Name: Oxygène-glucose privation et réoxygénation comme un In Vitro Ischémie-reperfusion modèle pour étudier la dysfonction barrière hémato-encéphalique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Découvrez un modèle in vitro d'ischémie-reperfusion par privation oxygène-glucose et réoxygénation pour étudier la dysfonction de la barrière hémato-encéphalique sur cellules endothéliales cérébrales de rat.

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Nous reconnaissons Scott et le Programme de subventions de recherche Hôpital Blanche pour un soutien financier et Texas A &amp; M Health Science Center College de médecine de laboratoire intégré Imaging pour l&#39;utilisation du microscope confocal à balayage laser. Nous reconnaissons M. Glen Cryer de l&#39;aide pour l&#39;édition de manuscrits.

1. L&#39;ensemencement des cellules endothéliales <ol><li> Obtenir des cultures primaires de RBMEC de partir adultes rats Sprague-Dawley (ou de les obtenir dans le commerce). </li><li> Cultiver RBMECs à 100 cm de la fibronectine (50 ug / ml) des boîtes de Petri revêtues en utilisant le milieu de croissance des cellules endothéliales de cerveau de rat. Changer le milieu tous les deux jours, jusqu&#39;à confluence est atteint. </li><li> En arrivant à 80-90% de confluence, laver délicatement les cellules dans 5 ml tampon phosphate salin (PBS) par tourbillonnement. Les cellules sont ensuite détachés en les exposant à 1 ml de trypsine acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) solution chaude de 0,25%, équilibrée à 37 ° C. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant 2-5 min jusqu&#39;à ce que les cellules sont décollées et dispersés. REMARQUE: Appuyez sur la boîte de culture pour détacher les cellules. Voir les cellules sous le microscope pour confirmer le détachement complet de cellules de la surface de la boîte. </li><li> Ajouter 5 ml médias complet à la boîte de Pétri afin de neutraliser la trypsine.Pipeter le milieu contenant les cellules détachées et les recueillir dans un tube de centrifugeuse de 15 ml. . </li><li> Centrifuger les médias contenant des cellules endothéliales à 220 g pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant et de préserver le culot contenant cells.Suspend le culot dans 3-5 milieu de croissance des cellules endothéliales de cerveau de rat ml fraîche en mélangeant doucement de haut en bas avec des cellules de pipettes seront alors comptés en utilisant un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre. </li><li> Transférer la suspension cellulaire dans la fibronectine (50 ug / ml) prérevêtue 8 système chambre de coulissement puits stérile, 0,7 cm 2 / puits avec une densité de semis comprise entre 10.000-15.000 cellules par puits. Cultiver les cellules à 37 ° C jusqu&#39;à ce que la confluence est atteinte REMARQUE: Pour effectuer des transferts Western ou d&#39;autres expériences, les cellules peuvent être cultivées dans 10 cm des boîtes de culture cellulaire ou des plats spéciaux tel que requis par l&#39;expérience. </li></ol> 2. oxygène et de glucose Privation-réoxygénation In VitroModèle REMARQUE: Le protocole suivant a été adapté à partir de Zulueta et al. 1997; Zhu H et al. 2012 8,9. <ol><li> Utilisez le système de culture cellulaire à l&#39;hypoxie pour étudier les effets de d&#39;autres ministères-R sur RBMECs dans (voir Figure 1). Le programme d&#39;installation et de calibrer le système de culture cellulaire à l&#39;hypoxie avant de commencer l&#39;expérience, selon les instructions du fabricant. </li><li> Retirez les diapositives de la chambre de confluence (étape 1.8) à partir de la 37 ° C incubateur. Remplacer le milieu complet dans la glissière de la chambre avec désoxygénée, aucun glucose, milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) et placé dans la chambre de l&#39;hypoxie avec 95% de N 2 et 5% de CO 2 pendant 2 h à 37 ° C, pour représenter l&#39;état OGD. </li><li> Déplacez les cellules de retour à l&#39;incubateur avec 95% de O 2, 5% de CO 2 à 37 ° C et muni d&#39;un cerveau de rat cellules endothéliales milieu complet frais et incuber pendant 1 heure à 37 ° C. NOTE: Cette étape représente une situation de réoxygénation. </li><li> Les diapositives de la chambre pour immunofluorescence localisation et l&#39;étiquetage de la rhodamine phalloïdine (voir section 3). </li></ol> 3. immunofluorescence localisation de ZO-1 et f étiquetage actine Utilisation rhodamine phalloïdine <ol><li> Exposer les diapositives de la chambre contenant des monocouches RBMEC 100 pi de milieu Opti-MEM / sérique réduite / puits pendant 1 heure. Laver les lames de la chambre 3 fois dans 100 ul de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,0 à 7,2). </li><li> Fixer les cellules en utilisant 100 pi de paraformaldehyde à 4% dans du PBS (pH 7,0 à 7,2) pendant 15 min et laver les lames creuses pour 3 fois dans du PBS (pH 7,0 à 7,2). </li><li> Perméabiliser les cellules en utilisant 100 ul de 0,5% de Triton X-100 dans du PBS, pH (7,0 à 7,2) pendant 15 min. Bloquer avec 100 ul de 2% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS pendant une heure. Après cette étape soit des cellules tache / étiquette soit pour ZO-1 ou f- actine. <ol><li> Pour immunofluorescence staining incuber les cellules avec un anticorps primaire anti-lapin contre ZO-1 en 1: 150, établi en 2% de BSA-PBS pour O / N à 4 ° C. Laver les cellules trois fois dans du PBS (pH 7,0-7,2). Incuber avec 100 ul de la fluorescéine isothiocyanate (FITC) -tagged anticorps secondaire anti-lapin pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Pour le marquage rhodamine phalloïdine, après blocage, exposer les cellules à 100 pi de la rhodamine phalloïdine en dilution 1:50, préparé dans 2% de BSA-PBS, pendant 20 min. </li><li> Laver les cellules d&#39;immunofluorescence et la rhodamine étiquetage phalloïdine dans du PBS (pH 7,0-7,2). Montez les chambres en utilisant les médias de montage contenant un réactif anti-fade avec DAPI. </li></ol></li><li> Visualisez les cellules en utilisant un 60 X eau lentille à immersion et les cellules sont analysés dans un plan optique unique sous un microscope confocal. </li></ol>

<ol><li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycium+barbarum+polysaccharides+reduce+intestinal+ischemia%2Freperfusion+injuries+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats.</a> Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).</li>
<li>Kaur, C., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+in+hypoxic-ischemic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions.</a> Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).</li>
<li>Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%2C+reperfusion+injury%2C+and+hemorrhagic+transformation+in+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke.</a> Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).</li>
<li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+the+investigation+of+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental models for the investigation of brain ischemia.</a> Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).</li>
<li>Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+modulates+the+barrier+and+coagulant+function+of+cultured+bovineendothelium.+Increased+monolayer+permeability+and+induction+of+procoagulant+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties.</a> J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).</li>
<li>Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+generation+of+reactive+oxygen+species+in+endothelial+cellsexposed+to+anoxia-reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation.</a> Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baicalin+reduces+the+permeability+of+the+blood-brain+barrier+during+hypoxia+in+vitro+by+increasing+the+expression+of+tight+junction+proteins+in+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells.</a> J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).</li>
<li>Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+distinct+mechanisms+generate+oxygen+free+radicals+in+neurons+and+contribute+to+cell+death+during+anoxia+and+reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation.</a> J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).</li>
<li>Gundimeda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+polyphenols+precondition+against+cell+death+induced+by+oxygen-glucose+deprivation+via+stimulation+of+laminin+receptor%2C+generation+of+reactive+oxygen+species%2C+and+activation+of+protein+kinase+Cepsilon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon.</a> J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).</li>
<li>Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targets+in+cerebral+ischemia+for+developing+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics.</a> Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).</li>
<li>Alluri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species-Caspase-3+Relationship+in+Mediating+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cell+Hyperpermeability+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation.</a> Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).</li>
<li>Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+and+ROCK+signaling+in+VEGF-induced+microvascular+endothelial+hyperpermeability%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability.</a> Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP+actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin.</a> J Vis Exp. (57), (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

OGD-R comme un modèle in vitro pour les lésions d&#39;ischémie-reperfusion a été bien établi pour étudier les neurones 10,11. Il existe également des études montrant l&#39;effet de l&#39;OGD sur les cellules et les modifications endothéliales cérébrales de la perméabilité et l&#39;intégrité TJ 9. Cependant, notre étude montre l&#39;effet de l&#39;OGD ainsi que réoxygénation, qui est une représentation plus proche de lésions de reperfusion ischémique dans des conditions in vivo...

Ischémie-reperfusion (IR) des blessures se trouve être la cause fréquente de diverses complications et de décès débilitants associés à l&#39;AVC, infarctus du myocarde, un traumatisme, une maladie vasculaire périphérique et une lésion cérébrale traumatique 1,2. Blessures IR dans les vaisseaux cérébraux est une blessure secondaire au début conduisant à une inflammation et un oedème 3. Une des complications graves qui se produisent à la suite de stress oxydatif et l&#39;inflammation métabolique qui suit est la perte de l&#39;équilibre homéostatique conduisant à la formation de radicaux libres, des altérations de la barrière hémato-encéphalique (BHE) jonctions serrées (TJ) et la perméabilité microvasculaire 4,5. Actuellement, des modèles in vivo utilisées pour étudier les effets des blessures IR sur le BBB inclure une occlusion de l&#39;artère cérébrale moyenne (MCAO), microembolies et transgéniques ou knock-out animaux. Cependant, chacun a ses inconvénients et limitations comme indiqué par Hossmann 6. Modèle MCAO est utilisée pour étudier l&#39;effits de stress redox, changements dans les communications de jonction de la BHE et les interactions entre le cerveau et les cellules immunitaires. Cependant, ils présentent divers défis techniques tels que la nécessité de procédures de microchirurgie précis et les difficultés qui y sont. Microembolies rompt instantanément sur ​​le BBB tandis que l&#39;utilisation de transgéniques ou knock-out animaux pour étudier l&#39;ischémie cérébrale peut avoir des défis tels que les influences génétiques moléculaires dépendant sur ​​la formation de l&#39;infarctus, les changements dans l&#39;anatomie vasculaire et variabilité de poids corporel 6. Ainsi, des modèles in vitro d&#39;ischémie ont trouvé un intérêt croissant ces derniers temps principalement en raison de leur applicabilité dans la réalisation d&#39;études mécanistes pour les médicaments. Cependant, les résultats des études in vitro peuvent ne pas représenter pleinement une étude in vivo et doivent être interprétées avec prudence 6. Réactives effet de faibles concentrations d&#39;oxygène sur des monocouches de cellules endotheliales et la perméabilité microvasculaire étéétudié par Ogawa 7. Les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de rat (RBMECs) ont été utilisés pour développer in vitro du Bureau. La privation et la réoxygénation oxygène-glucose (OGD-R) technique présentée dans ce protocole a été adapté à partir d&#39;études de Zulueta et al et Zhu et al 8,9. Nous avons exposé les cellules endotheliales du cerveau à OGD-R en les plaçant dans une chambre de l&#39;hypoxie / anoxie contenant 0% O 2, 5% CO 2 et 95% de N 2. Les cellules ont ensuite été évalués pour des altérations de l&#39;intégrité et le stress TJ formation de fibres par immunofluorescence localisation et la rhodamine étiquetage phalloidin respectivement. Immunofluorescence pour zonula occludens-1 (ZO-1) est effectuée pour déterminer l&#39;intégrité TJ, comme ZO-1 est une membrane d&#39;échafaudage importante protéine liée à TJ. Étiquetage rhodamine phalloïdine détermine l&#39;actine filamenteuse (f actine) dans le cytosquelette de la cellule et est une indication claire de l&#39;actine la formation de fibres de stress dans les cellules endothéliales. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Le but de cette méthode est de donner un aperçu de l&#39;élaboration OGD-R comme un modèle in vitro de IR pour étudier BBB intégrité de TJ de cellules endothéliales et la formation de fibres de stress f-actine. Les résultats fourniront des informations sur le sort de la protéine TJ, ZO-1 et la formation de fibres de stress suivant OGD-R. La compréhension de ces relations sera l&#39;occasion de déterminer les mécanismes moléculaires sous-jacents qui sont déclenchés suivent OGD-R et développer des stratégies thérapeutiques potentielles pour améliorer la perturbation BBB après le traitement AMG-R.

<table><tbody><tr><td>Proox modèle 110</td><td>Biospherix</td><td>Modèle 110</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, sans glucose</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Life technologies</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody</td><td>Life technologies</td><td>617300</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab Tek II-CC 8&nbsp ; bien stérile, verre&nbsp ; diapositives&nbsp ;</td><td>Anticorps</td><td></td> secondaire anti-lapin 177402 <td></td></tr><tr><td>marqué FITC</td><td>Santa cruz</td><td>sc-2090</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Thermo scientific</td><td>SH 30028.03</td><td>Tout autre PBS disponible peut être utilisé</td></tr></tbody></table>

oxygène-glucose privation et réoxygénation comme un<em&gt; in vitro</em&gt; ischémie-reperfusion modèle pour étudier la dysfonction barrière hémato-encéphalique

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischémie-reperfusion (IR) des blessures est connu pour contribuer de manière significative à la morbidité et de la mortalité associée à un accident ischémique cérébral. Accidents vasculaires cérébraux ischémiques représentent 80% de tous les accidents vasculaires cérébraux. Une cause fréquente de blessures IR est l&#39;afflux rapide de liquides suite à une occlusion chronique / aiguë de sang, les nutriments, oxygène vers les tissus déclenchant la formation de radicaux libres. L&#39;AVC ischémique est suivie par barrière hémato-encéphalique (BHE) et la dysfonction vasogénique oedème cérébral. Structurellement, les jonctions serrées (TJS) entre les cellules endotheliales jouent un rôle important dans le maintien de l&#39;intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE). IR blessure est une blessure secondaire au début conduisant à une réponse inflammatoire non spécifique. Le stress oxydatif et l&#39;inflammation métabolique suivante déclenche des dommages au cerveau secondaire comprenant perméabilité de la BHE et la perturbation des jonctions serrées (TJ) intégrité. Notre protocole présente in vitro &lt;/ Em&gt; exemple de la privation d&#39;oxygène-glucose et réoxygénation (AM-R) sur des cellules de cerveau de rat endothéliale TJ intégrité et la formation de fibres de stress. Actuellement, plusieurs expérimentale dans des modèles in vivo sont utilisés pour étudier les effets des blessures IR; mais ils ont plusieurs limitations, telles que les difficultés techniques liées à des opérations chirurgicales, les influences moléculaires dépendantes de gènes et la difficulté à étudier les relations mécanistes. Cependant, les modèles in vitro peuvent aider à surmonter bon nombre de ces limitations. Le protocole présenté peut être utilisé pour étudier les différents mécanismes moléculaires et les relations mécaniques à fournir des stratégies thérapeutiques potentielles. Cependant, les résultats des études in vitro peuvent différer de la norme des études in vivo et doivent être interprétées avec prudence.

Les cellules cultivées sur des lames fibronectine de chambre Nunc II prérevêtus ont été soumis à d&#39;autres ministères-R en plaçant dans un modèle 110 chambre Biospherix ProOx. Après avoir soumis les cellules à OGD-R, ils ont été traités pour ZO-1 jonctionnelle coloration en utilisant une technique d&#39;immunofluorescence comme représenté sur la figure 2 et l&#39;assemblage du cytosquelette indiquant la F-actine la formation de fibres de stress en utilisant la rhodamine phalloïdine étiquette aux tach...

Les lésions d’ischémie-reperfusion (IR) sont associées à un taux élevé de morbidité et de mortalité. L’objectif du modèle in vitro de privation et de réoxygénation d’oxygène-glucose (OGD-R) décrit ici est d’évaluer les effets des lésions d’ischémie et de reperfusion sur diverses cellules, en particulier dans les cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique (BHE).

Oxygène-glucose privation et réoxygénation comme un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ischémie-reperfusion modèle pour étudier la dysfonction barrière hémato-encéphalique

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer le rôle de la privation d'oxygène et de glucose en tant que modèle in vitro de lésion ischémie-reperfusion pour l'étude du dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique. Ceci est réalisé en exposant des cellules endothéliales cérébrales cultivées sur des lamelles à une privation d'oxygène et de glucose, en remplaçant le milieu par un milieu désossigéné sans glucose, puis en les plaçant dans un environnement de chambre hypoxique pendant deux heures. Les cellules sont ensuite replacées dans des conditions normales pendant une heure afin d'obtenir une réoxygénation. Après traitement des cellules, une coloration immunofluorescente de ZO-1 (Zona Occludens-1) et un marquage par Phalloïdine marquée Rhodamine de l'actine filamenteuse sont réalisés.Les cellules sont ensuite observées à l’aide d’un objectif à immersion dans l’eau de 60 x sur un microscope confocal afin d’obtenir des coupes optiques uniques destinées à l’analyse. La procédure sera démontrée par hem nega, une étudiante diplômée de mon laboratoire. Pour commencer la procédure, préparez des cultures primaires de cellules RBM eecs provenant de rats spra dolly adultes. Des lignées disponibles commercialement sont également acceptables.Incubez les R BM EECS dans des boîtes de 100 centimètres recouvertes de fibronectine, en les cultivant dans un milieu de croissance pour cellules endothéliales cérébrales de rat, et changez le milieu tous les deux jours. Faites croître les cellules jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 80 à 90 %. Lavez ensuite délicatement les cellules avec cinq millilitres de PBS.Ensuite, détacher les cellules de la plaque en ajoutant d'abord un millilitre de solution d'EDTA-trypsine 0,25 % préchauffée et en agitant doucement la plaque. Puis, incuber les cellules de deux à cinq minutes. Tapoter le côté de la boîte pour favoriser le détachement des cellules et observer celles-ci au microscope afin de confirmer leur détachement.Pour arrêter la trypsination, ajoutez cinq millilitres de milieu complet, puis pipetez le milieu contenant les cellules détachées et recueillez-le dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Centrifugez le milieu avec les cellules à 220 ×g pendant cinq minutes, aspirez et jetez le surnageant. Resuspendez ensuite le culot cellulaire dans trois à cinq millilitres de milieu frais en faisant passer doucement les cellules à l’aide d’une pipette de cinq millilitres.Comptez maintenant les cellules et transférez 20 à 30 000 cellules dans chaque puits d'une lame à huit chambres recouverte de fibrine et d'actine. Bien entendu, elles pourraient également être cultivées différemment selon les applications. Incubez ensuite la lame à chambres jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence, en prévision de l'étape suivante.Installez et étalonnez le système de culture cellulaire en hypoxie. Selon les instructions du fabricant, l'environnement de la chambre doit être composé de 95 % d'azote, de 5 % de dioxyde de carbone et maintenu à 37 degrés Celsius. Désormais, dés-oxygénez le DMEM sans glucose en le plaçant dans la chambre d'hypoxie pendant quatre à six heures.Commencez à soumettre les cellules au stress en remplaçant leur milieu par du DMEM sans glucose et désossigéné, puis placez les cellules dans une chambre d'hypoxie pendant deux heures. Après deux heures, remettez les cellules dans un milieu complet pour cellules endothéliales cérébrales de rat. Ensuite, réoxygénez les cellules en les replaçant pendant une heure dans des conditions normales.Commencez par exposer chaque puits de monocouches de R-B-M-E-C à 100 à 200 microlitres de milieu optimal à sérum réduit et poursuivez l'incubation pendant une heure. Rincez ensuite les chambres trois fois en utilisant 100 à 200 microlitres de PBS par puits et par lavage. Fixez les cellules avec du paraformaldéhyde 4 % dans du PBS et incubez les lames pendant 15 minutes à température ambiante, puis rincez les cellules trois fois avec du PBS comme précédemment.Perméabilisez maintenant les cellules en appliquant 100 à 200 microlitres de Triton X-100 0,5 % dans du PBS dans chaque puits et laissez la plaque incuber pendant encore 15 minutes à température ambiante. Une fois les cellules perméabilisées, appliquez la solution de blocage et laissez-la agir sur les cellules pendant une heure à température ambiante. Ensuite, réalisez soit une immunofluorescence pour la protéine ZO-1, soit marquez l'actine F.Pour réaliser une immunofluorescence des cellules pour la protéine ZO-1, incubez-les avec l'anticorps primaire toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, lavez les cellules trois fois dans du PBS, comme lors de l'élimination du fixateur. Incubez ensuite les cellules dans 100 à 200 microlitres d'anticorps secondaire anti-lapin marqué avec un fluorochrome pendant une heure à température ambiante afin de marquer les cellules avec r Domine Phin.Après avoir appliqué la solution de blocage pendant une heure, exposer les cellules à 100 à 200 microlitres de R domine Phin dilué au 1/50 dans du PB-S contenant 2 % de B-S-A, pendant 20 minutes. Après l'incubation avec l'anticorps secondaire ou avec R domine Phin, laver les cellules avec du PB-S trois fois, comme précédemment. Ensuite, retirer les chambres en enlevant délicatement l'élastique.Procédez au montage des lames en utilisant un milieu contenant un agent anti-fade et une image DPI. Observez les cellules par microscopie confocale en un seul plan avec un objectif 60 x. Les cellules sont cultivées sur une chambre revêtue de fibronectine.Les lames ont été soumises à une reperfusion après anoxie en les plaçant dans une enceinte hypoxique. Comme décrit. Les cellules ont ensuite été traitées pour les jonctions ZO-1.Les cellules de contrôle colorées ont montré une intégrité jonctionnelle continue, tandis que les cellules privées d'oxygène et de glucose présentaient des jonctions discontinues. De plus, des modifications du cytosquelette ont été observées à l'aide d'aero domine foid marqué pour révéler l'actine F. Les cellules de contrôle en formation de fibres de stress ne présentaient aucune ou une formation minimale de fibres de stress en actine F, alors que les cellules soumises à la privation d'oxygène et de glucose présentaient une augmentation de la formation de fibres de stress.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une privation d'oxygène et de glucose suivie d'une réoxygénation. Ce protocole peut servir de modèle de lésion par ischémie-reperfusion pour étudier la barrière hémato-encéphalique, l'intégrité des jonctions serrées et le stress. La formation de fibres.

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Source : Alluri, H., et.al. Privation et réoxygénation d’oxygène-glucose en tant que modèle de lésion d’ischémie-reperfusion in vitro pour l’étude du dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique. J. Vis. Exp. (2015).La vidéo démontre l’impact de la privation d’oxygène-glucose et de la réoxygénation ultérieure sur les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau du rat (RBMEC) en simulant des conditions hypoxiques et privées de nutriments. Ces conditions entraînent une...

Impact de la privation et de la réoxygénation d’oxygène-glucose sur les interactions cellule-cellule

Occlusion carotidienne bilatérale associée à une hypotension systémique produit ischémie globale du cerveau chez le rat, causant des dommages à l'hippocampe avec sévérité reproductible. sujets animaux sont altérées avec des modèles prévisibles de lésions cérébrales, ils récupèrent opportunément, et les taux de mortalité sont relativement faibles.

Occlusion 2 Navire / Hypotension: un modèle de rat d&#39;ischémie cérébrale globale

In vitro modèles de lésions cérébrales traumatiques sont développés pour reproduire la déformation du cerveau in vivo. Blessure Stretch-induite a été utilisée pour les astrocytes, neurones, cellules gliales, aortiques et des cellules endothéliales cérébrales. Toutefois, notre système utilise une barrière hémato-encéphalique (BHE) du modèle qui possède des propriétés constituant un modèle légitime du Bureau d'établir un modèle de TBI in vitro.

Étirer dans le cerveau cellules endothéliales microvasculaires (CEND) comme<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisme modèle du cerveau de la barrière hémato-encéphalique

Un protocole pour la culture organotypique de tranche entorhino-hippocampique, ce qui permet la reproduction de nombreux aspects de la lésion cérébrale ischémique, est présentée. En étudiant les changements de la neurovasculaire en plus des changements dans les neurones, ce protocole est un outil polyvalent pour étudier les changements plastiques dans le tissu nerveux après une blessure.

L&#39;analyse de neurovasculaire Rénovation dans Entorhino-hippocampe cultures organotypique de tranche

Ce protocole décrit un préconditionnement hypoxique répétitif, ou de brèves expositions à une hypoxie systémique qui réduisent les volumes d’infarctus et la perturbation de la barrière hémato-encéphalique suite à une occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne chez la souris. Il détaille également la double quantification du volume de l’infarctus et de la perturbation de la barrière hémato-encéphalique après un AVC afin d’évaluer l’efficacité de la protection neurovasculaire.

Quantification de la protection neurovasculaire Après répétitive hypoxique préconditionnement et transitoire Moyen Cerebral Artery Occlusion chez la souris

Accident vasculaire cérébral ischémique est un événement complexe dans laquelle l’apport spécifique des astrocytes dans la région du cerveau touchée exposés au manque d’oxygène de glucose (AMG) est difficile à étudier. Cet article présente une méthode pour obtenir des astrocytes isolés et étudier leur réactivité et leur multiplication dans des conditions de ministères.

Surveillance des astrocytes réactivité et prolifération in Vitro dans des Conditions de type ischémique

L’objectif du protocole est de présenter une procédure optimisée pour la création d’un modèle barrière hémato - encéphalique (BHE) in vitro basé sur les cellules endothéliales cérébrales porcines primaires (pBECs). Le modèle montre reproductibilité élevée, grande étanchéité et est adapté pour des études de transport et trafic intracellulaire en découverte de médicaments.

Procédé amélioré pour la création d’un In Vitro barrière hémato - encéphalique modèle basé sur les cellules endothéliales du cerveau porcin

L’objectif global de cette procédure est de fournir une technique hautement reproductible pour évaluer in vivo la rupture de la barrière hémato - encéphalique dans les modèles de rat d’accident vasculaire cérébral ischémique.

Une évaluation In Vivo de la perturbation de la barrière hémato - encéphalique dans un modèle de Rat d’accident vasculaire cérébral ischémique

Ici, nous présentons une approche simple utilisant des milieux de culture spécifiques qui permettent l’établissement de cultures enrichies de neurones et d’astrocytes, ou de cultures neuron-glia du cortex embryonnaire, avec un rendement élevé et une reproductibilité.

Un modèle de culture cellulaire pour étudier le rôle des interactions neurone-glia dans l’ischémie

Ici, nous décrivons la méthode pour établir un modèle de culture triple cellulaire de la barrière hémato-encéphalique basé sur les cellules endothéliales microvasculaires primaires du cerveau humain, les astrocytes et les péricytes. Ce modèle multicellulaire est adapté aux études de dysfonctionnement de l’unité neurovasculaire lors d’un AVC ischémique in vitro ou au criblage de candidats médicaments.

Un modèle de culture cellulaire primaire triple de la barrière hémato-encéphalique humaine pour l’étude de l’AVC ischémique in vitro

La barrière hémato-encéphalique joue un rôle crucial dans le maintien d’un environnement cérébral stable et sain. Le dysfonctionnement de la BHE est associé à de nombreuses maladies neurologiques. Nous avons développé un modèle 3D dérivé de cellules souches de la BHE pour étudier la pathologie cérébrovasculaire, l’intégrité de la BHE et la façon dont la BHE est modifiée par la génétique et la maladie.

Reconstruction de la barrière hémato-encéphalique in vitro pour modéliser et cibler thérapeutiquement les maladies neurologiques

Découvrez un modèle in vitro d'ischémie-reperfusion par privation oxygène-glucose et réoxygénation pour étudier la dysfonction de la barrière hémato-encéphalique sur cellules endothéliales cérébrales de rat.

Oxygène-glucose privation et réoxygénation comme un In Vitro Ischémie-reperfusion modèle pour étudier la dysfonction barrière hémato-encéphalique (Vidéo) | JoVE Journal

Oxygène-glucose privation et réoxygénation comme un

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