Simplifié droits de neutrophiles extracellulaires Piège (NET) Isolement et Manipulation

L’objectif général de l’expérience suivante est de démontrer un protocole simple pour isoler les neutrophiles, les pièges extracellulaires ou les filets du sang total humain à l’aide de réactifs facilement disponibles. Ceci est réalisé en isolant d’abord les neutrophiles du sang total humain, en utilisant une technique de centrifugation différentielle dans un deuxième temps. Les neutrophiles isolés sont stimulés par la PMA pour induire la formation de filets, également appelée NETosis.

Ensuite, une plaque est préparée avec un isolat de filet acellulaire et des cellules cancéreuses sont ajoutées pour démontrer comment les filets affectent l’adhésion des cellules. Les résultats montrent que l’ajout d’une monocouche de filet améliore l’adhésion d’un 5 49 cellules cancéreuses et que cette adhésion est réduite lorsque les réseaux sont dégradés. L’utilisation de DNAS One Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle.

Compte tenu de la nouveauté de cette technique, la manipulation des pièges cellulaires xor neutrophiles est extrêmement difficile en raison de la fragilité de ces structures. Pour commencer, obtenez 80 millilitres de sang total humain frais dans 14 tubes supérieurs verts héparinisés, comme décrit dans le protocole de texte. Ouvrez chaque tube et ajoutez cinq millilitres de PBS sans calcium ni magnésium dans chaque tube.

Ensuite, ajoutez 15 millilitres de milieu de séparation des lymphocytes ou LSM dans chacun des quatre tubes coniques de 50 millilitres à température ambiante. Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 18 montée sur une seringue de 60 millilitres pour superposer soigneusement le sang dilué sur le LSM, créant une interface sanguine LSM tranchante, centrifugez les tubes à 800 fois G pendant 30 minutes à 21 degrés Celsius sans casser pour arrêter la centrifugeuse, aspirez et jetez soigneusement les deux couches supérieures de liquide et l’interface entre elles, ne laissant que la couche rouge inférieure. Cette pastille contient des érythrocytes et des neutrophiles.

Ajoutez 20 millilitres de PBS et 20 millilitres de solution de dextran à 6 % dans chaque tube. Retournez doucement chaque tube et laissez-les reposer à température ambiante pendant 30 minutes. Les globules rouges vont se sédimenter au fond du tube.

Ensuite, transférez les surnageants dans des tubes frais et jetez les palettes. Centrifugez les surnageants à 450 fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, puis jetez le surnageant, laissant la pastille riche en neutrophiles. Préparez une solution de lyse avec 0,5 millilitres de tampon de lyse dans 4,5 millilitres d’eau stérile.

Ajoutez un total de cinq millilitres de solution de lyse dans chaque tube et regroupez toutes les pastilles dans un seul flacon. Placez le flacon dans l’obscurité pendant 10 minutes à température ambiante pour époux des globules rouges restants. Centrifugez les neutrophiles à 450 fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Jetez le surnageant et lavez la pastille avec cinq millilitres de PBS sans calcium ni magnésium. Ensuite, centrifugez à nouveau l’échantillon à 450 fois G à quatre degrés Celsius et retirez le surnageant contenant la solution de lyse restante. Remettez le culot de neutrophiles en suspension dans 30 millilitres de milieu RPMI froid complété par 3 % de sérum bovin fœtal, et placez le tube sur de la glace pour stimuler la formation de pièges ou de filets extracellulaires pour neutrophiles.

Ajoutez 500 nanomolaires de PMA à 30 litres de suspension de neutrophiles dans une boîte de culture de tissus plats de 150 millimètres sur 25 millimètres. Avec une grille de 20 millimètres, incubez les cellules pendant quatre heures à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone. Après l’incubation, aspirez doucement et jetez le milieu en prenant soin de ne pas perturber la couche de filets et les neutrophiles adhèrent au fond du plat.

Ensuite, utilisez une pipette pour laver le fond de chaque plat avec 15 millilitres de PBS froid sans calcium ni magnésium, tout le matériau adhérent doit être retiré du fond. Recueillir la suspension de lavage dans un tube conique de 15 millilitres, puis centrifuger à 450 fois G pendant 10 minutes. À quatre degrés Celsius, les neutrophiles et toutes les cellules restantes s’agglomérent au fond.

En laissant un surnageant riche en filet sans cellules, décantez ensuite le surnageant dans plusieurs tubes de 1,5 millilitre et centrifugez-le à huit 18 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Pour granuler l’ADN, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans le PBS de sorte que la concentration corresponde à deux fois 10 à 10 neutrophiles septiles pour 100 microlitres de PBS. Ce stock net acellulaire peut être utilisé pour des expériences ultérieures.

Mesurez la concentration d’ADN de l’échantillon à l’aide de la spectrophotométrie. Une concentration adéquate doit se situer entre 140 et 180 nanogrammes par microlitre à 100 microlitres de stock net dans chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits et incuber la plaque pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pour recouvrir les puits 12 à 20 heures plus tard, utiliser un microscope pour vérifier la formation d’une monocouche uniforme de filets acellulaires au fond des puits. Une fois que la monocouche a été vérifiée, aspirez doucement tout matériau non adhérent hors des puits.

Veillez à ne pas perturber la monocouche en bas. C’est l’aspect le plus difficile de cette procédure. Afin de maintenir une monocouche de filet adéquate, vous devez manipuler la plaque avec beaucoup de soin.

Ajoutez lentement tous les réactifs et les cellules sur le côté des puits, aspirez très doucement et évitez de toucher le fond du puits avec une ventouse. Une fois le matériau non adhérent éliminé, ajoutez doucement 100 microlitres d’une solution bloquant l’albumine sérique bovine à 1 % dans chaque puits et laissez reposer une heure à température ambiante. N’agitez pas et ne secouez pas la plaque car cela pourrait perturber la couche mono du filet.

Ensuite, préparez un 5 49 cellules cancéreuses en les récoltant lorsqu’elles sont confluentes à 70 à 80 %. À l’aide de techniques standard, remettre les cellules en suspension dans le milieu à une concentration de deux fois 10 à la quatrième cellules par 100 microlitres. Teintez les cellules en ajoutant un microlitre de CFS e par millilitre de milieu, et laissez-les à température ambiante pendant 10 minutes.

Ensuite, centrifugez les cellules à 450 fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans le volume initial de milieu pour maintenir une concentration de deux fois 10 à quatre cellules cancéreuses pour 100 microlitres de milieu. Prenez la plaque revêtue du filet et aspirez doucement la solution de blocage.

Ajoutez ensuite 100 microlitres de suspension de cellules cancéreuses dans chaque puits et laissez les cellules adhérer à la plaque pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, aspirez complètement le liquide et ajoutez 1000 unités d’ADN, une à certains puits pendant 10 minutes pour dégrader les filets dans d’autres puits. Ajouter 100 microlitres d’eau stérile par puits pendant 10 minutes comme contrôle du véhicule. Ensuite, aspirez doucement le liquide de chaque puits et lavez-le avec 100 microlitres de PBS pour éliminer tout non-adhérent.

5 49 cellules aspirent et jettent toute la solution dans les puits, ne laissant que les filets et les cellules cancéreuses adhérentes au fond. Ajoutez ensuite 100 microlitres d’une solution de formaldéhyde à 4 % par puits pour fixer les cellules, transférez immédiatement la plaque dans un microscope à fluorescence pour lire le dosage, puis tracez et analysez les résultats. Utilisation du logiciel d’analyse de données.

Des moustiquaires acellulaires ont été utilisées dans des tests d’adhésion statique avec 5 49 cellules cancéreuses. La microscopie optique a montré que les cellules cancéreuses adhèrent fortement à la monocouche nette. In vitro.

Cette adhérence a diminué après que la monocouche nette a été dégradée par l’ADN, une microscopie à fluorescence de 5 49 cellules cancéreuses marquées a confirmé ces résultats. La liaison d’une cellule de 5 49 à la monocouche nette a été quantifiée en comptant le nombre de cellules par champ de haute puissance. Comme le montre ici, il n’y a pas eu de changement dans l’adhésion des cellules cancéreuses aux moustiquaires dans la commande du véhicule.

Cependant, il y a eu une diminution significative de l’adhésion des cellules cancéreuses aux tne en présence de l’ADN un. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’isoler et de manipuler les moustiquaires à partir de sang humain total. Ces isolats de filet acellulaire peuvent ensuite être utilisés dans diverses techniques, notamment l’immunofluorescence, la microscopie confocale, la microscopie électronique et le western blot.