Production, la caractérisation et utilisations potentielles d'un humain de l'oesophage muqueux modèle 3D de l'ingénierie tissulaire

L’objectif global de cette procédure est de produire un modèle 3D d’ingénierie tissulaire de l’épithélium œsophagien humain pour l’utiliser comme plate-forme expérimentale. Ceci est accompli en isolant d’abord les fibroblastes et les cellules épithéliales de l’œsophage humain normaux à partir d’échantillons de tissu œsophagien humain. Dans la deuxième étape, les fibroblastes sont ensemencés sur un échafaudage œsophagien acellulaire épithélial, un signe de pores, un échafaudage œsophagien et cultivés pendant sept jours.

Ensuite, l’échafaudage est inversé et les cellules épithéliales œsophagiennes humaines isolées sont ajoutées à la culture pendant quatre jours. Dans la dernière étape, le modèle est déplacé à l’interface air-liquide pour cinq jours supplémentaires de culture, ce qui permet à un épithélium stratifié mature de se développer. En fin de compte, l’immunohistochimie est utilisée pour caractériser les marqueurs clés de la prolifération et de la différenciation exprimés par les cellules épithéliales modèles.

Le principal avantage de cette technique par rapport à la culture cellulaire 2D conventionnelle est qu’elle permet aux cellules d’avoir les interactions cellulaires, cellulaires et matricielles qu’elles auraient in vivo. Et en utilisant cette technique, nous pouvons produire un épithélium squameux stratifié mature similaire à l’œsophage normal. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés pour trois raisons.

Premièrement, il peut être difficile de s’assurer que la majorité des cellules épithéliales ne se différencient pas avant d’être incluses dans l’échafaudage. Deuxièmement, il faut veiller à ce que l’interface air-liquide correcte soit fournie pendant la période de maturation de l’épithélium. Et troisièmement, il peut être difficile de maintenir la stabilité tout au long de la période de culture.

Pour isoler les cellules épithéliales de l’œsophage humain, placez le tissu de la muqueuse squameuse de l’œsophage récolté dans une boîte de Pétri stérile et utilisez un scalpel stérilisé à l’éthanol pour couper le tissu en bandes de 0,5 centimètre. Ensuite, incubez le tissu dans 0,1 % d’essai couvert à 37 degrés Celsius, en arrêtant la digestion après une heure avec cinq millilitres de FCS. Ensuite, en tenant les bandes avec une pince, grattez doucement la surface épithéliale avec la lame du scalpel pendant une à deux minutes par bande pour retirer les cellules épithéliales dans le milieu environnant lorsque toutes les bandes ont été grattées, transférez le milieu contenant les cellules épithéliales détachées dans un tube à centrifuger de 15 millilitres.

Après avoir fait tourner les cellules, jetez le séné et remettez la pastille en suspension dans 12 millilitres de milieu épithélial. Ensuite, jetez le milieu d’une culture de cellules entravées et utilisez une pipette stérile pour plaquer les cellules épithéliales sur les cellules nourricières afin d’isoler les fibroblastes œsophagiens humains. Transférez les bandes de tissu grattées dans une boîte de Pétri stérile, et enfin hachez le tissu avec le scalpel.

Digérez les morceaux dans 10 millilitres de collagénase à 0,5 %, une solution recouverte à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec une atmosphère humidifiée pendant la nuit. Le lendemain, transférez la digestion dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et faites tourner les cellules. Resus suspendant le palais dans 10 millilitres de milieu de culture de fibroblastes.

La culture en fiole T 75 dans un incubateur de culture cellulaire. Pour préparer les échafaudages œsophagiens de porc décellularisés, commencez par utiliser des ciseaux et une pince à épiler pour ouvrir un œsophage de porc longitudinalement. Ensuite, lavez l’œsophage dans un pot stérile de 180 millilitres contenant 100 millilitres de PBS stérile pendant 10 minutes en secouant doucement pour éliminer tous les débris de la journée pendant que le tissu est rincé.

Vaporisez une planche de dissection en liège avec de l’éthanol à 70 % lorsque le liège est sec dans l’œsophage sur la planche avec la muqueuse vers le haut. Maintenant, utilisez une pince à épiler stérile pour saisir la surface de la muqueuse à une extrémité de l’œsophage et retirez le tissu de la planche pour séparer la muqueuse de la sous-muqueuse sous-jacente. Ensuite, à l’aide d’une lame de scalpel stérile, disséquez l’œsophage longitudinalement le long de la lanar propria, en retirant les broches au fur et à mesure que la dissection progresse pour permettre à la muqueuse d’être soulevée.

Jetez la sous-muqueuse sous-jacente et utilisez un scalpel pour couper la muqueuse restante en morceaux de cinq centimètres carrés. Lavez les morceaux dans 150 millilitres de PBS stérile en les agitant doucement, comme cela vient d’être démontré. Après cinq minutes, transférez le tissu dans un pot de 180 millilitres contenant 150 millilitres d’une solution molaire de chlorure de sodium.

Complété par des antibiotiques à 37 degrés. Après 72 heures, transférez le tissu dans 150 millilitres de PBS stérile, à ce moment-là, l’épithélium aura commencé à se séparer visiblement du tissu sous-jacent. Utilisez une pince stérile et une lame de scalpel pour retirer l’épithélium qui se détache et placez le tissu restant dans un pot frais de 150 millilitres de PBS stérile avec trois lavages de cinq minutes avec une agitation douce, le tissu doit maintenant être stocké dans du glycérol pendant au moins quatre mois.

Pour stériliser complètement l’échafaudage, commencez la préparation du modèle de muqueuse œsophagienne en réhydratant des morceaux d’échafaudage porcin qui ont été stérilisés dans du glycérol pendant au moins quatre mois. Dans 100 millilitres de PBS stérile pour cinq agitations de 10 minutes. Remplacer le supinate par du PBS frais à chaque lavage.

Après la cinquième agitation, testez la stérilité de l’échafaudage avec une incubation d’une nuit dans 100 millilitres de DMEM à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, transférez les échafaudages dans des puits individuels d’une plaque sous-muqueuse à six puits, côté sous-muqueux vers le haut. Ensuite, placez un anneau stérile en acier inoxydable de qualité médicale au centre de chaque échafaudage et utilisez une pince stérile pour appuyer doucement sur les anneaux afin d’assurer une étanchéité adéquate avec le tissu à cinq reprises.

Centrez les cinq fibroblastes œsophagiens humains dans 0,2 millilitre de fibroblastes au centre de chaque anneau. Ensuite, inondez la zone autour de l’extérieur de l’anneau avec au moins deux millilitres supplémentaires de fibroblastes et incubez les échafaudages dans un incubateur de culture cellulaire. Après 24 heures, retirez les anneaux et remplacez le milieu dans chaque puits par au moins cinq millilitres de fibroblastes frais.

Medium, en veillant à ce que les échafaudages soient totalement immergés. Après une semaine, jetez le milieu et utilisez une pince pour inverser la surface de la muqueuse de l’échafaudage vers le haut. Replacez les anneaux sur les échafaudages, puis ajoutez une fois le centre des six cellules épithéliales dans 0,2 millilitre de milieu composite, un au centre de chaque anneau.

Bouchez la zone à l’extérieur de l’anneau avec environ deux millilitres de milieu composite et remettez les constructions dans l’incubateur. Après 24 heures, retirez les anneaux et remplacez le milieu dans chaque puits par au moins cinq millilitres de milieu composite frais, un, en vous assurant que les échafaudages sont complètement immergés. Après 24 heures supplémentaires, remplacez le milieu par au moins cinq millilitres de milieu composite. Deux.

Le quatrième jour, placez des grilles stériles en acier inoxydable de qualité médicale dans les puits d’une nouvelle plaque à six puits et transférez les constructions sur les grilles côté muqueuse vers le haut. Enfin, ajoutez suffisamment de milieu composite pour atteindre la face inférieure du composite tout en laissant la surface exposée à l’air, en veillant à ce que l’échantillon soit maintenu à une interface air-liquide. La partie la plus délicate de la procédure est la mise en place de l’interface air-liquide.

S’il n’est pas clair si la grille est liquide, mettez en contact un tuyau stérile, car il est plus facile de voir si le tuyau est immergé. Alternativement, vous pouvez essayer de balancer doucement la plaque car il est plus facile de voir le liquide lorsqu’il se déplace et vérifiez qu’il y a du liquide sur la grille et ne couvrant pas votre échantillon. Ceci, l’évaluation logique de l’épithélium présente un épithélium squameux stratifié multicouche mature, similaire mais plus mince à celui observé avec l’œsophage humain normal, les cellules devenant progressivement plus plates et finalement nucléaires à mesure qu’elles migrent vers la surface.

La caractérisation immunohistochimique des marqueurs clés de la prolifération et de la différenciation démontre que la microanatomie de l’épithélium modèle est similaire à celle de l’épithélium œsophagien humain normal. Par exemple, une expression comparable de la cytokératine 14 est observée à la fois dans l’œsophage natif et dans l’épithélium modèle, la coloration étant limitée aux cellules de la couche basale. Ce modèle a été modifié avec succès pour incorporer des cellules tumorales en remplaçant les cellules épithéliales primaires par des cellules de carcinome, démontrant ainsi la flexibilité du modèle.

Par exemple, les cellules du carcinome épidermoïde produisent un épithélium visible sur la construction comme une région jaune définie avec de grandes fentes à l’intérieur de l’épithélium, reflétant probablement la présence de molécules de cellia dysfonctionnelles, y compris des cellules d’adénocarcinome de l’œsophage dans le modèle, ce qui entraîne une grande quantité de dégradation de l’échafaudage visible à l’œil nu comme un amincissement de l’échafaudage. Après deux semaines de croissance à l’interface air-liquide et confirmée par l’analyse h et e comme une réduction évidente de l’épaisseur de l’échafaudage dans la région située sous les cellules. Suite à cette procédure, d’autres méthodes d’expression génique comme le transfert nord ou ouest peuvent être appliquées au même tissu pour répondre à des questions telles que, Comment l’épithélium réagit-il aux stress environnementaux ? Il s’agit donc d’une ressource très précieuse pour approfondir davantage de questions après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs intéressés par la métaplasie de Barrett pour étudier l’effet de l’exposition à des composants spécifiques du reflux sur l’expression génique dans l’œsophage humain normal.