Un protocole pour l’induction et l’analyse de pièges extracellulaires (TNE) in vitro est présenté. La quantification de l’ADN, de la cathélicidine (LL37) et de l’activité enzymatique a fourni des données qui montrent la variabilité de la composition et de la morphologie des TNE induites par des stimuli microbiens et chimiques dans des conditions contrôlées similaires.

Analyse morphologique et compositionnelle des pièges extracellulaires neutrophiles induits par des stimuli microbiens et chimiques

Cette recherche décrit deux techniques pour isoler les pièges extracellulaires neutrophiles abondants (TNE) de la moelle osseuse du rat. Une méthode combine un kit d’isolement des neutrophiles commercial avec une centrifugation à gradient de densité, tandis que l’autre utilise uniquement la centrifugation à gradient de densité. Les deux approches produisent des TNE fonctionnelles surpassant celles des neutrophiles du sang périphérique.

Approche unique pour isoler les neutrophiles de la moelle osseuse du rat avec une capacité comparable

Nous présentons une méthode automatisée à haut débit pour quantifier les pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles en utilisant le système d’analyse de cellules vivantes, couplée à une approche à double colorant dépendant de la perméabilité membranaire.

Technique à haut débit en temps réel pour quantifier la formation de pièges extracellulaires à neutrophiles dans les neutrophiles humains

Ce protocole définit une approche de microscopie à haut débit en temps réel pour visualiser et quantifier la libération de pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles humains in vitro. La méthode reproductible permet d’étudier les caractéristiques et la cinétique de la libération de TNE lors de la stimulation avec des inducteurs de NETosis distincts et permet d’évaluer la pharmacologie des antagonistes de NETosis.

Quantification microscopique en temps réel et à haut débit de la libération de pièges extracellulaires de neutrophiles humains et évaluation de la pharmacologie des antagonistes

Apprenez à isoler les pièges extracellulaires de neutrophiles (NETs) à partir de sang humain total. Cette méthode simple utilise une centrifugation différentielle et la stimulation au PMA pour étudier l'adhésion des cellules cancéreuses.

Simplifié droits de neutrophiles extracellulaires Piège (NET) Isolement et Manipulation

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