Environnement microfluidique contrôlée pour Dynamic Investigation of Blood Red Cell Agrégation

L’objectif global de cette procédure est de quantifier directement les agrégats de globules rouges dans la microcirculation, dynamiquement sous des taux de cisaillement contrôlés et constants. Ceci est accompli par la première formation, des suspensions de globules rouges et un double microcanal y avec une solution saline tampon de phosphate, créant une joie constante dans la couche de sang. La deuxième étape consiste à visualiser et à enregistrer le flux à l’aide d’une caméra à grande vitesse.

Ensuite, utilisez des techniques de traitement d’image pour traiter l’enregistrement et obtenir une taille agrégée moyenne et la distribution de la taille agrégée dans le microcanal. La dernière étape consiste à déterminer la vitesse du sang en suivant le déplacement des particules fluorescentes injectées dans le microcanal entre deux images consécutives. En fin de compte, le taux de cisaillement dans le microcanal est calculé en fonction de la vitesse du sang et de l’épaisseur de la couche sanguine afin de relier les tailles des agrégats au taux de cisaillement local correspondant.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la méthode de transmission de la lumière, est que les agrégats de globules rouges sont analysés dynamiquement dans le flux de parts microscopiques par opposition à statistiquement avec d’autres techniques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’hémoradiologie, telles que la compréhension des conditions de formation des agrégats de globules rouges et la découverte du comportement radiologique du sang dans la microcirculation. Pour commencer, fabriquez des micro-canaux de 120 microns de large, 60 microns de haut et sept millimètres de long selon les méthodes photolithographiques standard.

Ensuite, prélevez des cellules sanguines de donneurs volontaires sains et préparez des suspensions de globules rouges avec des niveaux d’hématocrite de cinq, 10 et 15 % comme décrit dans le protocole de texte ci-joint, combinez un millilitre de chaque suspension de globules rouges avec 60 microlitres d’une solution à 1 % contenant des particules traceurs fluorescentes. Secouez doucement le tube pour mélanger la solution. Combinez également le même volume de particules traceurs à un millilitre de PBS à un pH de 7,4.

Chargez une seringue en verre de 25 microlitres avec la solution de traceur contenant des globules rouges et une seringue en verre de 100 microlitres. Avec la solution de traceur dans PBS, assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles présentes dans le système. Ensuite, placez le microcanal sur une platine de microscope inversé connectée à une caméra haute vitesse capable d’enregistrer 18 images par seconde ou plus, et à un système de vélocimétrie par image de microparticules.

Connectez chaque seringue via un tube à l’un des orifices d’entrée du canal microfluidique, puis chargez-les dans le support du même pousse-seringue. Programmez le pousse-seringue pour distribuer la seringue de 25 microlitres à un rythme de deux microlitres par heure. Cela permettra également de distribuer la seringue de 100 microlitres à quatre fois ce taux en raison de leur différence de taille.

Modifiez le débit entre les expériences afin de tester différents taux de cisaillement. Utilisez un ridicule de calibrage avec l’objectif 20x en place pour calibrer l’appareil photo haute vitesse. Démarrez ensuite la pompe pour commencer à distribuer les deux solutions dans le microcanal.

Déterminez l’exposition optimale de l’appareil photo. Temps pour une imagerie claire des agrégats. Il est important d’attendre que le débit atteigne l’état d’équilibre avant d’acquérir des mesures.

Si l’état d’équilibre est maintenant atteint dans les trois à cinq minutes. Remplissez la seringue pour éduquer le mélange et maintenir les globules rouges en suspension. Une fois que le flux à l’état d’équilibre est atteint, commencez à enregistrer le mouvement des globules rouges.

Enregistrez le flux pendant sept secondes. À l’aide d’un programme capable de traitement d’image, améliorez le contraste de chaque image en niveaux de gris prise à l’aide de la méthode de l’égaliseur d’histogramme. Ensuite, convertissez les images en niveaux de gris en images binaires.

Définissez soigneusement la valeur seuil en testant plusieurs valeurs et en choisissant la valeur pour laquelle tous les agrégats sont correctement détectés. Si nécessaire, remplissez les trous correspondant aux espaces à l’intérieur d’un agrégat. Détectez ensuite les cellules en déterminant les pixels blancs voisins dans l’image binaire afin que les cellules adjacentes soient considérées comme des agrégats.

Étiquetez les différents agrégats de globules rouges détectés, puis convertissez l’image binaire en une image rouge, verte et bleue pour une meilleure visualisation. Enfin, superposez l’image rouge, verte et bleue sur l’image d’origine. Afin de vérifier l’efficacité du traitement de l’image, calculez la surface de chaque agrégat détecté dans le cadre en fonction du nombre de pixels détectés.

Traitez tous les cadres de la même manière. Ensuite, faites la moyenne des tailles agrégées détectées dans chaque trame, puis des résultats de toutes les trames. Pour obtenir la taille globale moyenne pour chaque enregistrement des moteurs de suspensions de globules rouges, convertissez les résultats en micromètres carrés en utilisant l’image ridicule.

Calculez ensuite l’aire d’un globule rouge pour déterminer un représentant. Estimation du nombre de globules rouges dans chaque agrégat détecté une fois les données acquises. À l’aide de la caméra haute vitesse, passez à la caméra à double impulsion utilisée pour le système de vélocimétrie par image de microparticules.

Utilisez un logiciel d’imagerie tel que celui présenté ici pour l’acquisition d’images de l’écoulement et le traitement d’images pour la détermination du champ de vitesse. Assurez-vous de mettre des lunettes de protection, puis d’allumer le système laser et la caméra. Placez un micromètre sous le microscope et utilisez l’image résultante pour calibrer le système.

Ensuite, démarrez l’écoulement du fluide et visualisez les particules dans les deux fluides. Trouvez le plan médian du microcanal en vous concentrant sur les particules les plus rapides et les plus brillantes de l’écoulement. Ensuite, réglez l’intervalle de temps entre les images à environ deux millisecondes afin que les particules les plus rapides se déplacent de cinq à 10 pixels entre les deux images et commencent à enregistrer le flux O. Réglez le logiciel pour qu’il acquière 100 paires d’images pour toutes les différentes suspensions de globules rouges et pour différents taux de cisaillement.

Après le prétraitement de l’image. Choisissez la taille et la forme de la fenêtre de corrélation ainsi que le pourcentage d’images qui se chevauchent. Exprimez les résultats sous la forme d’un champ de vitesse moyen calculé à partir des 100 paires d’images et de la racine carrée moyenne de l’erreur de vitesse.

Éteignez la caméra laser et l’ordinateur. Une fois que toutes les mesures et le traitement de l’image ont été effectués, calculez le taux en détectant et en estimant d’abord l’épaisseur du sang dans le micro-canal sur la base de l’enregistrement à grande vitesse de la caméra. Pour ce faire, faites la moyenne de toutes les images de l’enregistrement spécifique afin d’obtenir une image d’arrière-plan de la vidéo.

Enfin, décelez la couche de sang en inspectant visuellement l’image moyenne de toutes les images et détectez manuellement le bord de la couche de sang. Ensuite, obtenez manuellement la valeur de vitesse pour l’épaisseur de la couche de sang correspondante à partir du profil de vitesse extrait et calculez le taux de cisaillement en divisant la valeur de vitesse par la couche de sang. L’épaisseur indiquée ici est les mouvements nets de quatre agrégats de globules rouges qui ont été détectés dans trois images consécutives.

Les grands agrégats de plus de 30 cellules sont représentés en rouge. Les agrégats moyens entre neuf et 30 cellules sont représentés en vert, et les petits agrégats de moins de neuf cellules sont indiqués en bleu. La vitesse d’un agrégat varie en fonction de sa position dans le microcanal indiqué.

Voici les profils de vitesse des globules rouges en suspension à 5 % d’hématocrite, 10 % d’hématocrite et 15 % d’hématocrite à un débit de 10 microlitres par heure. Vous pouvez voir la vitesse se diriger vers zéro sur les deux bords comme prévu, et le point d’inflexion entre les deux flux d’écoulement varie légèrement entre les niveaux d’hématocrite à mesure que le taux de cisaillement global augmente, la taille des agrégats à chaque baisse de niveau d’hématocrite. Cela est dû au fait que la force pure dans le microcanal dépasse la force d’agrégation, provoquant la désagrégation des globules rouges.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’assurer une bonne qualité d’image du flux dans le microcanal et d’assurer un contraste entre les globules rouges qui circulent et l’arrière-plan de l’image. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser qualitativement et quantitativement les agrégats de globules rouges dans des conditions de flux contrôlé.