Environnement microfluidique contrôlée pour Dynamic Investigation of Blood Red Cell Agrégation

L'objectif général de cette procédure est de quantifier directement les agrégats de globules rouges dans la microcirculation, de manière dynamique et sous des taux de cisaillement contrôlés et constants. Cela est réalisé en entraînant d'abord des suspensions de globules rouges dans un microcanal en double Y contenant une solution saline tamponnée au phosphate, créant ainsi un cisaillement constant dans la couche sanguine. La deuxième étape consiste à visualiser et enregistrer l'écoulement à l'aide d'une caméra haute vitesse.

Ensuite, utilisez des techniques de traitement d'image pour analyser l'enregistrement et obtenir une taille moyenne des agrégats ainsi que la distribution des tailles d'agrégats dans le microcanal. La dernière étape consiste à déterminer la vitesse du sang en suivant le déplacement des particules fluorescentes injectées dans le microcanal entre deux images consécutives. Enfin, le taux de cisaillement dans le microcanal est calculé à partir de la vitesse du sang et de l'épaisseur de la couche sanguine, afin de relier les tailles des agrégats au taux de cisaillement local correspondant.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la méthode de transmission de la lumière, est que les agrégats de globules rouges sont analysés de manière dynamique dans un écoulement de cisaillement microscopique, contrairement aux autres techniques qui reposent sur une analyse statistique. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de l'hémorhéologie, telles que la compréhension des conditions de formation des agrégats de globules rouges et l'analyse du comportement rhéologique du sang en microcirculation. Pour commencer, fabriquer des microcanaux de 120 microns de large, 60 microns de haut et sept millimètres de long selon des méthodes standard de photolithographie.

Ensuite, prélevez des cellules sanguines auprès de donneurs volontaires en bonne santé et préparez des suspensions de globules rouges à des taux d'hématocrite de 5, 10 et 15 %, comme décrit dans le protocole accompagnant le texte. Mélangez un millilitre de chaque suspension de globules rouges avec 60 microlitres d'une solution à 1 % contenant des particules marquées au fluorochrome. Secouez doucement le tube pour homogénéiser la solution. Mélangez également le même volume de particules marqueurs à un millilitre de PBS à un pH de 7,4.

Chargez une seringue en verre de 25 microlitres avec la solution traceur contenant des globules rouges et une seringue en verre de 100 microlitres. Avec la solution traceur dans du PBS, assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles présentes dans le système. Placez ensuite le microcanal sur la platine d’un microscope inversé relié à une caméra haute vitesse capable d’enregistrer 18 images par seconde ou plus, ainsi qu’à un système de vélocimétrie par imagerie de microparticules.

Connectez chaque seringue, via un tube, à l'un des orifices d'entrée du canal microfluidique, puis insérez-les dans le support de la même pompe à seringue. Programmez la pompe à seringue pour délivrer la seringue de 25 microlitres à un débit de deux microlitres par heure. Cela entraînera également le délivrance de la seringue de 100 microlitres à un débit quatre fois supérieur, en raison de leur différence de taille.

Modifiez le débit entre les expériences afin de tester différentes vitesses de cisaillement. Utilisez un calibre de calibration avec l'objectif 20 x en place pour étalonner la caméra haute vitesse. Ensuite, démarrez la pompe pour commencer à distribuer les deux solutions dans le microcanal.

Déterminez un temps d'exposition optimal pour la caméra. Temps nécessaire pour obtenir une image nette des agrégats. Il est important d'attendre que l'écoulement atteigne un état stationnaire avant d'effectuer des mesures.

Si l'état stationnaire est atteint maintenant en trois à cinq minutes. Remplissez à nouveau la seringue pour homogénéiser le mélange et maintenir les globules rouges en suspension. Une fois l'écoulement en état stationnaire atteint, commencez à enregistrer le déplacement des globules rouges.

Enregistrez le flux pendant sept secondes. À l'aide d'un programme capable de traitement d'images, améliorez le contraste de chaque image en niveaux de gris en utilisant la méthode d'égalisation d'histogramme. Ensuite, convertissez les images en niveaux de gris en images binaires.

Définissez soigneusement la valeur de seuil en testant plusieurs valeurs et en choisissant celle pour laquelle tous les agrégats sont correctement détectés. Si nécessaire, comblez les trous correspondant aux espaces vides à l’intérieur d’un même agrégat. Ensuite, détectez les cellules en identifiant les pixels blancs voisins dans l’image binaire, de sorte que les cellules adjacentes soient comptabilisées comme des agrégats.

Étiquetez les différents agrégats de globules rouges détectés, puis convertissez l'image binaire en une image RVB pour une meilleure visualisation. Enfin, superposez l'image RVB sur l'image d'origine. Afin de vérifier l'efficacité du traitement d'image, calculez la surface de chaque agrégat détecté dans le cadre en fonction du nombre de pixels détectés.

Traitez toutes les images de la même manière. Ensuite, faites la moyenne des tailles d'agrégats détectées dans chaque image, puis des résultats obtenus pour l'ensemble des images. Pour obtenir la taille moyenne des agrégats pour chaque enregistrement des moteurs de suspensions de globules rouges, convertissez les résultats en micromètres carrés à l'aide de l'image de référence.

Ensuite, calculez la surface d'un globule rouge afin de déterminer une valeur représentative. Nombre estimé de globules rouges dans chaque agrégat détecté une fois les données acquises. À l'aide de la caméra haute vitesse, passez à la caméra à double impulsion utilisée pour le système de vélocimétrie par images de microparticules.

Utilisez un logiciel d'imagerie tel que celui illustré ici pour l'acquisition d'images de l'écoulement et le traitement d'images afin de déterminer le champ de vitesses. Assurez-vous de porter des lunettes de protection, puis allumez le système laser et la caméra. Placez un micromètre sous le microscope et utilisez l'image obtenue pour étalonner le système.

Ensuite, démarrez l'écoulement du fluide et visualisez les particules dans les deux fluides. Repérez le plan médian du microcanal en mettant au point sur les particules les plus rapides et les plus brillantes de l'écoulement. Réglez ensuite l'intervalle de temps entre les images à environ deux millisecondes, de sorte que les particules les plus rapides se déplacent de cinq à dix pixels entre les deux images, puis commencez l'enregistrement de l'écoulement O. Configurez le logiciel pour acquérir 100 paires d'images pour toutes les différentes suspensions de globules rouges et pour différents taux de cisaillement.

Après le prétraitement des images, choisissez la taille et la forme de la fenêtre de corrélation ainsi que le pourcentage de recouvrement des images. Exprimez les résultats sous la forme d'un champ de vitesse moyen calculé à partir des 100 paires d'images et de l'erreur quadratique moyenne en vitesse.

Éteignez la caméra laser et l'ordinateur. Une fois toutes les mesures et le traitement des images effectués, calculez alors le taux de cisaillement en détectant et en estimant d'abord l'épaisseur du sang dans le microcanal à partir de l'enregistrement de la caméra haute vitesse. À cette fin, faites la moyenne de toutes les images de l'enregistrement spécifique afin d'obtenir une image de fond de la vidéo.

Enfin, délimitez la couche de sang en examinant visuellement l'image moyenne de toutes les images et en détectant manuellement le bord de la couche de sang. Ensuite, obtenez la valeur de vitesse correspondant à l'épaisseur de la couche de sang manuellement à partir du profil de vitesse extrait, puis calculez le taux de cisaillement en divisant la valeur de vitesse par l'épaisseur de la couche de sang. Les épaisseurs indiquées ici correspondent aux mouvements nets de quatre agrégats de globules rouges détectés sur trois images consécutives.

Les grands agrégats de plus de 30 cellules sont représentés en rouge. Les agrégats moyens, composés de neuf à 30 cellules, sont représentés en vert, et les petits agrégats de moins de neuf cellules sont représentés en bleu. La vitesse d'un agrégat varie selon sa position dans le microcanal illustré.

Voici les profils de vitesse des globules rouges en suspension à un hématocrite de 5 %, 10 % et 15 %, à un débit de 10 microlitres par heure. On observe que la vitesse tend vers zéro aux deux bords, comme prévu, et que le point d'inflexion entre les deux flux varie légèrement selon les niveaux d'hématocrite, car, globalement, la vitesse de cisaillement augmente tandis que la taille des agrégats diminue à chaque niveau d'hématocrite. Ceci s'explique par le fait que la force de cisaillement dans le microcanal dépasse la force d'agrégation, provoquant la désagrégation des globules rouges.

Lors de cette procédure, il est important de veiller à obtenir une bonne qualité d'image de l'écoulement dans le microcanal et de garantir un contraste entre les globules rouges en circulation et le fond de l'image. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'analyser qualitativement et quantitativement les agrégats de globules rouges dans des conditions d'écoulement contrôlées.