Name: Imagerie en direct de la nicotine induit la signalisation du calcium et de la libération de neurotransmetteurs long ventrales hippocampe axones (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Découvrez une préparation génique chimérique du circuit hippocampo-accumbens ventral pour l'imagerie en direct des mécanismes synaptiques pré et post-synaptiques. Cette méthode permet d'étudier la transmission glutamatergique et la plasticité synaptique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions Yehui Qin et Mallory Myers pour le soutien technique. Nous remercions également le Dr Sigismund Huck de nous avoir fourni l’anticorps anti-α4-ECD. Ce travail est soutenu par une subvention des National Institutes of Health NS22061 à L. W. R.

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire (NIH Publications n ° 80-23, révisé 2012) et des études ont été approuvés par Institutional Animal Care et à utiliser pour les comités de recherche à Stony Brook University (# 1618 et # 1792). 1. vHipp ANCC synaptiques Co-cultures <ol><li> souris Sacrifice (jour postnatal 0 - 3, de type sauvage (WT) ou nAChRs α7 de ligne de souris transgénique) avec CO 2. Décapitez chaque chiot et enregistrer la queue dans un tube de 1,5 ml de centrifugeuse pour le génotypage post facto. Effectuez les étapes suivantes dans une hotte stérile. </li><li> Retirez le sommet du crâne avec des ciseaux et des pinces pour exposer l&#39;ensemble du cerveau. À partir de la jonction où les cortex cérébraux partie caudale de l&#39;autre, d&#39;obtenir une section coronale qui contient les cortex postérieur dont la vHipp 5,21 sous un microscope à dissection. </li><li> Disséquer vBandes de tissu Hipp contenant la région CA1-subiculum selon un cerveau de souris en développement atlas 22 (figure 1A). Transfert à une boîte de culture de 35 mm contenant des milieux de culture froid (4 ° C), les couper en petites tranches minces (environ 100 um x 100 um de microslices). </li><li> Pré-incuber 12 mm de poly-D-lysine / laminine lamelles de verre revêtu à l&#39;intérieur 24 des plaques de culture de tissu avec un milieu de culture (~ 500 ul) pendant au moins 30 min à l&#39;étuve à 37 ° C. Retirez le support avant l&#39;étalement microslices. </li><li> Plaque avec une pipette Pasteur polie au feu au centre de la lamelle avec une quantité minimale de médias (~ 50 pi, contenant ~ 20 morceaux de microslices) pour faciliter la fixation des explants. Plate microslices vHipp provenant d&#39;un seul animal (soit le + / + ou - / - génotype de la ligne de α7 transgénique) sur chaque lamelle. </li><li> Après les explants se déposent sur la lamelle, ajouter doucement les médias supplémentaires (~ 100 pi) par ee mur de sorte que le niveau des médias est suffisamment élevé pour couvrir complètement les explants sur la périphérie, mais pas ceux qui sont au centre de la lamelle. </li><li> Après un O / N incubation dans 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur, disperser neurones embryonnaires CNAC de jours 18 en jour 1 souris WT postnatales et ajouter à des explants. <ol><li> Disséquer les tissus CNAC selon un développement du cerveau de la souris atlas 20 (figure 1B). </li><li> Coupez-les en petits morceaux (environ 500 um x 500 um microslices) et transférer dans un tube de 15 ml. </li><li> Traiter avec 0,25% de trypsine (2 ml) pendant 15 min à 37 ° C. Wash Les morceaux de tissus à trois reprises avec les médias de lavage à froid (5 ml, 4 ° C), suivie par un lavage dans des milieux de culture froide (5 ml, 4 ° C). Laisser la suspension reposer pendant 5 min dans chaque étape de lavage, puis versez le surnageant avec précaution. </li><li> Dissocier les cellules par trituration ménagée dans 2 ml de milieux de culture avec une pipette Pasteur légèrement poli-le-feu. </li><li> Transfer suspension cellulaire à un autre tube de 15 ml et on centrifuge à 2000 x rpm pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans des milieux de culture à 1 ml par 6 chiots. Disperser les cellules par pipetage dans les médias à plusieurs reprises avec une pipette Pasteur polie au feu. </li><li> Ajouter 0,25 ml de cellules CNAC dispersées à chaque lamelle avec des explants vHipp. </li><li> Maintenir les cultures dans une humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. Placez des plaques de culture sur des tampons de gaze stérile humide pour stabiliser mécaniquement et maintenir l&#39;humidité, faciliter la formation des synapses. </li></ol></li></ol> 2. Immunocytochemistry <ol><li> Fixer cultures (5 - 7 jours in vitro) en paraformaldéhyde 4% / 4% de saccharose / PBS (~ 500 pi par lamelle, 20 min, RT). </li><li> Perméabiliser les cultures avec 0,25% de Triton X-100 / PBS (~ 500 ul par lamelle couvre-objet, 5 min, RT). </li><li> cultures de bloc avec 10% de sérum âne normale dans PBS (~ 500 pi par lamelle, 30 min, RT) avant Antibody coloration. Incuber avec des anticorps primaires O / N à 4 ° C. Utiliser les anticorps primaires suivants: anti-nAChR (α 4 -ECD 1: 500; anti-sous-unités, α 5 1: 500), anti-glutamate transporteur vésiculaire 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100). </li><li> Laver les anticorps primaires avec du PBS (3 fois / ~ 500 ul par lamelle couvre-objet, 5 min) et ensuite incuber les cultures dans des anticorps secondaires conjugués à de l&#39;Alexa 488 (~ 500 ul par une lamelle couvre-objet,: 500) ou Alexa 594 (~ 500 ul par lamelle couvre- , 1: 500) pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Incuber les cultures à αBgTx conjugué à Alexa 594 (~ 500 ul par une lamelle couvre-objet,: 1000 dans du milieu de culture) pendant 45 min à 37 ° C avant la fixation pour le marquage surface α7 nAChR *. </li><li> Montage et de phoques lamelles. </li><li> Capturez des images avec un microscope à fluorescence équipé d&#39;objectifs Plan-Apochromat (20X avec 0,8 NA ou 63X huile avec 1,4 NA) et une caméra CCD. </li></ol> 3. FM1-43 Based vésiculeuse Fusion <ol><li> Maintenir cultures (5 - 7 jours in vitro) dans une chambre de l&#39;imagerie, monter la chambre sur disque rotatif microscope confocal. Perfuser en continu (1 ml / min) avec HBS cocktail au RT. </li><li> Arrêtez perfusion et de charge cultures avec 10 uM FM1-43 dans 56 mM K + ACSF (~ 500 pi) pendant 90 secondes (coloration), laver colorant externe distance pendant 15 min avec Ca 2+ HBS gratuit contenant ADVASEP-7 (0,1 mM) pour piéger FM1-43 liée à la membrane. </li><li> Stimuler les cultures avec 56 mM K + ACSF (~ 500 pi) sans FM1-43 pendant 120 secondes (décoloration), rechargez cultures avec FM1-43 en utilisant les mêmes conditions, et lavez à nouveau avec Ca 2+ HBS gratuit contenant ADVASEP-7 pour 15 min. </li><li> Acquérir FM1-43 images de fluorescence avec disque rotatif microscope confocal équipé d&#39;un objectif Plan-Apochromat (60X eau avec 1,4 NA, excitation 488 nm, émission 530 nm) et de capturer des images avec une caméra CCD. </li><li> Recueillir base d&#39;images de fluorescence de FM1-43 (tous les 2 s pendant 1 min) Que le contrôle pré-nicotine; appliquer la nicotine (1 uM) par perfusion rapide (2 ml / min) pendant 1 min, puis laver la nicotine avec HBS cocktail. Gardez capture des images en accéléré avant, pendant, et après l&#39;application de la nicotine toutes les 2 secondes pendant 5 min. </li><li> Quantifier FM1-43 intensité de fluorescence avant (F de coloration) et après (F décoloration) l&#39;application de la nicotine à chaque bouton synaptique. </li><li> Calculer la quantité totale de fluorescence de FM1-43 amovible le long des axones vHipp en quantifiant la différence de FM1-43 intensité de fluorescence avant et après l&#39;application de nicotine (AF = F -F coloration de décoloration). Analyser fraction de la diminution de l&#39;intensité de fluorescence après la nicotine avec l&#39;équation suivante: F% = diminution AF / F coloration. </li></ol> 4. Imagerie de calcium <ol><li> Rincer cultures (5 - 7 jours in vitro) rapidement avec HBS normale, puis charger cultures avec 5 uM Fluo-4 Ca 2+ indicateur (ester AM) et 0,02% de Pluronic F-127 dans du HBS (2 ml) pendant 30 min à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Laver Fluo-4 solution avec HBS (3 fois / 5 min). Retour cultures dans l&#39;incubateur (37 ° C / 5% CO 2) pendant au moins 30 min. </li><li> Maintenir les cultures dans la même chambre de l&#39;imagerie et les mêmes conditions que celles décrites dans FM1-43 section de fusion vésiculaire à base (voir l&#39;étape 3.1). </li><li> Recueillir images Fluo-4 fluorescence des projections axonales des micro-tranches vHipp avec un objectif Plan-Apochromat (60X eau avec 1,4 NA, excitation 488 nm, émission 530 nm) et une caméra CCD. </li><li> Recueillir base Fluo-4 images de fluorescence (toutes les 10 sec pendant 2 min) que le contrôle pré-nicotine, appliquer la nicotine (1 uM) par perfusion rapide (2 ml / min) pendant 1 min, puis laver la nicotine avec HBS cocktail. Gardez capture des images en accéléré avant, pendant, et après l&#39;application de la nicotine toutes les 10 secondes pendant 30 min. </li><li> Enregistrer tous les cadres des premières fluo-4 images de fluorescence, l&#39;exportation comme une série deLes images au format TIFF pour pousser l&#39;analyse. </li><li> Recueillir l&#39;intensité intégrée de fluo-4 fluorescence le long des axones vHipp avant et après l&#39;application de la nicotine. </li><li> Normaliser l&#39;intensité de fluorescence intégrée avec l&#39;équation suivante: AF / F 0 = (FF 0) / F 0, où F 0 est la pré-nicotine intensité de fluorescence intégrée de fond corrigé et F est l&#39;intensité de fluorescence intégrée le long des axones vHipp à chaque point de temps après l&#39;application de la nicotine. Analyser et tracer l&#39;intensité de fluorescence intégrée normalisée. </li></ol>

<ol><li>Changeux, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+nicotinic+receptors%3A+structure+and+regulation%2C+role+in+learning+and+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement.</a> Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).</li>
<li>Levin, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+receptor+subtypes+and+cognitive+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Nicotinic receptor subtypes and cognitive function.</a> J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).</li>
<li>Dani, J. A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+acetylcholine+receptors+and+nicotinic+cholinergic+mechanisms+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).</li>
<li>Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+receptors+and+depression%3A+revisiting+and+revising+the+cholinergic+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis.</a> Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).</li>
<li>Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+elicits+prolonged+calcium+signaling+along+ventral+hippocampal+axons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons.</a> PloS one. 8 (12), e82719(2013).</li>
<li>McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+enhancement+of+fast+excitatory+synaptic+transmission+in+CNS+by+presynaptic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors.</a> Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).</li>
<li>Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+synaptic+transmission+enhanced+by+low+concentrations+of+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine.</a> Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).</li>
<li>Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+alpha+7-+and+beta+2-containing+nicotinic+acetylcholine+receptors+modulate+excitatory+amino+acid+release+from+rat+prefrontal+cortex+nerve+terminals+via+distinct+cellular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms.</a> Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).</li>
<li>Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-synaptic+nicotinic+receptors+evoke+endogenous+glutamate+and+aspartate+release+from+hippocampal+synaptosomes+by+way+of+distinct+coupling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms.</a> Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).</li>
<li>Zappettini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+nicotinic+alpha7+and+non-alpha7+receptors+stimulate+endogenous+GABA+release+from+rat+hippocampal+synaptosomes+through+two+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action.</a> PloS one. 6 (2), e16911(2011).</li>
<li>Fabian-Fine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+distribution+of+the+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus.</a> J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).</li>
<li>Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+bungarotoxin-1.4+nm+gold%3A+a+novel+conjugate+for+visualising+the+precise+subcellular+distribution+of+alpha+7%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).</li>
<li>Nashmi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+alpha4beta2+nicotinic+acetylcholine+receptors+assessed+with+functional+fluorescently+labeled+subunits%3A+effects+of+localization%2C+trafficking%2C+and+nicotine-induced+upregulation+in+clonal+mammalian+cells+and+in+cultured+midbrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons.</a> J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).</li>
<li>Drenan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+trafficking%2C+pentameric+assembly%2C+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+alpha6+and+beta3+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits.</a> Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological%2C+pharmacological%2C+and+molecular+evidence+for+alpha7-nicotinic+acetylcholine+receptors+in+rat+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons.</a> J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).</li>
<li>Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+beta2+subunit-containing+and+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptors+differentially+control+glutamatergic+and+cholinergic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling.</a> J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).</li>
<li>Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+changes+induced+by+different+presynaptic+nicotinic+receptors+in+separate+populations+of+individual+striatal+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals.</a> J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).</li>
<li>Richards, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+alpha4%2A+nicotinic+receptors+revealed+by+superecliptic+phluorin%3A+effects+of+a+beta4+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+mutation+and+chronic+exposure+to+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).</li>
<li>Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+trafficking+and+up-regulation+of+nicotinic+ACh+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).</li>
<li>St John, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+trafficking+of+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors.</a> Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+type+III+neuregulin+1+is+required+for+sustained+enhancement+of+hippocampal+transmission+by+nicotine+and+for+axonal+targeting+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).</li>
<li>Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobowitz%2C+DM+%22Chemoarchitectonic+Atlas+of+the+Developing+Mouse+Brain%22">Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain</a>. , CRC Press. New York. (1998).</li>
<li>Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+fluorescent+staining+and+destaining+of+living+vertebrate+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).</li>
<li>Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+fluorescent+styryl+dye+FM1-43+to+visualize+synaptic+vesicles+exocytosis+and+endocytosis+in+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals.</a> Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).</li>
<li>Garduno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+alpha4beta2+nicotinic+acetylcholine+receptors+increase+glutamate+release+and+serotonin+neuron+excitability+in+the+dorsal+raphe+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus.</a> J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).</li>
<li>Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+and+exogenous+ACh+activates+different+nicotinic+receptors+to+enhance+evoked+glutamatergic+transmission+in+the+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus.</a> J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).</li>
<li>Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+nicotine+on+spiking+activity+and+Ca2%2B+dynamics+of+dendritic+spines+in+rat+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons.</a> Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

La préparation de co-culture décrit re-capitule circuits de l&#39;hippocampe-accumbens ventrales in vitro. Cet examen permet de préparation relativement simple et fiable des profils spatiaux et temporels qui activation des nAChR pré-synaptiques susciter améliorée transmission glutamatergique 5, 21. Co-cultures sont définis comme la croissance de différents types de cellules spécifiques dans un plat qui peut fournir des conditions physiologiques in vitro pour démo...

Modulation cholinergique du circuit excitabilité contribue à des aspects fondamentaux de la cognition, et la modulation cholinergique modifié est une caractéristique de neurodégénératives et neuropsychiatriques troubles y compris la maladie d&#39;Alzheimer, la maladie de Parkinson, la schizophrénie et la toxicomanie 1-4. Un mécanisme établi de la facilitation de la transmission synaptique cholinergique dans le SNC est via l&#39;activation directe de nAChRs localisées sur des sites pré-synaptiques. L&#39;activation de ces récepteurs pré-synaptiques entraîne une augmentation de Ca 2+ intracellulaire ([Ca2 +] i) dans les terminaux présynaptiques - à la fois directement, en raison de la conductance de calcium relativement élevé de certains sous-types de nAChR, et indirectement, par l&#39;intermédiaire de cascades de signalisation intracellulaires 5, améliorant ainsi la libération de neurotransmetteurs. En effet, l&#39;activation des nAChR pré-synaptiques a été liée à des changements dans la libération d&#39;une grande variété de neurotransmetteurs, y compris le glutamate, GABA, acétylcholine, une dopamine 6-10. Bien que ce processus a été étudié indirectement en utilisant des méthodes électrophysiologiques à divers synapses, les journalistes optiques de [Ca 2+] i et vésicule synaptique recyclage permettent de mesurer plus directe et temporellement précise des phénomènes pré-synaptiques. Localisation pré-synaptique de nAChR a été démontré de façon convaincante direct étiquetage immuno-or de nAChRs au microscope électronique (EM) de niveau 11,12. Plusieurs autres techniques ont également été utilisés pour traiter la localisation nAChR indirectement, y compris la détection de l&#39;emplacement des chimères protéiques fluorescents de nAChR dans des neurones en culture 13,14, enregistrement électrophysiologique des courants nAChR dans les terminaux synaptiques 15,16, la surveillance des changements induits par la nicotine en [Ca 2+] i dans les terminaisons nerveuses synaptiques par imagerie de cellules vivantes 17, et la surveillance indirecte de la libération des neurotransmetteurs à la terminaison synaptique partechniques d&#39;imagerie cellulaire en direct avec des indicateurs fluorescents, y compris l&#39;exocytose des vésicules synaptiques vus par les colorants de styryle amphipathiques FM (FM1-43 et FM4-64) et / ou synapto-pHluorin et par des journalistes de neurotransmetteurs fluorescentes spécifiques, tels que CNiFERs pour ACh et iGluSnFr pour le glutamate 18-20. Globalement, ces approches actuelles pour identifier la localisation pré-synaptique de nAChRs sont complexes, et nécessitent des systèmes et des techniques spéciales pour permettre une identification fiable et surveillance physiologique de l&#39;activité pré-synaptique. Nous décrivons ici les protocoles et l&#39;équipement pour un système de co-culture in vitro d&#39;un hippocampe ventral (vHipp) - noyau accumbens (NACC) circuit qui offre un accès direct à identifier et analyser les deux composants pré et post-synaptiques de la transmission synaptique. Nous montrons des exemples de localisation pré-synaptique de nAChRs et l&#39;imagerie des cellules vivantes de nAChR médiation Ca 2+ signalisation et de la libération de neurotransmetteurs aloaxones ng vHipp. Une extension naturelle (et simple) du protocole présenté ici est la préparation des contacts pré- et post-synaptiques constitués de neurones à partir de différents génotypes. De cette manière, la contribution d&#39;un produit de gène particulier de la pré- et / ou post-synaptiques des mécanismes de modulation peut être évaluée directement.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Milieux de culture (50 ml)</td></tr><tr><td>Neurobasal&nbsp ;</td><td>GIBCO</td><td>10888022</td><td>48 ml</td></tr><tr><td>Suppléments de B-27</td><td>GIBCO</td><td>0080085-SA</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>GIBCO</td><td>10908-010</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>Supplément de GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>Facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td colspan="4">2. Milieu de lavage (HBSS, 100 ml)</td></tr><tr><td>HBSS, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol</td><td>GIBCO</td><td>14175-095</td><td>99 ml</td></tr><tr><td>HEPES ( 1M)</td><td>GIBCO</td><td>15630-130</td><td>1 ml</td></tr><tr><td colspan="4">3. SALINE tamponnée HEPES&nbsp ; (HBS)&nbsp ; &nbsp ; pH = 7,3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp ;</td><td>135 millions d’euros</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333² ;</td><td>5 millions d’euros</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp ;</td><td>1 million d’euros</td></tr><tr><td>CaCl2,Sigma</td><td></td> <td>C1016&nbsp ;</td><td>2 millions d’euros</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp ;</td><td>10 millions d’euros</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G0350500</td><td>10 millions d’euros</td></tr><tr><td colspan="4">4. HBS Cocktail pour l’imagerie en direct pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp ;</td><td>135 millions d’euros</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333² ;</td><td>5 millions d’euros</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp ;</td><td>1 million d’euros</td></tr><tr><td>CaCl2,Sigma</td><td></td> <td>C1016&nbsp ;</td><td>2 millions d’euros</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp ;</td><td>10 millions d’euros</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G0350500</td><td>10 millions d’euros</td></tr><tr><td>tétrodotoxine&nbsp ;</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td>2 & micro ; M</td></tr><tr><td>bicuculline</td><td>Tocris</td><td>131</td><td>10 & micro ; M</td></tr><tr><td>D-AP-5</td><td>Tocris</td><td>105</td><td>50 & micro ; M</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>1045</td><td>20 & micro ; M</td></tr><tr><td>LY341495</td><td>Tocris</td><td>1209</td><td>10 & micro ; M</td></tr><tr><td colspan="4">5. Sans calcium&nbsp ; HBS&nbsp ; &nbsp ; pH = 7,3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp ;</td><td>135 millions d’euros</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333² ;</td><td>5 millions d’euros</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp ;</td><td>1 million d’euros</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp ;</td><td>10 millions d’euros</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G0350500</td><td>10 millions d’euros</td></tr><tr><td colspan="4">6.56 mM Potassium ACSF pH=7.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>119 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>56 mM</td></tr><tr><td>MgSO4.7H</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td>1.3 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>2.5 mM</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>26.2 mM</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G0350500</td><td>10 millions d’euros</td></tr></tbody></table>

imagerie en direct de la nicotine induit la signalisation du calcium et de la libération de neurotransmetteurs long ventrales hippocampe axones

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

L’amélioration soutenue de la signalisation axonale et l’augmentation de la libération de neurotransmetteurs par l’activation des récepteurs nicotiniques pré-synaptiques de l’acétylcholine (nAChRs) constituent un mécanisme important de la neuromodulation par l’acétylcholine (ACh). La difficulté d’accès pour sonder les mécanismes de signalisation à l’intérieur des axones intacts et des terminaisons nerveuses in vitro et in vivo a limité les progrès dans l’étude des composants pré-synaptiques de la plasticité synaptique. Ici, nous introduisons une préparation génique-chimérique du circuit hippocampique ventral (vHipp)-accumbens (nAcc) in vitro qui permet l’imagerie directe en direct pour analyser à la fois les composants pré- et post-synaptiques de la transmission tout en faisant varier sélectivement le profil génétique des neurones pré- vs post-synaptiques. Nous démontrons que les projections des microtranches vHipp, en tant qu’entrée axonale pré-synaptique, forment plusieurs synapses glutamatergiques fiables avec des cibles post-synaptiques, les neurones dispersés de nAcc. La localisation pré-synaptique de divers sous-types de nAChR est détectée et la transmission synaptique médiée par la signalisation nicotinique pré-synaptique est surveillée par enregistrement électrophysiologique simultané et imagerie de cellules vivantes. Cette préparation fournit également une approche informative pour étudier les mécanismes pré- et post-synaptiques de la plasticité synaptique glutamatergique in vitro.

La préparation employée se compose de gènes chimère co-cultures de circuits vHipp ANCC in vitro. Projections émanant microslices vHipp, comme entrée axonale pré-synaptique, peuvent faire des contacts synaptiques avec les objectifs post-synaptiques, les neurones dispersés du CNAC. La nicotine induit une (≥ 30 min) la facilitation de la transmission glutamatergique soutenue à partir de neurones CNAC innervés par vHipp axones 21 et prolongée calcium signalisation le long des axones vHipp 5 vi...

Nous avons développé une préparation génique-chimérique du circuit hippocampique ventral – accumbens in vitro qui permet l’imagerie directe en direct pour analyser les mécanismes présynaptiques de la transmission synaptique médiée par les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (nAChR). Cette préparation fournit également une approche informative pour étudier les mécanismes pré- et post-synaptiques de la plasticité synaptique.

Imagerie en direct de la nicotine induit la signalisation du calcium et de la libération de neurotransmetteurs long ventrales hippocampe axones

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

L'objectif général de cette procédure est de générer une préparation chimérique génique du circuit hippocampe ventral-accumbens in vitro permettant une imagerie directe en temps réel afin d'identifier et d'analyser les composants pré- et post-synaptiques de la transmission synaptique. Cette étape est réalisée en premier lieu en disséquant des bandes de tissu hippocampique ventral contenant la région CA1-CIC. La deuxième étape consiste à découper les bandes hippocampiques ventrales en fines tranches minces, puis à placer ces microtranches au centre de la lamelle dans la plaque de culture tissulaire à 24 puits pendant une nuit.Ensuite, disséquer le noyau accumbens à partir des tissus cérébraux. La dernière étape consiste à dissocier les fragments de noyau accumbens en neurones dispersés à l'aide de trypsine, puis à ajouter les neurones du noyau accumbens sur la lamelle préalablement ensemencée avec des implants de l'hippocampe ventral, et à incuber pendant cinq à sept jours. Enfin, analyser la localisation présynaptique des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine ainsi que la signalisation calcique et la libération de neurotransmetteurs médiées par ces récepteurs.Les axones du hippocampe ventral peuvent être identifiés et suivis par imagerie en temps réel de cellules vivantes au moyen d'un microscope confocal à disque tournant. Le principal avantage de cette technique est que la préparation en co-culture de microtranches permet une reconnaissance aisée des exons pré-synaptiques et des cibles post-synaptiques. In vitro, la préparation en co-culture recrée le circuit du hippocampe ventral vers le noyau accumbens in vitro.Ceci permet une imagerie directe en temps réel des compartiments pré- et postsynaptiques, séparément ou simultanément. Cette préparation synaptique in vitro autorise une imagerie à haute résolution des effets spatiaux et temporels de l'activation des récepteurs pré-synaptiques sur la transmission synaptique glutamatergique. Par conséquent, on peut obtenir des informations sur les mécanismes pré- et postsynaptiques contribuant à la plasticité synaptique glutamatergique avant la collecte du tissu.Pré-incuber des lamelles en verre de 12 millimètres recouvertes de polylysine laminine dans des plaques de culture tissulaire à 24 puits contenant 500 µL de milieu de culture à 37 °C pendant au moins 30 minutes. Ensuite, retirer le milieu avant de déposer les microtranches afin de recueillir le tissu en culture. Retirer le sommet du crâne pour exposer l'ensemble du cerveau de chaque petit sacrifié sous un microscope stéréoscopique.À partir de la jonction où les corticaux cérébraux se séparent l'un de l'autre, procédez à une coupe coronale contenant les corticaux postérieurs, y compris les hippo.Campi ventraux. Ensuite, disséquez les tissus hippocampiques ventraux contenant les régions du ca un seum. Puis, transférez les tissus dans une boîte de culture de 35 millimètres contenant un milieu de culture froid.Ensuite, découper davantage les tissus en fines tranches petites. Déposer les tranches au centre de la lamelle à l’aide d’une pipette Pasteur polie à la flamme. Ajouter 50 microlitres de milieu pour faciliter l’attachement des explants x.Ensuite, plaquez les microtranches de l'hippocampe ventral sur le lamelle après que les explants X se soient déposés délicatement sur le lamelle, ajoutez 100 microlitres de milieu supplémentaire le long de la paroi afin que le niveau du milieu soit suffisamment élevé pour recouvrir complètement les explants situés en périphérie, mais pas ceux situés au centre du lamelle. Incubez ensuite les explants toute la nuit à 5 % de CO2 et à 37 degrés Celsius avant la dispersion des neurones du noyau accumbens. Prélèvez maintenant les tissus du noyau accumbens entre le 18e jour embryonnaire et le 1er jour postnatal chez des souris de type sauvage, découpez-les en petits morceaux, puis transférez-les dans un tube de 15 millilitres.Traitez les tissus avec deux millilitres de trypsine à 0,25 % pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les tissus trois fois avec cinq millilitres de milieu de lavage à 4 degrés Celsius et laissez la suspension reposer pendant cinq minutes à chaque étape de lavage. Puis lavez les tissus dans cinq millilitres de milieu de culture à 4 degrés Celsius.Ensuite, dissocier les cellules par agitation douce dans deux millilitres de milieu de culture à l’aide d’une pipette Pasteur légèrement polie à la flamme. Puis, transférer la suspension cellulaire dans un autre tube de 15 millilitres et centrifuger à 2000 tr/min pendant cinq minutes. Au bout de cinq minutes, éliminer le surnageant S et resuspendre les cellules dans le milieu de culture à raison d’un millilitre par six portées, puis disperser les cellules en pipetant doucement plusieurs fois le milieu à l’aide d’une pipette Pasteur polie à la flamme.À la fin, ajoutez 25 millilitres des cellules du noyau accumbens dispersées sur chaque lame recouverte de fragments explantés de l'hippocampe ventral. Placez les plaques de culture sur des compresses stériles humidifiées afin de stabiliser mécaniquement et de maintenir l'humidité pour faciliter la formation des synapses. Incubez ensuite les plaques à 5 %CO2 à 37 degrés Celsius.Dans cette procédure, transférez les cultures dans une chambre d'imagerie une par une. Montez la chambre sur le microscope confocal à disque tournant. Perfusez continuellement l'échantillon avec le cocktail HBS à un débit d'un millilitre par minute à température ambiante.Ensuite, arrêtez la perfusion et coloriez la culture avec du FM 1-43 à 10 micromolaire dans un liquide céphalorachidien A contenant 56 millimolaire de potassium pendant 90 secondes. Puis, éliminez le colorant externe par un lavage de 15 minutes avec du HBS sans calcium contenant 0,1 millimolaire d'A-D-V-A-S-E-P sept. Après cela, désactivez la stimulation de la culture avec du liquide céphalorachidien A contenant 56 millimolaire de potassium, sans FM 1-43, pendant 120 secondes.Pour la rétention. Rechargez la culture avec FM 1 43 dans les mêmes conditions et rincez à nouveau avec du HBS sans calcium contenant A-D-V-A-S-E-P sept pendant 15 minutes. Acquérez maintenant les images fluorescentes de FM 1 43 à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif équipé d’un objectif plan apochromatique, et capturez les images avec une caméra CCD.Acquérir les images fluorescentes de base avec le FM 1-43 toutes les deux secondes pendant une minute, comme témoin avant l'ajout de nicotine. Ensuite, appliquer une concentration d'une micromolaire de nicotine par perfusion rapide à deux millilitres par minute pendant une minute, avant de laver la nicotine avec le cocktail HBS. Continuer à acquérir les images en laps de temps avant, pendant et après l'application de la nicotine, toutes les deux secondes pendant cinq minutes.À cette étape, rincez rapidement les cultures avec du HBS normal. Ensuite, chargez les cultures avec un indicateur calcique fluo-4 à cinq micromoles et 0,02 % de Pluronic F127 dans deux millilitres de HBS pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Après cela, éliminez la solution de fluo-4 en lavant trois fois avec du HBS, chaque lavage durant cinq minutes.Replacer les cultures dans l'incubateur pendant au moins 30 minutes. Ensuite, transférer les cultures une par une dans la chambre d'observation. Dans les mêmes conditions que celles décrites dans les protocoles de fusion vésiculaire basés sur FM 1 43.Recueillir les images fluorescentes de base de flu oh quatre des projections axonales issues des microtranches ventrales de l'hippocampe comme témoin pré-nicotine. Ensuite, appliquer un micromolaire de nicotine par perfusion rapide à deux millilitres par minute pendant une minute, puis éliminer la nicotine à l'aide du cocktail HBS. Continuer à acquérir les images en laps de temps avant, pendant et après l'application de la nicotine toutes les 10 secondes pendant 30 minutes.Cette figure montre directement que les projections provenant des minces tranches microscopiques de l'hippocampe ventral sont glutamatergiques et que les contacts s'établissent avec des neurones GABAergiques dispersés. Des neurones moyennement épineux du noyau accumbens ont révélé la présence de récepteurs nicotiniques à l'acétylcholine alpha sept et non alpha sept le long des axones de l'hippocampe ventral, et plus précisément au niveau des sites où les projections de l'hippocampe ventral entrent en contact avec les neurones du noyau accumbens. Il convient de noter que les neurones dispersés du noyau accumbens n'expriment pas les récepteurs nicotiniques à l'acétylcholine alpha sept, ce qui signifie que les agrégats de récepteurs au niveau des contacts sont strictement présynaptiques.Les images en lapse de temps de la fluorescence calcique de la fluo 4 le long des axones hippocampiques ventraux ont été acquises à l’aide d’un objectif à immersion dans l’eau de 60 x toutes les 10 secondes pendant 30 minutes, au microscope confocal à disque tournant. Les images acquises ont été représentées selon une échelle de pseudocouleurs et lues sous forme de vidéo à raison de deux images par seconde. Cette vidéo montre qu’une application de nicotine induit une activité soutenue de la fluorescence calcique de la fluo 4 le long des axones hippocampiques ventraux vivants de type sauvage.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'ensemencer les microexplants de l'hippocampe ventral dans un volume minimal de milieu et de maintenir les plaques de culture sur des chemins stéréo humides. Ces étapes sont cruciales pour l'attachement des microexplants, l'expansion des prolongements et la formation des synapses. Ainsi, cette coculture permet de faire varier indépendamment les génotypes des entrées présynaptiques et de leurs cibles postsynaptiques.En outre, cela permet une expression sélective de gènes exogènes dans l'un ou l'autre compartiment de manière indépendante. Cela présente un grand potentiel pour analyser les mécanismes présynaptiques et postsynaptiques de la plasticité synaptique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez comprendre comment générer des cocultures synaptiques chimériques pour gènes, qui recréent le circuit allant de l'hippocampe ventral au noyau accumbens.Vous devriez alors être en mesure d'utiliser des techniques d'imagerie en direct pour analyser les neurones pré- et post-synaptiques.

live-imaging-nicotine-induced-calcium-signaling-neurotransmitter

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Nous avons développé une nouvelle technique de quantification des changements récepteurs de l'acétylcholine nicotiniques au sein des régions subcellulaires de sous-types spécifiques de neurones du SNC afin de mieux comprendre les mécanismes de dépendance à la nicotine en utilisant une combinaison d'approches, y compris le marquage fluorescent protein du récepteur à l'aide du knock-in approche et spectrale imagerie confocale.

Spectral imagerie confocale de fluorescence tels taggés récepteurs nicotiniques dans souris knock-in avec l&#39;administration chronique de nicotine

Cette vidéo montre le processus de préparation des tissus de l’hippocampe ventral et du noyau accumbens à partir de cerveaux de souris pour la co-culture. Les neurones étendent les projections pour former des connexions synaptiques entre les tissus de l’hippocampe ventral et du noyau accumbens. Cette méthode permet d’étudier les interactions neuronales entre ces deux régions du cerveau, offrant des informations sur la cognition, le comportement et les troubles neurologiques.

Co-culture de l’hippocampe ventral et du noyau accumbens

Cette vidéo montre comment l’activation des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine dans l’hippocampe ventral de la souris par la nicotine entraîne une signalisation calcique soutenue le long des axones.

Imagerie de la signalisation calcique induite par la nicotine le long des axones ventraux de l’hippocampe dans des co-cultures synaptiques

Source : Bancroft, E. A., et al. Quantification de Ca2+ flux et leurs effets en aval dans les neurones primaires du mésencéphale de la souris. J. Vis. Exp. (2020) &lt;p style='line-height :1.2 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;' dir='ltr'&gt;Cette vidéo démontre la visualisation en temps réel de l’afflux de calcium dans les neurones du mésencéphale ventral dérivé d’embryons de souris. À l’aide d’un vecteur viral pour exprimer un indicateur calcique, les neurones sont imagés au microscope...

Visualisation de l’afflux de calcium dans les neurones du mésencéphale ventral dérivé d’embryons de souris

&lt;p style='line-height :1.38 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;' dir='ltr'&gt;Source : Lark, A. R., et. al., approche d’imagerie cérébrale fonctionnelle in vivo basée sur l’indicateur de calcium bioluminescent GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo montre l’imagerie en temps réel de la dynamique calcique à l’aide de la bioluminescence de la protéine fluorescente verte-aequorin dans Drosophila’s structures cérébrales profondes.

Imagerie par bioluminescence pour l’étude des transitoires calciques dans les structures cérébrales de la drosophile

Cet article présente une méthode pour l’étude des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (Nachr) dans des coupes de cerveau de souris par la nicotine uncaging. Lorsqu’il est couplé avec enregistrement de simultanée patch clamp et 2 photons laser, microscopie à balayage, la nicotine uncaging relie fonction des récepteurs nicotiniques avec une morphologie cellulaire, offrant une meilleure compréhension de la neurobiologie cholinergique.

Sonder la fonction des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine dans les coupes de cerveau de souris par photolyse éclair au Laser de la Nicotine Photoactivatable

Cette méthode décrit une préparation chronique qui permet un accès optique à l'hippocampe de souris vivantes. Cette préparation peut être utilisée pour effectuer l'imagerie optique longitudinale de la plasticité structurale neuronale et de la plasticité cellulaire suscitée par l'activité sur une période de plusieurs semaines.

Imagerie longitudinale à deux photons de l'hippocampe dorsal CA1 chez les souris vivantes

Ici nous présentons un protocole avec lequel le calcium pré- et/ou postsynaptic peut être visualisé dans le contexte de l'apprentissage et de la mémoire de Drosophila. L'imagerie in vivo de calcium utilisant des capteurs de calcium synaptically localisés est combinée avec un paradigme olfactif classique de telle sorte que la plasticité synaptique sous-jacente à ce type d'apprentissage associatif peut être déterminée.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster In Vivo

Le protocole actuel démontre une méthode simple pour tracer les projections de glutamate de l’aire tegmentale ventrale (VTA) vers l’hippocampe. La photostimulation des neurones du glutamate VTA a été combinée à l’enregistrement CA1 pour démontrer comment les terminaux VTA glutamate modulent la vitesse de tir pyramidale putative CA1 in vivo.

Traçage anatomique et fonctionnel in vivo combiné des terminaux de glutamate de la zone tegmentale ventrale dans l’hippocampe

Cet article démontre la préparation d’une fenêtre de formation image faite sur mesure complétée avec la canule d’infusion et son implantation sur la région CA1 du hippocampe chez les souris.

Procédure de craniotomie pour visualiser les activités neuronales dans l’hippocampe de souris se comportant

Ce protocole décrit l’imagerie calcique GCaMP in vivo de neurones intacts du ganglion du trijumeau (TG). Cette description comprend la chirurgie d’exposition aux TG, l’imagerie par microscopie confocale in vivo des neurones TG, l’application de stimuli somatiques pendant l’imagerie microscopique des neurones TG et l’analyse des données d’imagerie calcique GCaMP in vivo .

In vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions du trijumeau intacts

Découvrez une préparation génique chimérique du circuit hippocampo-accumbens ventral pour l'imagerie en direct des mécanismes synaptiques pré et post-synaptiques. Cette méthode permet d'étudier la transmission glutamatergique et la plasticité synaptique.

Imagerie en direct de la nicotine induit la signalisation du calcium et de la libération de neurotransmetteurs long ventrales hippocampe axones (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie en direct de la nicotine induit la signalisation du calcium et de la libération de neurotransmetteurs long ventrales hippocampe axones

Explorer plus de vidéos