Isolement de cellules mononucléées du système nerveux central de rats avec EAE

Très bien. Bonjour, je suis Christine Beaton. Je suis chercheuse assistante dans le laboratoire de George Chen au Département de physiologie et de biophysique de l'Université de Californie à Irvine. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment isoler des cellules mononucléées du système nerveux central de rats.

Donc, cette procédure consiste à anesthésier profondément un rat afin d'effectuer une perfusion cardiaque, de manière à ne pas avoir de sang contaminant dans le système nerveux central. Une fois l'animal sacrifié, nous extrairons le cerveau et la moelle épinière, puis préparerons une suspension monocellulaire à l'aide d'un tamis cellulaire. Ensuite, à l'aide d'un gradient double couche de Percoll, nous isolerons les cellules mononucléées. Commençons.

Je suis maintenant prêt à effectuer la perfusion cardiaque, je vais donc montrer tous les matériaux dont j'ai besoin pour cela. La première chose dont nous avons besoin est un bocal de Bell, et ici nous avons placé des essuie-tout imprégnés d'anesthésique volatil. Vous pouvez utiliser du halane ou de l'iso-flurane.

La prochaine chose dont nous avons besoin est un dispositif pour maintenir le rat et un autre pour recueillir le sang. Nous disposons donc de ce montage improvisé pour perfuser les rats. Vous utiliserez une aiguille de calibre 21, et nous allons perfuser une solution saline par gravité à l’aide d’un système de perfusion intraveineuse.

Si vous n'avez pas accès à l'un de ces systèmes, vous pouvez également remplir plusieurs seringues avec du sérum physiologique et les perfuser manuellement. Mais ceci est beaucoup plus facile. Et ce dont nous avons également besoin est un cylindre de seringue de 10 ml dans lequel nous avons placé des essuie-tout Kim.

Et je vais ajouter l'anesthésique, une partie de l'anesthésique, dans le dispositif à appliquer sur le nez du rat afin de garantir qu'il reste profondément anesthésié pendant l'intervention. Ensuite, bien sûr, vous avez besoin d'instruments. Aujourd'hui, je ne vais pas effectuer une procédure stérile, car je ne vais pas mettre les cellules en culture.

Ainsi, tous les instruments que j'utilise ne sont pas stériles. Mais bien sûr, si vous souhaitez mettre vos cellules en culture, vous voudrez peut-être utiliser des instruments stériles. Pour les besoins de cette vidéo, j'utiliserai un rat qui est en réalité mort.

Ainsi, je peux effectuer la procédure lentement pour vous la montrer, étape par étape. Bien sûr, lors d'une procédure réelle, vous auriez besoin d'un rat profondément anesthésié, mais pas mort. Vous voudriez que le cœur continue de battre.

Commençons donc avec ce rat. Je place le rat sur le dos, son dos tourné vers moi, et je mets des lingettes imbibées sur son nez. Ensuite, la première chose que je vais faire est de vérifier que le rat est profondément anesthésié.

Vous devez donc le faire avant chacune de ces procédures. Je prends donc ma pince et je pince le rat, et il n’y a aucune réaction. S’il y a la moindre réaction, vous devez remettre le rat dans le belger pour vous assurer qu’il est profondément anesthésié.

Ensuite, j'utiliserai de l'éthanol à 70 % pour imbiber la moitié supérieure du rat. Puis j'ouvrirai la cavité thoracique. Tout d'abord, je vais enlever la peau et l'ouvrir sur le côté.

Ensuite, je vais ouvrir la cavité elle-même. Cette masse ici est le cœur. Ici, vous pouvez voir l'oreillette droite.

C'est ce que je vais couper pour permettre à l'écoulement du sang. Ensuite, afin de perfuser tout l'organisme, je dois insérer mon aiguille dans le ventricule gauche. Je vais donc insérer mon aiguille juste ici.

Et une fois que l'aiguille est insérée, je vais ouvrir le tube de perfusion pour laisser passer le sérum physiologique, et je vais le laisser agir pendant cinq à dix minutes. Si la perfusion est bonne, vous allez observer une décoloration du pouls rouge, du nez rouge et des yeux du rat, bien sûr, ce qui indique que le sang quitte le corps du rat. Cela signifie donc que la perfusion devrait être satisfaisante.

Voici le rat après la perfusion cardiaque. Comme vous pouvez le constater, le nez, les oreilles et les yeux de ce rat ne sont plus roses ni rouges. Ils sont devenus complètement blancs, ce qui indique que la perfusion a bien fonctionné.

Tout ou presque tout le sang a quitté les taches de rat. Maintenant que la perfusion cardiaque du rat a été réalisée, je dois lui couper la tête. Je dois décapiter le rat.

Et pour cela, je vais utiliser du matériel de laboratoire ordinaire. Je vais maintenant retirer le cerveau du rat. Je vais donc imbiber tout le pelage avec de l'éthanol à 70 % afin d'éviter que des poils ne se dispersent partout.

Ensuite, je vais d'abord retirer la peau. Étant donné que je n'ai pas l'intention d'utiliser le cerveau pour l'histologie et que je vais le couper en petits morceaux, je n'ai pas besoin de l'extraire de manière très soigneuse et intacte. D'un seul tenant, je vais insérer mes ciseaux à la base du crâne, là où le cerveau se connecte à la moelle épinière, juste ici.

Et je vais couper l'os de chaque côté, puis j'enlèverai le sommet. Et je vais répéter cela encore et encore. Voici le cerveau complètement exposé.

Et comme vous pouvez le constater, la perfusion a bien fonctionné car le cerveau est parfaitement clair. Chez un animal non perfusé, vous verriez que la couche supérieure du cerveau serait entièrement recouverte de capillaires rouges, des capillaires sanguins rouges, de sorte qu’on ne les voit pas du tout, ce qui signifie que la perfusion a été efficace. Maintenant, je vais extraire le cerveau en veillant à ne pas laisser derrière l’bulbe olfactif, et je vais le placer dans un tube contenant de la glace appelée PBS.

Alors maintenant, sans faire trop attention à le maintenir intact, je vais placer le cerveau dans le tube contenant du PBS et je vais couper les nerfs optiques, puis à l’aide d’une spatule, il sortira assez facilement. Ensuite, je vais retirer la moelle épinière du même rat. Et là encore, puisque nous allons la couper en petits morceaux, je ne vais pas chercher à l’extraire de manière très soigneuse, du moment que j’arrive à retirer la totalité.

J'ai d'abord incisé la peau tout le long de la colonne vertébrale et la colonne vertébrale est visible ici. Ensuite, je vais retirer la chair ici afin que la colonne vertébrale soit entièrement exposée. Et juste ici, vous pouvez voir la moelle épinière.

Ainsi, chez la souris, vous pouvez couper les deux extrémités et injecter du PBS avec la seringue, et la moelle épinière sort presque entière. Mais chez le rat, ce n'est pas aussi facile. Je dois l'ouvrir et extraire la moelle épinière à l'aide d'une petite cuillère.

Je coupe donc maintenant des deux côtés, et comme je l'ai fait pour le cerveau, je coupe et j'enlève l'os afin d'exposer la moelle épinière. Comme pour le cerveau, la moelle épinière est complètement blanche, ce qui montre que la perfusion cardiaque a bien fonctionné. Et je vais faire cela tout au long de la colonne vertébrale.

Et je descends jusqu'au niveau de la hanche droite, qui se trouve juste ici. Ensuite, je vais utiliser des pinces, et ce n'est pas très élégant, mais je vais simplement extraire la moelle épinière et la placer dans mon tube avec le cerveau. Maintenant, dans mon tube, j'ai à la fois le cerveau et la moelle épinière du rat, et je suis prêt à préparer ma suspension monocellulaire.

Je suis maintenant prêt à préparer une suspension de cellules individuelles à partir de mon système nerveux central. Pour cela, j'aurai besoin d'une boîte de Pétri de 10 centimètres dans laquelle je vais placer un tamis cellulaire de 70 microns. J'utiliserai également le piston d'une seringue de un millilitre, ainsi que des pinces et des ciseaux.

Je vais donc placer mon échantillon dans le tamis cellulaire et m'assurer qu'il ne reste rien dans le tube. Ensuite, je vais découper en petits morceaux le cerveau et la moelle épinière mélangés. Une fois que tout sera finement haché, j'utiliserai le piston de la seringue de Oneill pour faire passer le tout à travers.

Et vous allez progressivement observer que le PBS à l'extérieur du dispositif de tri cellulaire va devenir plus trouble à mesure que les cellules isolées le traversent. Si je voulais que ma suspension cellulaire soit stérile, bien sûr, je réaliserais cette opération sous hotte à flux laminaire et je n'y mettrais pas les doigts. Maintenant que le PBS est trouble, je vais le récupérer pour la première fois et le placer dans un tube de 50 ml.

Mais je vais également garder un œil attentif et ajouter un peu plus de PBS à mon tamis cellulaire, puis je vais effectuer une pression. Étant donné que le SNC contient beaucoup de graisse, c’est l’un des organes que je trouve les plus difficiles à préparer en suspension cellulaire à l’aide de cette technique. J’ai donc fait passer tout mon SNC à plusieurs reprises à travers le tamis cellulaire, et j’ai récupéré toute la suspension de cellules uniques.

Et voici le tube que j'ai rempli jusqu'à 50 ml avec du PBS contenant ma suspension de cellules uniques préparée à partir du SNC, à droite. Maintenant, je vais centrifuger ce tube pour le préparer à la gradient. Les cellules ont terminé la centrifugation. Nous avons maintenant un culot, donc je vais éliminer le surnageant et je vais resuspendre mes cellules dans 20 millilitres de Percoll à 30 % de Percoll dans du PBS.

Et je vais déposer cela sur 10 mils de Perkel à 70 % dans du PBS pour induire la migration. J'élimine donc le surnageant. Je disperse le culot pour m'assurer que les cellules sont en suspension simple et non regroupées dans le culot.

Je dispose désormais de ma suspension de cellules du SNC en suspension monocellulaire. Je vais suspendre ces cellules dans 20 mils de Percoll à 30 % dans du PBS, puis je vais déposer ces 20 mils au-dessus de 10 mils de Percoll à 70 % dans du PBS. Ensuite, je vais centrifuger.

Je vais maintenant prendre mes 20 mils de suspension de SNC et les déposer lentement en surcouche sur la couche de percoll à 70 % pour faciliter l'opération. Vous pouvez également ajouter un colorant comme le rouge de phénol dans l'une des couches, mais je ne suis pas tout à fait certain de son effet sur les cellules, s'il en a un. J'essaie donc de l'éviter.

Vous devez avancer suffisamment lentement pour que les deux couches ne se mélangent pas, afin d'éviter toute turbulence importante dans la couche inférieure. Et à mesure que la couche supérieure s'épaissit, vous pouvez accélérer. J'ai donc maintenant ajouté mes cellules au gradient.

Ainsi, la couche claire située ici en bas est la couche de Percoll à 70 %, et la couche trouble en haut est une couche de Percoll à 30 % contenant ma suspension de cellules uniques. Je vais maintenant placer ce tube dans la centrifugeuse pendant 20 minutes, et je pourrai visualiser la couche de cellules monocytaires si mon travail a été correctement effectué. Nous avons donc terminé la centrifugation du gradient.

Comme toujours, lors de la centrifugation pour former un gradient, veillez soigneusement à désactiver le frein afin d'éviter que celui-ci n'interrompe le gradient en ralentissant trop rapidement. Nous avons maintenant nos couches. Au-dessus du gradient, se trouve une couche de gras que je vais retirer afin d'éviter de contaminer ma suspension cellulaire.

Et à l'interface entre les deux couches de Percoll à 30 et 70 %, vous observez que l'interface n'est pas nette, elle est floue, et c'est précisément là que se trouvent les cellules. Une fois que j'aurai retiré les cellules, vous verrez que l'interface deviendra beaucoup plus nette. Je vais donc simplement enlever la majeure partie de la graisse présente dans la couche supérieure et la mettre dans ma poubelle.

Je n'ai pas besoin d'enlever tout le liquide, mais je veux en retirer suffisamment pour qu'il ne recouvre pas complètement ma pipette lorsque je descends récupérer les cellules monocouche. Maintenant, à l'aide d'une autre pipette de transfert, je vais venir au niveau de l'interface afin de récolter mes cellules. J'ai donc prélevé plusieurs millilitres au niveau de l'interface.

J'ai donc probablement toutes les cellules que je pouvais obtenir à cet endroit. Le nombre de cellules monoculaires dans ce SNC était vraiment faible. J'ai maintenant mes cellules mononucléées dans le tube.

Je vais remplir ce tube jusqu'à 50 ml avec du PBS, puis je vais centrifuger les cellules pour les faire précipiter, ce qui permettra d'éliminer les perles. Je recommande de les laver au moins deux fois avec un tube complet de PBS afin de s'assurer que toutes les perles sont éliminées. Ensuite, les cellules sont prêtes pour toute procédure que vous souhaitez effectuer avec elles.

Aujourd'hui, je vous ai montré comment isoler les cellules mononucléées du système nerveux central de rats. Une fois ces cellules mononucléées obtenues, vous pouvez bien sûr les purifier davantage afin d'isoler, par exemple, les lymphocytes T au sein de cette population. Ce que je vais faire avec ces cellules, c'est réaliser un dosage par cytométrie en flux afin de détecter les populations cellulaires présentes dans mon cerveau.

Bonne chance avec votre isolement de cellules.