Name: Une méthode enzymatique pour secourir Cellules souches mésenchymateuses à partir déchantillons coagulés moelle osseuse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Découvrez une méthode enzymatique pour isoler des cellules souches mésenchymateuses à partir d'échantillons de moelle osseuse coagulés en utilisant l'urokinase. Cette technique rapide et économique permet de récupérer des cellules précieuses sans nouvel échantillonnage.

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Ce travail a été soutenu par le Fonds national suisse Grant CR3I3_140717/1 et la Fondation suisse pour paraplégiques.

REMARQUE: ponctions de moelle osseuse humaines de la crête iliaque ont été recueillies de consentir donateurs avec l&#39;approbation du comité d&#39;éthique du canton de Lucerne. Aspirats de moelle osseuse Canine de la crête iliaque ont été recueillies avec consent.Human de propriétaire de chien (env. 20 ml) et canin (env. 10 ml) aspirats de moelle osseuse étaient anti-coagulé par addition de 15 ml de citrate de sodium à 3,8% immédiatement après le retrait dans la salle d&#39;opération. Les échantillons ont été transférés à l&#39;environnement du laboratoire de traitement du même jour comme retirée. 1. Préparation de Urokinase (Avant le 1 er Utilisations) <ol><li> Reconstituer l&#39;urokinase en utilisant une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) selon les instructions du fabricant: Ajouter 10 ml de PBS dans le ballon de septum d&#39;entrée en utilisant une seringue de 10 ml. Dissoudre la substance sèche en agitant pour obtenir 50 000 unités d&#39;injection (U) par ml. </li><li> Préparer des aliquots de 500 ul (25,000) dans chaque U sterile tubes. aliquotes de magasins -20 ° C et l&#39;utiliser en cas de besoin pendant au moins six mois. </li></ol> 2. préparatives étapes (Avant chaque os traitement moelle) <ol><li> Décongeler une aliquote de l&#39;urokinase (25.000 U) coagulé par aspiration de moelle osseuse (volumes aspirés jusqu&#39;à 25 ml ont été traités avec succès en utilisant une seule portion aliquote de 25 000 U). </li><li> Préchauffer un bain d&#39;eau ou incubateur agitateur à 37 ° C. </li></ol> 3. digestion enzymatique du Clot <ol><li> Effectuer tous les travaux dans un biosécurité de flux laminaire armoire pour éviter la contamination microbienne des échantillons de moelle osseuse au cours du traitement. Lorsque vous travaillez avec des matières potentiellement infectieuses humaine, l&#39;utilisation de gants de protection ainsi que manipulation prudente est conseillée. </li><li> Placer un tamis de 100 um de la cellule au-dessus d&#39;un tube de 50 ml stérile. Versez délicatement la ponction de moelle osseuse à travers le tamis de la cellule, en inclinant la crépine ou déplacer le matériel d&#39;un caillot. Utiliser un embout de pipette stérile pourune meilleure circulation à travers les mailles du filtre. REMARQUE: éviter toute dilution du caillot, par exemple, en lavant le caillot avec du PBS. Urokinase agit indirectement et nécessite des composants du sérum (ie., Plasminogène) de la biopsie pour condensé efficace. Tout en continuant l&#39;opération avec le matériau de caillot, le filtrat peut être conservé à température ambiante jusqu&#39;à utilisation ultérieure dans l&#39;étape 3.6. </li><li> Transférer le matériel de caillots de moelle osseuse dans une boîte de culture de cellule vide aide de pinces stériles. Couper les débris en petits morceaux d&#39;environ 2 mm 3 à l&#39;aide d&#39;un scalpel stérile. </li><li> Transférer les petits morceaux de caillot dans un tube à réaction de 50 ml à l&#39;aide des pinces stériles. Veiller à ce que le caillot hachée a un aspect mouillé. Se il semble être sec, utiliser une partie du filtrat de l&#39;étape 3.1 pour humidifier. </li><li> Triturer le caillot par aspiration et pendant 5 fois en utilisant 5 ml microtitrage pipette. Ajouter une fraction aliquote de l&#39;échantillon d&#39;urokinase. Incuber pendant 30 min à 37 ° C soit dans un bain d&#39;eau ou dansune agitation (doucement) incubateur. </li><li> Triturer par pipetage de haut en bas pour les cinq fois à l&#39;aide d&#39;une pipette 5 ml. Effectuez cette étape dans une enceinte de sécurité biologique. Incuber pendant 30 minutes à 37 ° C. Après l&#39;incubation, triturer encore 5 fois à l&#39;aide d&#39;une pipette de 5 ml. Passez votre souris sur un nouveau 100 um tamis cellulaire de mettre en commun avec le filtrat de l&#39;étape 3.2. </li><li> Centrifuger la suspension de cellules à température ambiante pendant 10 min à 500 x g. Jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un milieu tel que décrit ci-dessous ou selon le mode opératoire standard de votre laboratoire pour la culture d&#39;extension MSC. </li></ol> 4. Le classement pour Expansion Culture cellulaire et UFC Plaques <ol><li> Remettre en suspension les cellules (comprenant des érythrocytes et des cellules mononucléées) dans 50 ml de milieu de base: Alpha-MEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine et 2,5 mg / ml d&#39;amphotéricine B . Compter les cellules 01h10 dilué dans une solution bleu Trypan utilisant une chambe Neubauerr. </li><li> Plaque les cellules dans des flacons de culture de cellules à une densité de 5 x 10 7 cellules / cm 2 et incuber dans un incubateur humidifié à 37 ° C. Si possible, utilisez hypoxiques (5% d&#39;oxygène). Pour le contrôle de dosage CFU, plaque 10 9 cellules dans une boîte de culture cellulaire de 10 cm de diamètre. </li><li> Après 3 jours de culture, les cellules souches mésenchymateuses sont attachés à la boîte de culture de cellules alors que les autres cellules restent en suspension. Changer les médias avec le milieu de base supplémenté avec 5 ng / ml de facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF). Pour le contrôle de dosage CFU, traiter la boîte de culture cellulaire de même. </li><li> Continuer culture cellulaire pour un total de deux semaines, l&#39;échange de médias trois fois par semaine. Si les cellules dépassent 80% de confluence, diviser par trypsinisation. Pour le contrôle de dosage CFU, échanger les médias de même, mais ne pas diviser les cellules pour le cours des deux semaines. </li></ol> 5. Giemsa pour le dosage CFU <ol><li> Préparer 10 ml de solution par Giemsa-plat: dilute la solution mère (7,6 g / l dans le glycérol Giemsa: méthanol) 1h10 dans l&#39;eau stérile (toujours préparer une dilution de travail frais). </li><li> Retirez le support de la boîte de culture cellulaire et laver les cellules avec du PBS. Soyez très précautionneux lors de l&#39;application liquide à la boîte de Pétri et éviter de laver hors des cellules. </li><li> Fixer les cellules dans du méthanol pur pendant 5 min à température ambiante. Jeter le méthanol. Ajouter la solution Giemsa et incuber pendant 60 min dans un incubateur humidifié à 37 ° C. </li><li> Laver deux fois avec du PBS. Air sécher la tête de la première plaque sur une serviette en papier. Compter les colonies manuellement. Ceci se fait à l&#39;aide d&#39;un marqueur sur le dos de la plaque. </li></ol> 6. MSC Différenciation <ol><li> La différenciation des cellules souches mésenchymateuses Canine REMARQUE: MSC Canine ont été différenciées en chondrogène, ostéogénique et lignées adipogéniques par stimulation avec le support approprié pour quatre semaines. </li><li> Pour La différenciation adipocytaire, MSC de culture en monocouche à 4 x 10 5 CELLS / cm 2 en alternance deux conditions de culture différentes de la manière suivante; <ol><li> Culture dans un milieu d&#39;entretien contenant de l&#39;adipogenèse DMEM + GlutaMAX, 3% de FBS, 100 unités / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine, 2,5 pg / ml d&#39;amphotéricine B et 170 mM d&#39;insuline. </li><li> Culture dans l&#39;adipogenèse médias induire avec du milieu de maintenance additionné de 3% de FBS, sérum de lapin à 5%, 1 uM de dexaméthasone, 500 uM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine, 33 uM de biotine, 5 uM et 17 uM de rosiglitazone 16 pantothenate. </li><li> Revel les gouttelettes lipidiques par coloration avec Oil Red-O. En bref, fixer les cellules avec 10% de formaldéhyde, laver avec du PBS et tacher avec O rouge 0,35% d&#39;huile dans de l&#39;isopropanol. </li></ol></li><li> Pour la culture de la différenciation ostéogénique MSC en monocouche à 7 x 10 3 cellules / cm 2 et de stimuler dans ce qui suit: <ol><li> Avancée DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% de FBS, 100 unités / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine, 2,5 pg / ml d&#39;amphotéricine B, 501; M d&#39;acide L-ascorbique-2-phosphate, 10 mM de ß-glycerophosphate et 100 nM de dexaméthasone. </li><li> Identifier les dépôts de minéralisation de Von Kossa tache (5% AgNO 3). En bref, fixer les cellules avec 10% de formaldéhyde, laver avec du PBS et tache avec 5% AgNO 3 dans l&#39;eau distillée. </li></ol></li><li> Différenciation chondrogénique <ol><li> cubes coupées (3 mm de chaque côté) à partir d&#39;un dispositif médical en forme d&#39;éponge, constituées à partir lyophilisée de collagène de type I, et utilisés comme matériau d&#39;échafaudage pour soutenir 17 cellules. </li><li> MSC de semences sur le dessus des cubes à la concentration de 4 x 10 6 cellules / ml (~ 70 000 cellules / cube). </li><li> Avant l&#39;addition de médias, permettent aux cellules d&#39;adhérer aux cubes pendant 30 min. </li><li> Maintenir constructions MSC-collagène dans des milieux chondrogénique constitué de DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% de FBS, 100 unités / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine, 2,5 pg / ml d&#39;amphotéricine B, 40 ng / dexaméthasone ml, 50 pg / ascorbique ml acide 2-phosphate,50 ug / ml de L-proline, 1x insuline-transferrine-sélénium X, et 10 ng / ml de facteur de croissance transformant-β1. </li><li> Utilisez coloration au bleu alcian pour visualiser l&#39;accumulation des protéoglycanes dans les sections de constructions. Brièvement, tacher les sections O / N avec 0,4% de bleu alcian dissous dans 0,01% de H 2 SO 4 et 0,5 M de chlorhydrate de guanidine. Ensuite, laver les coupes ont été lavées pendant 30 min dans 40% de DMSO et 0,05 M MgCl 2. Les cellules ont été contre-rouge nucléaire rapide. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Régulièrement on échantillonne moelle osseuse tandis que le patient subit une intervention chirurgicale (dans notre cas de chirurgie principalement la colonne vertébrale), avec l&#39;avantage que seul le travail peu supplémentaire doit être effectué par le personnel de la salle d&#39;opération. Même si les échantillons sont mélangés avec du citrate de sodium immédiatement après le retrait, de nombreux échantillons ont été partiellement coagulé quand ils sont arrivés dans le laboratoire pour le traitement. A ce stade, le...

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) jouent un rôle majeur dans la médecine régénérative et de l&#39;ingénierie tissulaire. Ils peuvent migrer, se différencier en différents types de cellules et une greffer, ce qui les rend idéales pour les candidats thérapies autologues 2,3. Dernièrement, des essais cliniques utilisant MSC pour les os et la réparation du cartilage, maladie du greffon contre l&#39;hôte ou une maladie cardiaque ont été lancés 4. Ces cellules souches mésenchymateuses peuvent être récoltées à partir du tissu du cordon ombilical ou adipeux, mais les résultats les plus prometteurs ont été obtenus à partir de la moelle osseuse les cellules souches dérivées 5. La crête iliaque permet de recueillir une quantité considérable de la moelle osseuse et sert donc de site principal d&#39;aspiration 6. Cependant, la qualité de l&#39;aspiration diminue avec l&#39;augmentation du volume de la moelle osseuse retirée. Alors que les cinq premiers ml de ponction de la moelle osseuse contiennent MSC de haute qualité, le retrait de volumes plus importants conduit à une dilution de l&#39;aspiration avec sang périphérique fepuis l&#39;os très vascularisé 7. En raison de la présente des mégacaryocytes et des plaquettes, des aspirats de moelle osseuse sont sujettes à la coagulation, à moins que les anticoagulants sont utilisés. Mais même avec des anticoagulants, des caillots peuvent se produire. Dans la moelle osseuse, cellules souches mésenchymateuses ne représentent qu&#39;une faible proportion de la piscine total de cellules 8 et doivent être multipliées en culture pour la plupart ingénierie tissulaire ou quatre applications thérapeutiques. La qualité d&#39;une telle culture dépend largement de la piscine de la cellule initiale, ce est à dire., La diversité et une grande départ numéro 9. De faibles effectifs d&#39;MSC de retraits peuvent se expliquer en partie par la variabilité des bailleurs de fonds. D&#39;autre part, les CSM à partir d&#39;échantillons de faible qualité nécessitent plus de temps dans la culture et repiquage prolongé pour atteindre le nombre souhaité de cellules. Dans les deux cas, des passages est une source étendue de la sénescence cellulaire et peut conduire à la perte de potentiel de 10 différenciation. Par conséquent, les protocoles qui peuvent maximiser cellulaire y optimiséield et prévenir des effets néfastes doivent être développés 11,12. Lorsque nous avons commencé à travailler avec MSC canines, nous avons été étonnés de voir que les échantillons de moelle osseuse canines environ trois sur quatre contenaient des caillots, tandis que les échantillons humains heureusement coagulé (un sur dix) ont été moins fréquentes. D&#39;autre part, il ne est pas surprenant, que nous avons observé des rendements beaucoup plus faibles de MSC à partir d&#39;échantillons coagulés. Pour résoudre le problème récurrent des échantillons coagulés, nous avons développé le protocole utilisant l&#39;urokinase de drogue thrombolytique lieu de rééchantillonnage. Thérapies thrombolytiques peuvent contrecarrer les situations de la vie en danger, comme l&#39;occlusion des vaisseaux sanguins provoquant une crise cardiaque, accident vasculaire cérébral ou embolie raison de coagulation non désirée. Ils fonctionnent par la dégradation des caillots par clivage enzymatique par la plasmine de la fibrine et du plasminogène activateurs enzymatiques. Malgré la large utilisation pour le traitement des patients, que très peu de publications existent que les activités thrombolytiques utiliséspour les applications de laboratoire pour sauver échantillons coagulés, en se concentrant principalement sur les lymphocytes. En 1987, Niku et al. décrit l&#39;utilisation de streptokinase pour dissoudre les caillots sanguins dans les lymphocytes fonctionnels résultant 13 et quatre ans plus tard, De Vis et al. étendu l&#39;utilisation de la streptokinase pour isoler les cellules leucémiques dans le sang et la moelle osseuse pour des applications de cytométrie en flux 14. Une publication plus récente suggère l&#39;utilisation de Alteplase pour le diagnostic de cancer 15. Tout en utilisant la même approche enzymatique, notre protocole met l&#39;accent sur l&#39;isolement des cellules souches mésenchymateuses multipotentes forme la moelle osseuse de fournir un outil pour les chercheurs dans le domaine des cellules souches.

<table><tbody><tr>Composants <td></td><td></td><td></td><td>moyens de base</td></tr><tr><td>PenStrep 100X</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha avec nucléoside, avec glutamine stable</td><td>Amimed</td><td>1-23S50-I</td><td></td></tr><tr><td>FBS Inactivé par la chaleur</td><td>Amimed</td><td>2-01F36-I</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Applichem</td><td>A1907</td><td></td></tr><tr><td>Milieu adipogène Composants</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HAM F12 + GlutaMAX</td><td>Amimed</td><td>1-26F09-I</td><td></td></tr><tr><td>Insuline&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de lapin</td><td>Gibco</td><td>16120099</td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Applichem</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-méthylxanthine</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Biotine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>Pantothénate&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>Huile Rouge-O&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Composants du milieu ostéogène Acide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbique 2-phosphate</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>&szlig ;-glycérophosphate</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate d’argent (AgNO3)</td><td>Sigma</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr>Composants <td></td><td></td><td></td>du<td>milieu chondrogène</td></tr><tr><td>Biopad - dispositif médical en forme d’éponge</td><td>Euroresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-proline&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td></td></tr><tr><td>Insuline-Transferrine-Sélénium X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance transformant humain-&beta ; 1&nbsp ;</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A3157</td><td></td></tr><tr><td>Nucléaire rapide rouge</td><td>Sigma</td><td>N8002</td><td></td></tr><tr><td>Générique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tri-Sodium citrate dihydrate</td><td>Applichem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Applichem</td><td>964.9100</td><td></td></tr><tr><td>Urokinase</td><td>Medac</td><td>1976826</td><td></td></tr><tr><td>0,5 % Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>coloration Giemsa</td><td>Applichem</td><td>A0885</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Applichem</td><td>A0877</td><td></td></tr><tr><td>Acide sulfurique (H2SO4)</td><td>Applichem</td><td>A0655</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Applichem</td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl2)</td><td>Applichem</td><td>A3618</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de guanidine</td><td>Applichem</td><td>A1499</td><td></td></tr><tr><td>Consommables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml tube de réaction</td><td>Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>seringue de 10 ml</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille stérilisante (22G)</td><td>Braun</td><td>4657624</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml Microtubes</td><td>Brunschwig</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu ; Filtre à cellules m</td><td>Falcon</td><td>6.05935</td><td></td></tr><tr><td>pince stérile</td><td>Bastos Viegas, SA</td><td>489-001</td><td></td></tr><tr><td>scalpel stérile</td><td>Braun</td><td>5518059</td><td></td></tr><tr><td>Primaria boîte à cuture cellulaire</td><td>Falcon</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>C-Chip Neubauer Improved</td><td>Bioswisstech</td><td>505050</td><td></td></tr> flacon de <tr><td>culture cellulaire - Flacon T300</td><td>TPP</td><td>90301</td><td></td></tr><tr><td>Equipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Armoire de biosécurité microbiologique classe II</td><td>Skan</td><td>82011500</td><td></td></tr><tr><td>bain-marie</td><td>Memmert</td><td>1305.0377</td><td></td></tr><tr><td>Stripettes Pipette sérologique 5ml</td><td>Corning</td><td>4487-200ea</td><td></td></tr><tr><td>microscope</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>incubateur humidifié Heracells 240</td><td>Thermo 51026331</td><td></td><td></td>scientifique</tr><tr><td>Heraeus Multifuge 1S-R</td><td>Thermo scientific</td><td>75004331</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode enzymatique pour secourir cellules souches mésenchymateuses à partir d&#39;échantillons coagulés moelle osseuse

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

<classe p='jove_content'>Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) - généralement obtenues à partir de moelle osseuse - nécessitent souvent une culture d’expansion. Notre protocole utilise l’urokinase de grade clinique pour dégrader les caillots dans la moelle osseuse et libérer les CSM pour une utilisation ultérieure. Ce protocole offre une alternative rapide et peu coûteuse au rééchantillonnage de la moelle osseuse. La moelle osseuse est une source majeure de CSM, qui sont intéressantes pour l’ingénierie tissulaire et les thérapies à base de cellules souches autologues. Lors du retrait, la moelle osseuse peut coaguler, car elle comprend tout le système hématopoïétique. Les caillots qui en résultent contiennent également des CSM qui sont perdues pour la culture d’expansion ou la thérapie directe par cellules souches. Nous avons constaté que 74 % des échantillons de moelle osseuse canine contenaient des caillots et produisaient moins de la moitié du nombre de cellules souches attendues des échantillons non coagulés. Ainsi, nous avons développé un protocole de digestion enzymatique de ces caillots afin d’éviter un rééchantillonnage de la moelle osseuse coûteux et intensif en main-d’œuvre. L’urokinase - un médicament thrombolytique cliniquement approuvé et facilement disponible - élimine presque complètement les caillots de la moelle osseuse. En conséquence, les ponctions de moelle osseuse traitées produisent un nombre similaire de CSM que d’échantillons non coagulés. De plus, après le traitement à l’urokinase, les cellules ont conservé leur activité métabolique et la capacité de se différencier en lignées chondrogéniques, ostéogéniques et adipogènes. Notre protocole récupère les échantillons de sang coagulé et de moelle osseuse sans affecter la qualité des cellules. Ce rééchantillonnage obsolète réduit considérablement les coûts d’échantillonnage et permet l’utilisation d’échantillons coagulés pour la recherche ou la thérapie.

Les faits que 74% des échantillons de moelle osseuse canins (n = 54) contenait des caillots quand ils sont arrivés dans notre laboratoire (figure 1A) ainsi diminué les rendements de MSC partir de ces échantillons, nous a fait croire qu&#39;un nombre considérable de MSC a été piégé dans les caillots . En effet, une simple DAPI-taches de matériau de caillot coupe confirme la présence de cellules nucléées à haute densité (figure 1B). Cela conduit finalement à un faible nombre de cellules s...

Les cellules souches mésenchymateuses sont généralement obtenues à partir de la moelle osseuse et nécessitent une culture d’expansion. Lorsque les échantillons coagulent avant d’être traités, un protocole utilisant le médicament thrombolytique (enzymatique) urokinase peut être appliqué pour dégrader le caillot. Ainsi, les cellules sont libérées et disponibles pour la culture d’expansion. Ce protocole offre une alternative rapide et peu coûteuse au rééchantillonnage.

Une méthode enzymatique pour secourir Cellules souches mésenchymateuses à partir d&#39;échantillons coagulés moelle osseuse

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser des échantillons de moelle osseuse coagulée en digérant les caillots à l'aide d'urokinase. Cela est réalisé en filtrant d'abord l'échantillon de moelle osseuse à travers un tamis cellulaire. Ensuite, le caillot de moelle osseuse est découpé en petits morceaux.Ensuite, le caillot est transféré dans un tube Falcon et digéré à l’aide d’urokinase. Enfin, le matériel de caillot digéré est ensemencé pour l’expansion de cellules souches mésenchymateuses ou MSC. En définitive, les plaques sont comparées à une plaque témoin à l’aide d’em sustain pour évaluer l’efficacité de la digestion.L'application de cette technique s'étend à la thérapie ou au diagnostic par cellules souches autologues. En effet, une greffe nécessite l'expansion et la différenciation d'un grand nombre de cellules souches. Nous avons eu l'idée de cette méthode en réalisant que de nombreux échantillons de moelle osseuse provenant du DOC étaient coagulés lorsqu'ils arrivaient dans notre laboratoire.Nous ne voulions simplement pas jeter d’aussi précieux échantillons pour reconstituer l’urokinase. Introduire 10 millilitres de PBS stérile dans le flacon d’entrée muni d’un septum et vortexer pour dissoudre jusqu’à une concentration de 50 000 unités par millilitre. Répartir 500 microlitres contenant chacun 25 000 unités en aliquotes dans des tubes stériles et conserver à moins 20 degrés Celsius pendant jusqu’à six mois afin de réaliser une réaction de digestion. Décongeler une aliquote d’urokinase par prélèvement de moelle osseuse trouble d’un volume allant jusqu’à 25 millilitres.Préchauffez un bain-marie ou un incubateur agité à 37 degrés Celsius sous une hotte de sécurité biologique à flux laminaire. En portant des gants, placez un tamis cellulaire de 100 micromètres au-dessus d'un tube de 50 millilitres. Versez délicatement l'aspirat de moelle osseuse à travers le tamis cellulaire, en inclinant le tamis ou en déplaçant les agrégats de caillot.Verser soigneusement l'aspirat de moelle osseuse à travers le filtre à cellules sans incliner le filtre ni déplacer le caillot. Utiliser une pipette stérile pour faciliter l'écoulement à travers la maille du filtre, à l'aide de pinces stériles. Transférer le caillot de moelle osseuse dans une boîte de culture cellulaire vide.Ensuite, utilisez un scalpel stérile pour couper les débris en morceaux de deux millimètres cubes. Puis, à l’aide d’une pipette microlitrique de cinq millilitres, triturez le caillot en aspirant et en expulsant cinq fois. Ajoutez ensuite un aliquot d’urokinase à l’échantillon et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un bain-marie ou un incubateur agité.Après l'incubation dans la hotte de sécurité, effectuez à nouveau une trituration et incubez pendant 30 minutes supplémentaires. Ensuite, triturez cinq fois de plus et faites passer l'échantillon à travers un nouveau filtre cellulaire de 100 micromètres, puis rassemblez-le avec le filtrat initial. Centrifugez la suspension cellulaire à 500 × g et à température ambiante pendant 10 minutes. Après avoir éliminé le surnageant, utilisez 50 millilitres de milieu basal pour resuspendre le culot.À l’aide de la solution bleue Trian, diluez un aliquot de cellules en suspension d’un facteur un à dix, puis ajoutez la suspension dans une chambre de Neubauer pour les compter. Après le comptage, semez les cellules dans des flacons de culture cellulaire à une densité de cinq fois 10 à la puissance sept cellules par centimètre cube pour la plaque témoin de l’essai CFU.10 à la puissance neuf cellules dans une boîte de culture cellulaire ronde de 10 centimètres de diamètre, incuber dans une enceinte humidifiée à 37 degrés Celsius. Après trois jours de culture, les CSM seront attachées à la boîte de culture tandis que les autres cellules resteront en suspension. Utiliser un milieu basal contenant cinq nanogrammes par millilitre de facteur de croissance des fibroblastes de base pour remplacer le milieu dans les plaques expérimentales et les plaques témoins.Poursuivre la culture pendant un total de deux semaines, en changeant le milieu trois fois par semaine. Si la confluence des cellules dépasse 80 %, trypsiner les cultures et les diviser pour réaliser le dosage de CFU.Préparez 10 millilitres de solution GSA par boîte en diluant la solution mère avec de l'eau stérile. Un à 10. Retirez le milieu du plat de culture cellulaire et utilisez du PBS pour laver soigneusement les cellules avec du méthanol pur.Fixer les cellules à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, éliminer le méthanol et ajouter la solution de gimsa. Incuber dans une chambre humide à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes après l'incubation.Utilisez du PBS pour laver les cellules deux fois. Ensuite, faites sécher la plaque à l'air. Placez-la d'abord sur une serviette en papier avec un marqueur au dos de la plaque.Compter manuellement les colonies pour la différenciation adipoïgène. Cultiver les CSM en couche unique à raison de quatre fois dix puissance cinq cellules par centimètre carré. Alterner entre deux conditions de culture différentes pour la première condition.Incubez les cellules dans un milieu de maintien de l'adipogenèse, et pour la deuxième condition, incubez les cellules dans un milieu d'induction de l'adipogenèse combiné au milieu de maintien selon les recettes décrites dans le protocole textuel. Pour visualiser les gouttelettes lipidiques, utilisez du formaldéhyde à 10 % pour fixer brièvement les cellules.Ensuite, lavez les cellules avec du PBS avant d'utiliser 0,35 % de rouge d'huile O dans l'isopropanol pour colorer les cellules destinées à la culture de différenciation ostéogénique des CSM en monocouche à raison de sept fois 10 des troisièmes cellules par centimètre carré. Après stimulation des cellules à l'aide du milieu décrit dans le protocole, fixez brièvement les cellules avec du formaldéhyde à 10 %. Une fois les cellules lavées au PBS, utilisez la solution de Von Kossa pour identifier les dépôts minéraux afin de réaliser la différenciation ostéogénique à partir d'un dispositif médical en forme d'éponge constitué de cubes de collagène de type I lyophilisés, mesurant trois millimètres de côté. Semez les CSM sur la surface des cubes à une concentration de quatre fois 10 à la puissance huit cellules par millilitre, après avoir laissé les cellules adhérer aux cubes pendant 30 minutes à température ambiante.Conserver les constructions de collagène MSC dans un milieu congénique comme indiqué dans le protocole. Ajouter une solution de Blue Ian à 0,4 % aux sections et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, utiliser du DMSO à 40 % et du chlorure de magnésium 0,05 molaire pour laver les cellules pendant 30 minutes, puis colorer les cellules en contre-teinte avec le rouge rapide de noyau comme illustré ici.Une section simple colorée à l’DAPI d’un matériau de caillot confirme la présence de cellules nucléées à forte densité, indiquant qu’un nombre considérable de CSM est piégé au sein des caillots. En utilisant le protocole décrit dans cette vidéo, un traitement par l’urokinase a permis la digestion de tout sauf 15 % en poids des caillots sanguins de chien et de 9 % en poids des caillots humains afin de déterminer l’efficacité de la digestion par l’urokinase. Les cellules provenant des filtrats d’échantillons coagulés et des caillots digérés ont été mises en sédimentation séparément puis incubées pendant deux semaines.La mise en culture des cellules a montré 3,8 fois plus de UFC provenant d'échantillons canins digérés à l'urokinase que des filtrats initiaux correspondants. Les échantillons digérés humains ont montré 1,6 fois plus d'UFC que les filtrats non digérés. Dans cette expérience, des CSM provenant de caillots de moelle osseuse ont été comparées à des CSM issues d'échantillons de moelle osseuse caillée de l'UNC quant à leur capacité à se différencier dans des conditions de culture appropriées.Après quatre semaines en culture, il était possible de différencier les CSM issues d'échantillons digérés en lignées adipoïgènes, ostéoïgènes et chondrogènes. De plus, les colorations à l'huile rouge de von Kossa, au rouge O et au bleu de Sian montrent qu'il n'existait aucune différence au niveau du degré de différenciation entre les groupes. Une fois maîtrisé, Mr.Nick peut être réalisé en environ une heure et demie s'il est effectué correctement.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des cellules souches hématopoïétiques pour une culture d'expansion, même si vos échantillons sont coagulés, au lieu de jeter l'échantillon. Notre protocole utilise l'enzyme kinase pour digérer le caillot et les cellules souches ES pour la culture d'expansion.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Rat MSC ont été isolés à partir des fémurs et tibias et ensuite enrichi par tri cellulaire magnétique. Cellules triées ont été confirmés pour l'expression des marqueurs de surface par cytométrie en flux. Ces cellules ont également été cultivées à une densité clonale pour former des colonies isolées et ensuite ces colonies ont été séparés par des cylindres de clonage.

L&#39;isolement et l&#39;enrichissement des cellules de rat souches mésenchymateuses (CSM) et de séparation des mono-colonie Dérivé MSC

Une méthode pour analyser la distribution des progéniteurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse par cytométrie en flux ainsi que d'isoler efficacement hautement purifiées de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est décrite. La procédure d'isolement est essentiellement basée sur l'enrichissement magnétique des cellules + c-kit et de tri cellulaire pour purifier CSH pour des études cellulaires et moléculaires.

Analyse phénotypique et isolement de cellules souches hématopoïétiques murines et Lineage-engagés progéniteurs

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont un potentiel de différenciation vers la lignée ostéoblastique lorsqu’elles sont stimulées par des facteurs solubles ou des biomatériaux spécifiques. Ce travail présente une nouvelle option pour l’administration de CSM à partir de la membrane amniotique humaine (AM-hMSC) qui utilise la matrice osseuse bovine Nukbone (NKB) comme échafaudage.

Isolement de mésenchymateuses humaines cellules souches et de leur culture sur la matrice osseuse poreuse

Culture de cellules humaines mésenchymateuses stromales (CSMh) avec du sérum autologue, réduit les risques de rejet par un matériau xénogénique et d'autres effets négatifs. Elle permet aussi la récupération d'un sous-ensemble de progéniteurs mésodermiques, qui peut délivrer CSMh frais. Incorporation CSMh dans un caillot de fibrine autologue permet une manipulation facile et l'implantation chirurgicale efficace.

Mésenchymateuses stromales Culture cellulaire et livraison dans des conditions autologues: Une approche intelligente pour les applications orthopédiques

Ce protocole illustre une procédure sûre et efficace pour modifier CD133+ des cellules souches hématopoïétiques. Présenté non-virale, magnétique polyplex approche fondée sur le peut fournir une base pour l’optimisation des effets thérapeutiques des cellules souches, aussi bien en ce qui concerne le suivi du produit cellule administré par imagerie par résonance magnétique.

Protocole de transfert de micro-ARN dans la moelle osseuse hématopoïétique cellules souches adultes pour activer la cellule génie combiné avec un ciblage magnétique

Ce protocole fournit une méthode sans enzyme s'est dissipée des cellules souches mésenchymales à partir d'échantillons d'abdominoplastie et de lipoaspirate à l'aide d'une méthode d'explantation. L'absence d'enzymes dures ou d'étapes de centrifugation prévoit des cellules souches cliniquement pertinentes qui peuvent être utilisées pour des études in vitro ou transférées à la clinique.

Une méthode sans enzyme s'est d'isolement et d'expansion des cellules souches mésenchymales dérivées de l'adipose humaine

Ce protocole décrit l’utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence des cellules souches mésenchymateuses humaines à l’aide de la méthode de tri unicellulaire. Plus précisément, l’utilisation du tri unicellulaire permet d’atteindre une pureté de 99 % des cellules immunophénotypées d’une population hétérogène lorsqu’elle est associée à une approche multiparamétrique basée sur la cytométrie en flux.

Tri unicellulaire de cellules souches mésenchymateuses immunophénotypées à partir de dents de lait exfoliées humaines

Nous présentons ici des protocoles qui permettent d’isoler des cellules stromales de l’os murin, de la moelle osseuse, du thymus et du tissu thymique humain compatibles avec la multiomique unicellulaire.

Isolement de cellules stromales à partir d’organes hématopoïétiques

Le présent protocole décrit une méthode rentable pour purifier, étendre et caractériser des cellules souches mésenchymateuses (BMSC) de moelle osseuse hautement homogènes provenant de souris. Cette approche facilite l’acquisition de grandes quantités de BMSC à fort potentiel de prolifération et de différenciation, soutenant les modèles murins et faisant progresser la recherche préclinique.

Purification, expansion et phénotypage basé sur la cytométrie en flux de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse dérivées de souris

Ce protocole décrit une méthode de tri à base de billes magnétiques utilisant des anticorps de cytométrie de flux marqués par la phycoérythrine (PE) et des microperles anti-PE pour isoler des sous-populations spécifiques de cellules souches mésenchymateuses présentant une forte positivité des marqueurs cibles postsort et une prolifération / activité métabolique basée sur CCK-8 préservée dans les conditions testées, sans nécessiter de trieurs cellulaires coûteux ni de billes personnalisées...

Isolement et validation des sous-populations de cellules souches mésenchymateuses positives à la podoplanine à l’aide d’une stratégie indirecte de billes magnétiques

Découvrez une méthode enzymatique pour isoler des cellules souches mésenchymateuses à partir d'échantillons de moelle osseuse coagulés en utilisant l'urokinase. Cette technique rapide et économique permet de récupérer des cellules précieuses sans nouvel échantillonnage.

Une méthode enzymatique pour secourir Cellules souches mésenchymateuses à partir d'échantillons coagulés moelle osseuse

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