Dispositifs à base de papier pour l'isolement et la caractérisation de vésicules extracellulaire

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les vésicules extracellulaires à l’aide d’une plateforme sur papier. Pour ce faire, il suffit d’abord de plastifier avec deux feuilles de polystyrène avec de la cellulose circulaire, les découpes de papier alignées sur un ensemble de trous traversants enregistrés. La deuxième étape consiste à conjuguer chimiquement des molécules qui lieraient les vésicules extracellulaires à la zone de test en papier.

Ensuite, l’échantillon biologique peut être pipeté directement sur la zone de test du papier, et les vésicules extracellulaires sont isolées après l’étape de rinçage. La dernière étape consiste à caractériser les vésicules extracellulaires capturées à l’aide de la microscopie électronique, de l’analyse Eliza ou de l’analyse transcriptomique. En fin de compte, des sous-ensembles de vésicules extracellulaires provenant d’échantillons de sérum aussi petits que 10 microlitres peuvent être purifiés et concentrés.

Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme l’ultra éducation est qu’elle est beaucoup plus douce à assembler et qu’elle est simple à réaliser. La démonstration de la procédure sera un étudiant diplômé d’accord. En commençant par deux feuilles de polystyrène, créez un ensemble de découpes circulaires.

Chacun d’entre eux présente un diamètre inférieur à cinq millimètres avec une perforatrice manuelle ou un traceur de découpe automatisé. De plus, découpez une série de chromatographie de cinq millimètres de diamètre, des disques de papier avec une perforatrice. Placez une feuille de polystyrène sur le banc et superposez un seul disque de papier sur chaque trou traversant correspondant.

Prenez en sandwich les disques de papier en enregistrant et en superposant la deuxième feuille de polystyrène. Vérifiez l’alignement général avant de coller le sandwich dans une plastifieuse thermique. Ensuite, commencez les modifications chimiques de surface sur les disques de papier en insérant le dispositif laminé dans une chambre à plasma.

Activez brièvement la surface du papier avec du plasma d’oxygène lors de la libération du vide de la chambre, transférez immédiatement le dispositif en papier dans la solution de cylindre et incubez pendant 30 minutes. Réglez la température ambiante. Éliminez les voies de suspension en excès en rinçant l’appareil avec cinq millilitres d’éthanol à 200 degrés.

Ensuite, incubez l’appareil avec la solution de liaison A-G-M-B-S pendant 15 minutes. Réglez la température ambiante. Éliminez l’excès de molécule de liaison avec de grandes quantités de rinçage à l’éthanol.

Ensuite, incubez l’appareil avec de l’avadon pendant une heure à quatre degrés Celsius et retirez l’avadon non lié avec un lavage PBS de cinq millilitres. Le dispositif peut ensuite passer à l’étape de liaison des anticorps ou être stocké à quatre degrés Celsius pendant quatre semaines si nécessaire. Une fois la fixation d’Aden, pipetez 10 microlitres de solution de blocage sur les régions exposées du disque de papier et incubez le papier pendant 10 minutes.

À température ambiante, répétez l’ajout de 10 microlitres de solution de blocage et l’incubation à température ambiante de 10 minutes. Deux fois de plus pour terminer la biofonctionnalisation du substrat de papier exposé, pipetez 10 microlitres des molécules de capture biotinylées sur les disques et incubez pendant 10 minutes À température ambiante pour les vésicules extracellulaires, les molécules de capture de choix peuvent être soit des anticorps anti CD 63, soit un xin cinq. Répétez le pipetage de 10 microlitres et les processus d’incubation de 10 minutes.

Deux fois de plus après la capture de la fixation de la molécule. Lavez les fractions en excès par pipetage. 10 microlitres du tampon de lavage approprié sur chaque disque de papier.

Incuber le lavage pendant une minute à température ambiante et répéter deux fois les étapes de lavage de 10 microlitres et d’incubation d’une minute. Le dispositif en papier entièrement fonctionnalisé est maintenant prêt pour isoler les vésicules extracellulaires du sérum ou de l’humeur aqueuse Pour le traitement du sérum. Prélevez 10 millilitres de sang périphérique dans une sonde vacutainer et retournez doucement la sonde cinq fois.

Placez le tube en position verticale et attendez 30 minutes. Réglez la température ambiante, centrifugez l’échantillon de sang pendant 15 minutes. Réglez la température ambiante.

Transférez la couche supérieure de sérum transparent dans un tube en plastique propre et jetez la phase semi-solide inférieure. Clarifiez le sérum à une vitesse de centrifugation plus élevée pendant 30 minutes. Réglez la température ambiante.

Transférez le surnageant dans un tube frais et éliminez les particules fines en passant le surnageant à travers un filtre de 0,8 micromètre. Le sérum filtré obtenu peut être utilisé immédiatement ou stocké à moins 80 degrés Celsius. Si les vésicules extracellulaires doivent être extraites de l’humeur, collectez l’humeur aqueuse des patients directement par des procédures invasives et stockez les échantillons à moins 80 degrés Celsius.

Jusqu’à l’utilisation, aucune étape de filtration ou de clarification n’est nécessaire pour les échantillons d’humeur vitreuse. Pour isoler les vésicules extracellulaires du sérum ou de l’humeur aqueuse, placez une pipette de cinq microlitres de l’échantillon biologique sur chaque disque de substrat en papier biofonctionnalisé. Incuber le spot pendant une minute à température ambiante et répéter le pipetage de cinq microlitres et les processus d’incubation d’une minute.

Deux fois de plus Après la liaison par affinité, rincez les vésicules non liées en pipetant d’abord 10 microlitres du tampon de lavage approprié. Incuber le tampon pendant une minute à température ambiante et répéter le lavage de 10 microlitres et l’incubation ultérieure. Pas deux fois de plus.

Les vésicules extracellulaires capturées sont maintenant prêtes pour les tests en aval suivants afin de fixer les vésicules capturées sur la pipette de support en papier fonctionnalisée 10 microlitres de 0,5 x fixateur karnofsky sur chaque disque en papier. Laissez la réaction de réticulation se dérouler à température ambiante pendant 10 minutes et rincez tous les disques avec de grandes quantités de PBS pendant cinq minutes. Ensuite, déshydratez les supports de papier en appliquant les lavages suivants dans l’ordre.

Une incubation à 35 % d’éthanol, deux incubations à 50 % d’éthanol, deux incubations à 70 % d’éthanol, deux incubations à 95 % d’éthanol et quatre incubations à 100 % d’éthanol. Pour chaque lavage individuel, laissez la solution d’éthanol incuber sur les disques de papier à température ambiante pendant 10 minutes. Lorsque l’appareil en papier est à sec, enduisez les échantillons d’une couche de 18 nanomètres de palladium et d’or dans une pulvérisation métallique.

Insérez l’échantillon dans un microscope électronique à balayage et effectuez une microscopie à cinq kilovolts pour éviter une charge excessive de l’échantillon biologique afin de détecter les vésicules capturées par immunodosages. Commencez par ajouter cinq microlitres d’anticorps primaires anti-CD neuf sur chaque disque de papier et incubez à température ambiante pendant une minute. Éliminez tous les anticorps non liés en lavant l’appareil en papier avec 30 millilitres de PBS à température ambiante par agitation mécanique.

Ensuite, pipetez cinq microlitres d’anticorps secondaire conjugué de peroxydase de raifort sur chaque papier. Disque et incubation à température ambiante pendant une minute. Lavez l’appareil avec 30 millilitres de PBS par agitation mécanique pour éliminer les anticorps secondaires non liés.

Enfin, ajoutez cinq microlitres de mélange de couleur et de substrat métrique sur chaque disque. Incuberez la réaction à température ambiante pendant 20 à 30 minutes et numérisez le changement d’intensité des couleurs d’accompagnement qui en résulte à l’aide d’un scanner de bureau. Pour commencer, isolez les disques de papier individuels de l’appareil en vrac en coupant les régions de l’excès de polystyrène laminé à l’aide de ciseaux ou d’une lame de rasoir.

Placez chaque disque de papier dans une micro-centrifugeuse propre de 1,5 millilitre. Deux lys les vésicules capturées en ajoutant 265 microlitres de tampon de lyse. Et 35 microlitres de support d’élimination du polysaccharide à base de PVP à chaque tube vortex vigoureusement.

Pour assurer la vésicule complète, la lyse et le délogement des molécules d’ARN libérées, ajoutez 30 microlitres de solution homogénée dans le vortex de lysat pour mélanger et incuber le tube sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, ajoutez 330 microlitres de mélange de phénol chloroforme acide au lysat pour assurer une séparation appropriée de l’ARN des protéines et de l’ADN pendant au moins 15 secondes par tube. Centrifugez le tube à pleine vitesse pendant cinq minutes.

À température ambiante, transférez la phase aqueuse supérieure contenant l’ARN dans un tube frais de 1,5 millilitre et jetez la phase organique inférieure. Ajoutez 1,25 volume aqueux d’éthanol à 100 % à l’ARN et utilisez un vortex brièvement pour mélanger. Appliquez ensuite le mélange sur une colonne d’extraction solide d’ARN commerciale.

Centrifugez le tube pendant 15 secondes à température ambiante et jetez la fraction d’écoulement. Lavez la colonne en ajoutant 700 microlitres de solution de travail. Tout d’abord, centrifugez le tube pendant cinq à 10 secondes et jetez le flux.

Ensuite, lavez la colonne avec 500 microlitres de solution de travail. Deuxièmement, centrifugez le tube pendant cinq à 10 secondes. Jetez le liquide et répétez le lavage une fois de plus.

Retirez tout résidu d’éthanol avec un dernier tour d’une minute à température ambiante et transférez la colonne d’extraction séchée dans un tube frais de 1,5 millilitre. Ajouter 100 microlitres d’eau préchauffée sans ARN R. Centrifugez le tube à pleine vitesse pendant cinq à 10 secondes et jetez la colonne d’extraction supérieure si nécessaire.

Concentrez et purifiez davantage l’ARN EIT à l’aide d’un kit de nettoyage commercial de l’ARN utilisant de la biotine marquée par fluorescence. En tant que reporter pour la mobilisation de surface. L’efficacité et la spécificité du protocole de fonctionnalisation du papier peuvent être observées en comparant la fluorescence élevée encourue sur la surface modifiée par la réticulation par rapport aux surfaces de papier non fonctionnalisées.

De plus, lorsque la molécule rapporteure est remplacée par un anticorps anti CD 63 biotinylé, le substrat en papier correctement fonctionnalisé facilitera un taux de capture des vésicules extracellulaires plus élevé par rapport à un substrat en papier témoin négatif. Lorsque différentes molécules de capture sont immobilisées sur des substrats en papier, différents sous-groupes de vésicules extracellulaires semblent présenter des distributions de taille différentes à l’aide du dispositif en papier. On peut également tester à la fois le contenu en ARN intravésical et l’abondance de protéines de surface spécifiques aux vésicules.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de répondre à l’augmentation des cellules extracellulaires à l’aide d’un appareil sur papier.