En Vivo Dynamique de la rétine microglial activation cours neurodégénérescence: confocale ophtalmoscopique Imaging and Cell Morphometry dans Souris glaucome

L'objectif général de l'expérience suivante est de caractériser la dynamique des microglies dans un modèle murin de glaucome chronique par imagerie confocale in vivo de la rétine. Cela est réalisé par une ophtalmoscopie confocale mensuelle non invasive, ou CSLO, permettant d'observer les microglies fluorescentes au niveau de la rétine et de la tête du nerf optique. L'analyse d'images en temps réel, utilisant une segmentation seuillée du soma cellulaire et une morpho-quantification, permet de mesurer les changements du nombre de cellules microgliales et de leur activation.

Les résultats montrent que l'imagerie CSLO mensuelle chez des souris vivantes peut être utilisée pour surveiller la cinétique de la distribution de la densité des cellules microgliales et leur activation morphologique lors de la phase initiale d'une neurodégénérescence chronique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'imagerie confocale à deux photons des microglies positives pour la GFP dans le cerveau de souris, est que l'imagerie CSLO de la rétine permet une observation et une surveillance directes des cellules microgliales tout au long de l'évolution des troubles neurodégénératifs liés au vieillissement, dans un organisme intact. J'ai eu pour la première fois l'idée de cette méthode après avoir démontré ex vivo que les microglies présentaient une activation intense et un regroupement dans la région centrale des souris DBA/2J jeunes, à des âges précédant la neurodégénérescence détectable.

Afin de déterminer si ces premiers changements immunitaires innés, survenant avant la détection d’un glaucome, causaient sa neurodégénérescence, nous avons dû mettre en place une approche in vivo pour suivre les modifications des microglies. La procédure d’acquisition d’images en direct sera démontrée par Caesar Romero, technicien dans mon laboratoire. Pour commencer les opérations, démarrez le système CSLO et saisissez les informations de la session. Ensuite, préparez-vous de manière sécurisée à l’imagerie.

Fixez un objectif propre à large champ de 55 degrés. Placez une souris sur la plateforme d'imagerie deux minutes après l'administration de l'anesthésique et dilatez les deux pupilles à l'aide de gouttes mydriatiques. Cinq minutes plus tard, vérifiez que la souris est anesthésiée.

Ensuite, à l’aide d’une pression minimale, recouvrir chaque œil de lentilles de contact. Orienter la souris de manière à ce que l’œil droit soit en contact avec l’objectif et que l’orbite soit parallèle à l’objectif. L’animal n’a pas besoin d’être immobilisé, mais doit être maintenu à une distance constante de l’objectif.

Pendant les 10 à 15 minutes suivantes, l’œil étant aligné, la souris ne bougera pas ni ne clignera des yeux pendant que ses mouvements oculaires sont suivis par le système d’imagerie en direct CSLO. Commencez la session d’imagerie en acquérant une vue du fond d’œil de la rétine interne. Pour cela.

Sélectionnez le mode infrarouge, qui correspond à une longueur d'onde d'excitation de 820 nanomètres. Réglez ensuite la puissance du laser à 100 % et la sensibilité entre 40 et 60 %. Ensuite, en travaillant à grande vitesse, localisez l'œil à l'aide du joystick pour orienter l'ophtalmoscope et préparez-vous à acquérir une vue du fond d'œil du disque optique et du réseau vasculaire rétinien. Examinez la cornée et le cristallin à la recherche de lésions ou d'opacités.

Exclure de l'étude les yeux présentant des défauts ou des lésions susceptibles d'affecter l'acquisition d'images. En rapprochant ensuite l'objectif de l'œil, localiser la région du disque optique, qui correspond à la surface de la tête du nerf optique ou ONH. Centrer ensuite l'image sur la ONH.

Un positionnement correct du CNO est essentiel pour obtenir une mise au point uniforme et une émission homogène sur toute l'image. L'étape suivante consiste à visualiser les plans internes de la rétine ainsi que le CNO. Comme plan focal de référence, utilisez les vaisseaux sanguins principaux situés à la surface vitréenne de la rétine, ce qui correspond à 59 et 60 dioptries, voire davantage en profondeur à 55 dioptries dans les zones de disque optique excavé.

Ensuite, ajustez la saturation de l'image à l'aide du bouton sur le panneau tactile jusqu'à ce qu'un halo blanc d'illumination couvre la majeure partie du fond d'œil autour du disque optique. Puis sélectionnez la saturation inférieure qui produit un halo uniforme, indicatif d'un contraste optimal pour cet œil. Un réalignement de la caméra peut être nécessaire si des zones sombres persistent.

Maintenant, acquérez une image du fond d’œil à haute résolution de la rétine centrale en moyennant 30 images capturées en temps réel afin d'améliorer le rapport signal sur bruit. Cela correspond à 4,7 images par seconde, normalisées immédiatement et à la même position préparée pour acquérir une image de fluorescence des cellules positives pour la GFP. Passez en mode d'imagerie de fluorescence sur le panneau tactile, ce qui sélectionne le laser bleu avec une excitation laser de 488 nanomètres et un filtre passe-bande de 460 à 490 nanomètres, puis réglez l'acquisition sur une puissance laser de 100 % et une sensibilité de 100 à 125 %.

Collectez maintenant une seule image de fluorescence bidimensionnelle en un point XY de la papille optique, en effectuant une moyenne de 100 x balayages. Ensuite, capturez une image multipoints de la rétine autour de la papille optique : sélectionnez « composite » dans le panneau de contrôle, puis déplacez-vous avec l'ophtalmoscope le long de l'axe nasal-temporal. Le logiciel effectue automatiquement la moyenne des zones nouvellement balayées et les assemble en temps réel.

Si la qualité d'image des zones de la rétine est insuffisante pour permettre la moyenne, le cercle vert qui identifie une zone en cours de balayage deviendra rouge. L'image composite résultante couvre une zone allant jusqu'à 1,7 sur quatre millimètres. Une attention particulière doit être portée lors de l'acquisition de l'image composite.

Des images haute résolution peuvent être perdues en déplaçant trop rapidement l'objectif avant la fin de la moyenne des scans et du regroupement d'images. Lorsque l'anesthésie commence à se dissiper, la séance d'imagerie doit prendre fin car la souris commence à respirer lourdement et l'imagerie devient impraticable. Commencez par aligner successivement les images du fond d'œil pour une série temporelle en utilisant la vascularisation et le disque optique comme repères.

À l’aide d’un logiciel de retouche d’images classique, alignez toutes les images jusqu’à ce que leurs O hs se superposent. L’image du haut sera semi-transparente pendant son déplacement. Ensuite, faites pivoter chaque image de la séquence jusqu’à ce que ses vaisseaux sanguins principaux se superposent avec la vascularisation de l’image précédente, puis enregistrez cet agencement pour référence ultérieure.

Enregistrez l'angle corrigé pour chaque image et appliquez-le à l'image de fluorescence correspondante du point XY unique. Il est désormais possible d'identifier individuellement les cellules microgliales positives pour la GFP localisées dans la rétine centrale en ouvrant les fichiers TIFF alignés dans Fluor render. Pour visualiser toutes les cellules, remplissez l'écran avec l'image et définissez la vue de rendu comme composite orthogonale et interpolée.

Ensuite, définissez les propriétés suivantes : gamma 0,58, point de saturation 255, luminance 195, alpha à 1,00 pour l'ombrage. Terminez les sélections en choisissant les deux canaux RG comme visibles. Masquez le canal B en double-cliquant dessus dans le cadre de l'espace de travail afin de segmenter les cellules individuelles.

Sélectionnez et seuillez le canal rouge en augmentant le seuil bas jusqu'à ce que la majorité des cellules soient masquées avec un chevauchement minimal, tout en excluant les prolongements cellulaires, tout en maintenant le seuil haut constant. Enfin, enregistrez le fichier contenant les cellules masquées à l'aide de la commande de capture. Ouvrez l'image avec les cellules masquées dans l'éditeur graphique matriciel à cet endroit.

Retournez l'échelle de gris pour une observation directe et réglez la résolution à 300 ppp ou plus. L'image RVB est enregistrée au format fichier TIF. L'étape suivante de l'analyse d'image en direct concerne les microglies, donc la segmentation et la morphologie afin d'identifier les SATA pour la quantification de la surface.

Utilisez un logiciel capable de mesurer les intensités et de compter les objets en fonction d'un seuil. Ouvrez le fichier TIFF contenant les cellules segmentées et sélectionnez le redimensionnement en spline pour une résolution maximale, ainsi que le canal rouge en noir et blanc pour une meilleure visualisation. Étalonner ensuite l'image en définissant son diamètre horizontal entre 1,4 et 1,7 millimètres selon l'âge, afin de segmenter les cellules individuelles.

Donc MA, appliquez un seuillage d'intensité sur le canal rouge. Ouvrez la fonction de seuil d'intensité dans la commande de comptage et de mise à jour des objets. Utilisez cette fonction pour suivre les paramètres bidimensionnels pour chaque seuil de la région d'intérêt représentant un individu.

Définissez ensuite le seuil d'intensité dans l'histogramme d'intensité. Sélectionnez les 50 à 60 % les plus bas des 255 niveaux et affinez la valeur finale du seuil pour les cellules individuelles. Évaluez visuellement le recouvrement entre le masque coloré de seuil en bleu et le périmètre du soma cellulaire en gris à l'aide des commandes de la barre d'outils binaire ou du catalogue d'objets.

Identifier manuellement les régions somatiques d'intérêt contenant plusieurs cellules. Séparer ces éléments en dissociant les régions d'intérêt. Pendant cette étape, utiliser la bascule pour visualiser directement les cellules à l'aide d'une restriction de surface.

Classer les cellules microgliales comme activées si leurs surfaces somatiques sont supérieures à 50 à 60 micromètres carrés. Classer les microglies comme désactivées si elles possèdent des somas plus petits.

Enfin, vérifiez le processus et examinez la complexité ramifiée de chaque cellule microgliale activée en superposant le masque du soma et l'image du point unique en XY avec un contraste augmenté de 50 %. Le protocole décrit a été utilisé pour visualiser les cellules microgliales sur une grande zone de la rétine centrale. Chez des souris DBA/2J jeunes hétérozygotes exprimant CX3CR1-GFP, la haute résolution cellulaire combinée à l'imagerie en direct, au seuillage et à l'analyse morphométrique a permis la segmentation automatique des cellules individuelles positives pour GFP, permettant ainsi de distinguer les cellules selon leur aire. Le modèle de souris DBA/2J présente un glaucome chronique et a été imagé mensuellement afin de suivre l'évolution de la microgliose locale et de l'activation des microglies à des âges précédant une neurodégénérescence détectable, ce qui est cohérent avec la progression variable de la neurodégénérescence dans les yeux individuels. Cette analyse a révélé des modifications de l'activation des microglies rétiniennes et de la microgliose au fil du temps.

L'analyse a également détecté des changements dynamiques dans la densité des microglies totales et activées au sein de rétines individuelles. La densité de la population des microglies n'était pas liée aux variations de la densité des cellules exprimant GFP, ce qui est conforme à d'autres observations. Ainsi, l'analyse par CSLO pourrait être utilisée comme indicateur d'une progression précoce de la maladie.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'optimiser soigneusement les niveaux de saturation de l'image fluorescente de la GFP combinée aux microglies, localisées dans la rétine interne, car la reproductibilité des images CSLO de la rétine centrale, ainsi que le détail cellulaire constant détecté à travers la rétine centrale, dépendent fortement de cette étape après son développement. Ce protocole d'imagerie in vivo est actuellement appliqué dans notre laboratoire, permettant d'explorer sérieusement le lien potentiel entre les modifications précoces des microglies de la rétine et du nerf optique, et la progression ultérieure du glaucome chez les souris DBA/2J et dans d'autres modèles de dégénérescence rétinienne chronique. Cette stratégie d'imagerie in vivo pourrait également permettre une détection précoce d'autres pathologies chroniques affectant également la rétine et le nerf optique dans le cadre de processus dégénératifs, telles que la sclérose en plaques, la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson.