Name: Isolement de neurones cellules souches / progénitrices de la région périventriculaire du Rat des adultes et de la moelle épinière humaine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Apprenez l'isolement de cellules souches neurales de la région périventriculaire de la moelle épinière adulte chez le rat et l'humain. Cette méthode par dissociation enzymatique permet d'étudier la formation de neurosphères en culture.

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Les auteurs tiennent à souligner le soutien de Lésions médullaires Ontario, du Fonds de recherche et d’innovation Ontario-Chine, de la Fondation de l’Hôpital général et occidental de Toronto et de la Fondation Physicians' Services Incorporated. Les auteurs remercient le Dr Tasneem Zahir pour ses conseils d’expert sur la culture NSPC de la moelle épinière humaine, et les Drs Cindi Morshead et Iris Kulbatski pour leurs conseils d’experts sur l’isolement NSPC de la moelle épinière du rat.

Toutes les procédures d&#39;animaux sont approuvés par le Comité de protection des animaux de l&#39;University Health Network, Toronto ON Canada, en conformité avec les politiques établies dans le Manuel sur le soin et l&#39;utilisation des animaux d&#39;expérimentation préparés par le Conseil canadien de protection des animaux. Pour la récolte de tissus de la moelle épinière humaine, l&#39;approbation a été obtenue du comité d&#39;éthique de la recherche du University Health Network et de la Trillium-cadeau Life Foundation qui supervise le don d&#39;organes en Ontario, Canada. 1. Préparation de dissection tampons et de la culture des médias <ol><li> Pour l&#39;isolement de moelle épinière de rat, de préparer 100 ml de tampon de dissection (PBS 1x + 0,6% de glucose + 2% de pénicilline-streptomycine) et réfrigérer. Pour moelle épinière humaine préparer 100 ml de tampon de dissection (1x HBSS + 0,6% de glucose + 2% de pénicilline-streptomycine) et réfrigérer. </li><li> Préparez 100 ml de milieu sans sérum (SFM) et chaude à 37 ° C. Pour préparer la GFD, ajouter 2 mM de L-glutamine, 100 ug / ml pénicilline-streptomycine, B27 2%, et 10% à l&#39;hormone mélange Neurobasal-A milieu. Pour préparer hormone mélange, faire un rapport 1: milieu / F12 1 DMEM contenant 0,6% de glucose, 3 mM de NaHCO 3, HEPES 5 mM, 25 ug / ml d&#39;insuline, 100 ug / ml d&#39;apo-transferrine, 10 uM de putrescine, 30 nM de sélénium, et 20 nM progestérone. </li><li> Préparez le support de placage de croissance EFH facteur enrichi (à la GDF ajouter 20 ng / ml d&#39;EGF, 20 ng / ml de bFGF, et 2 pg / ml d&#39;héparine) et chaude à 37 ° C. Assurez-vous que EFH humain contient des facteurs de croissance recombinants humains (voir le tableau des matériaux). </li></ol> 2. La récolte et la dissection des adultes Rat périventriculaire moelle épinière Tissue <ol><li> Stériliser les instruments de dissection dans l&#39;éthanol et rincer dans une solution saline stérile ou instruments autoclave à l&#39;avance. Donnez rat (6 - 8 semaines) une injection létale de pentobarbital de sodium (1 cc à 65 mg / ml) ou de surdose d&#39;anesthésique (c.-à 4% isofluorane) selon son institution a approuvé le protocole de l&#39;animal. RÉOuse le dos du rat avec 70% d&#39;éthanol et enlever la peau sur la surface dorsale avec de grands ciseaux de dissection. </li><li> Tenir les ciseaux perpendiculaires à la surface dorsale, coupée transversalement la colonne vertébrale au-dessus des membres postérieurs. Utilisez de petits ciseaux pour couper longitudinalement le muscle dorsal recouvrant la colonne vertébrale dans une direction rostrale pour exposer les apophyses épineuses. </li><li> À partir de l&#39;extrémité caudale exposée, insérez rongeurs ou d&#39;un petit instrument de coupe osseuse émoussée extradurally dans la face latérale du canal rachidien dans l&#39;espace entre la moelle épinière et la colonne vertébrale. Faire de petites coupures dans la lame (arcs osseux gauche et à droite des apophyses épineuses de chaque côté des vertèbres) et soigneusement décoller la lame pour exposer la moelle épinière (figure 1A-D). Assurez l&#39;angle des pales est peu profonde et parallèle à la corde afin de la moelle épinière sous-jacente ne soit pas endommagé. </li><li> Continuer laminectomie en direction rostrale aux Expose la moelle épinière thoracique et cervical. </li><li> Exciser doucement la moelle épinière de la colonne vertébrale avec une pince de tissus contondants et utilisation microciseaux à couper soigneusement les racines pour libérer le cordon. Placez la moelle épinière excisée dans une boîte de Pétri contenant 4 ° C tampon de dissection du rat stérile (décrit ci-dessus en 1.1). Rincez le tissu dans un tampon C à dissection 4 ° fraîchement préparé et l&#39;aide de ciseaux coupent la moelle épinière transversalement en segments de 1 cm (figure 1E). </li><li> Pour chaque segment de tissu, utiliser une main pour tenir le tissu avec des pinces fines. Avec l&#39;autre main, utiliser microciseaux à retirer soigneusement les méninges qui recouvrent, la matière blanche, et la plupart de la matière grise à l&#39;aide d&#39;un microscope à dissection. Sinon, utilisez une pince fine (Dumont N ° 4) à se décoller plus de la matière grise et blanche, ne laissant que la région périventriculaire de la moelle épinière qui comprend l&#39;épendyme et une petite quantité de la matière environnante gris (figure 1F-H).</li><li> Mutualiser le tissu périventriculaire disséqué dans un plat de 10 cm de Petri stérile contenant un tampon de dissection du rat froid. </li></ol> 3. La récolte et la dissection des adultes de la moelle épinière humaine périventriculaire Tissue Remarque: les tissus de la moelle épinière humaine est récolté à partir de donneurs de greffes d&#39;organes adultes (donateurs étaient âgés de 2 à 60 ans) après les autres organes ont été prélevés pour la transplantation d&#39;organes. Le Trillium-cadeau Programme Life du obtient le consentement pour l&#39;élimination des tissus à des fins de recherche de la famille du patient et informe notre équipe de récolte en temps opportun de sorte que nous avons été en mesure de récolter les cordons dans les 2 heures de clampage aortique. Donneurs adultes mâles et femelles ayant une sérologie négative et aucune infection sont acceptées. <ol><li> Tissus récolte de façon stérile dans la salle d&#39;opération par une approche antérieure en utilisant la même exposition antérieure déjà disséqué pour le prélèvement d&#39;organes par le transp d&#39;organeséquipe de récolte lant. </li><li> Exposer la colonne vertébrale antérieure par rétraction avec de grandes épandeurs de côtes et grands écarteurs de paddle des tissus et des organes restants, y compris les gros vaisseaux sanguins. </li><li> Utiliser une scie sternale monté avec une longue lame pour couper à travers les disques intervertébraux aux extrémités rostrale et caudale de la longueur désirée de la colonne vertébrale à réséquer. Angle de la scie environ 45 ° dedans pour couper un creux triangulaire de la partie latérale des corps vertébraux arrêt juste avant le canal rachidien. </li><li> Retirer en bloc les aspects médiaux des corps vertébraux des segments souhaités à l&#39;aide d&#39;ostéotomes courbes et un maillet en prenant soin d&#39;éviter de couper à travers la dure-mère. Ensuite, soulevez délicatement la dure recouvert la moelle épinière avec une pince à griffes et fortement inciser les extrémités rostrale et caudale de la moelle. Utilisez longs ciseaux et des pinces à sectionner bilatéralement les racines individuelles. </li><li> Placer le segment excisé de la moelle épinière dans 4 °; Tampon stérile C (1x HBSS + 0,6% de glucose + 2% de pénicilline-streptomycine) dans un grand tube à essai pour le transport vers la chambre de culture de tissu. </li> <li> Remarque: En règle générale, un 3 - segment de 6 cm de la moelle épinière de la colonne thoracique supérieure et / ou la mi-à-faible niveau thoracique est enlevé dans la salle d&#39;opération dans des conditions stériles dès que possible après l&#39;arrêt de la circulation et placé dans un tampon stérile froide . Le temps écoulé entre la cessation de la circulation et la suppression de la moelle épinière varie avec le temps nécessaire pour récolter les organes ciblés pour don et a varié de 45 min à 2 h. Si le cœur et les poumons ont également été enlevés, la dissection peut être pris loin rostralement de récolter une partie de la moelle cervicale inférieure ainsi. </li><li> Disséquer les tissus de la moelle épinière humaine dès que possible après la récolte, généralement dans les 3 heures. Retirer la dure-mère et les méninges autres avec une pince. Rincer le tissu de la moelle épinière fraîchement préparé dans du tampon de dissection C à 4 ° C etcouper transversalement en segments de 1 cm. </li><li> Avec l&#39;aide d&#39;un microscope à dissection, exciser les méninges qui recouvrent, la matière blanche, et la plupart de la matière grise en utilisant des pinces de tissus, pinces fines et microciseaux pour chaque segment de tissu. Mutualiser le tissu disséqué périventriculaire, qui comprend l&#39;épendyme et une petite quantité de la matière environnante gris, dans un plat de 10 cm de Petri stérile contenant tampon froid de dissection humaine. </li></ol> 4. Isolement et culture des adultes et Rat NSPCs de la moelle épinière de l&#39;homme <ol><li> Effectuez les étapes suivantes de manière aseptique dans une hotte à flux laminaire. <ol><li> Émincer le rat ou le tissu disséqué périventriculaire humain dans 1 mm 3 pièces avec microciseaux. </li><li> Enzymatique dissocier le tissu haché avec des enzymes protéolytiques en utilisant le kit de dissociation papaïne comme indiqué dans le tableau des matériaux / réactifs. Note: les composants réactifs comprennent 4 flacons; Vial 1: solution saline équilibrée de Earle (EBSS), Vial 2: containin Papaing L-cystéine et de l&#39;EDTA, Vial 3: désoxyribonucléase I (DNase), Vial 4: inhibiteur ovomucoïde protease avec de l&#39;albumine de sérum bovin (BSA). Remarque: Remarque: La papaïne est une protéase sulfhydryle qui a une large spécificité pour des substrats protéiques. La papaïne ici est dérivé du latex à partir de la plante de papaye Carica et dégrade la plupart des substrats protéiques plus largement que les protéases pancréatiques. Pendant le processus de dissociation, il ya de l&#39;ADN causant des dommages aux cellules d&#39;être libérés dans le milieu de dissociation qui va augmenter la viscosité et de faire pipetage difficile. Ainsi, la DNase est inclus dans la procédure d&#39;isolement des cellules à digérer l&#39;ADN sans endommager les cellules intactes. Ovomucoïdes glycoprotéine sont des inhibiteurs de protéase utilisés pour inhiber l&#39;activité de la papaïne après l&#39;étape de dissociation. </li></ol></li><li> À la première utilisation, reconstituer le mélange inhibiteur albumine ovomucoïde (flacon 4) avec 32 ml d&#39;EBSS (1 flacon), puis stocker à 4 ° C et à utiliser pour les isolements ultérieures.Remarque: On obtient ainsi une solution à une concentration efficace de 10 mg d&#39;inhibiteur ovomucoïde et 10 mg d&#39;albumine par ml. </li><li> Ajouter 5 ml d&#39;EBSS (flacon 1) de la papaïne un flacon (flacon 2), ce qui donne une solution à 20 unités de papaïne / ml dans 1 mM de L-cystéine avec 0,5 mM d&#39;EDTA. Vérifier que la solution de papaïne semble clair quand il est complètement dissous, sinon placer le flacon dans un bain d&#39;eau à 37 C ° d&#39;une dizaine de minutes jusqu&#39;à ce que la papaïne est complètement dissous pour assurer la pleine activité de l&#39;enzyme. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;EBSS (flacon 1) dans un flacon de DNase (flacon 3) et mélanger doucement DNase est sensible à la dénaturation par cisaillement. Ajouter 250 ul de la solution de DNase dans le flacon contenant la papaïne, ce qui entraîne une concentration finale d&#39;environ 20 unités / ml de papaïne et 0,005% de DNase. Sauvegardez l&#39;équilibre de la fiole de DNase à utiliser plus tard. </li><li> Placez le rat hachée ou un tissu humain dans la solution de papaïne tel que préparé à l&#39;étape 4.4 ci-dessus. Pour l&#39;isolement de tissu humain, diviser le tissu haché à parts égales entre deuxflacons de papaïne (environ 0,2 g / fiole). </li><li> Incuber à 37 ° C avec agitation constante sur une plate-forme à bascule pour dissocier le tissu dans la solution de papaïne activée. Incuber tissu de rat pendant 45 minutes à 1 heure, et le tissu humain pendant 1 à 2 heures en fonction de la quantité de tissu haché, environ 0,2 à 0,4 g respectivement. </li><li> Triturer le mélange avec une pipette 10 ml de dissocier les morceaux de tissu restants pour donner une suspension de cellules trouble. Transférer la suspension cellulaire (ne pas inclure tous les morceaux de tissu non dissocié) dans un tube stérile conique de 15 ml et centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans du milieu contenant de l&#39;ovomucoïde, un inhibiteur de la papaïne. <ol><li> Préparer la solution par mélange de l&#39;ovomucoïde 2,7 ml EBSS (flacon 1) avec 300 ul de la solution d&#39;inhibiteur de l&#39;albumine ovomucoïde reconstituée (flacon 4) dans un tube conique de 15 ml. Ajouter 150 pi de solution de DNase (flacon 3) enregistrés à l&#39;étape 4.4 ci-dessus. </li><li> Jeter le surnageant deles cellules en culot et immédiatement remettre en suspension le culot cellulaire dans le mélange d&#39;albumine d&#39;inhibiteur dilué DNase. </li></ol></li><li> Séparer les cellules intactes les membranes cellulaires par centrifugation à travers une seule étape à gradient de densité discontinu. <ol><li> Préparer le gradient de densité discontinu par addition de 5 ml de solution d&#39;albumine-inhibiteur (flacon 4) à un tube de 15 ml, et en utilisant une pipette de 5 ml, doucement et la couche lentement la suspension cellulaire (préparé comme décrit ci-dessus à l&#39;étape 4.8) au-dessus de la solution d&#39;albumine-inhibiteur. </li><li> Centrifuger à 70 g pendant 6 min à température ambiante. </li><li> Remarque: L&#39;interface entre les deux couches de la pente doit être clairement visible, bien que le mélange à cette limite minimal n&#39;a aucune incidence sur le résultat. Fragments membranaires restent à l&#39;interface et cellules dissociées culot au fond du tube. </li></ol></li><li> Pour les cellules de rat, jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de rat moyenne EFH (pré-chauffé à 37 ° C).Compter densité cellulaire en temps réel avec un hémocytomètre et la plaque les cellules dans un flacon de culture T25 à une densité de 10 cellules / ul dans EFH. Le rendement typique de cellules provenant de tissu de rat est d&#39;environ 2 x 10 6 cellules avec environ 80% viability.If cultures clonales sont désirés, les cellules de semence à une densité inférieure à 10 cellules / ul. Incuber les flacons à 37 ° C dans 5% de CO 2 et de permettre aux cultures de se développer au repos pendant 1 semaine pour éviter l&#39;agrégation des sphères. </li><li> Pour les cellules humaines, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu EFH humaine (pré-chauffé à 37 ° C). On filtre la suspension de cellules à travers un filtre cellulaire en nylon de 40 pm a suivi avec 30 ml d&#39;EFH pour éliminer les fragments de myéline et la membrane cellulaire. Centrifugeuse à 300 g pendant 5 minutes et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de milieu EFH. </li><li> Comptez densité de cellules vivantes avec un hémocytomètre et plaque les cellules humaines dans des plaques de culture à 6 puits à une densité de 10 5 cellules / puits dans un volume total5 ml EFH / puits. Le rendement typique de cellules provenant de tissu humain est d&#39;environ 1 x 10 6 cellules avec environ 70% de viabilité. Puits pré-manteau avec un substrat adhérente comme Matrigel (voir note ci-dessous). Diluer à un ratio de 40 ul Matrigel: 1 ml GDF. </li><li> Remarque: En variante, d&#39;autres substrats tels que adhérentes poly-D-lysine / laminine, la fibronectine, le collagène ou peuvent être utilisés. </li><li> Incuber les plaques à 37 ° C dans 5% de CO 2 et de permettre aux cultures de se développer au repos pendant 1 semaine. </li></ol> 5. Le repiquage du rat adulte et NSPCs de la moelle épinière humains <ol><li> NSPCs Rat formeront de petits neurosphères environ 70 m de diamètre à 1 semaine d&#39;ensemencement initial; NSPCs hebdomadaires par la collecte de la suspension cellulaire, la centrifugation à 300 xg pendant 5 min, et trituration mécanique de la boulette de cellules de neurosphères passage dissocier les rats. </li><li> Ensemencer les cellules dissociées dans des flacons T25 contenant rat milieu frais EFH. Alternativement,utiliser milieu de rat climatisé de 50% pour les passages. Le rendement typique de NSPCs de rats à des passages est d&#39;environ 5 x 10 6 cellules qui augmente de façon exponentielle avec le nombre de passages. </li><li> Pour les cultures humaines, une semaine après le dépôt initial, remplacer la moitié du milieu de culture frais avec EFH deux fois par semaine pour permettre aux cellules d&#39;adhérer au substrat. En général, 1 à 2 semaines plus tard, une fois que les cellules ont fixé au substrat, remplacer l&#39;ensemble du volume du milieu de culture deux fois par semaine avec EFH frais. </li><li> cellules Subculture avant d&#39;atteindre la confluence entre 4 - 8 semaines. <ol><li> des cellules de sous-culture de cellules détacher du substrat enzymatique (voir le tableau des matériaux) avec 2 ml d&#39;enzyme par puits incubés pendant environ 10 min à 37 ° C. Recueillir suspension cellulaire, centrifuger à 300 g pendant 5 min, et remettre doucement le culot cellulaire dans 1 ml de milieu fraîchement préparé EFH. </li><li> Compter les cellules vivantes avec un hémocytomètre et plaque les cellules dans des plaques de culture à 6 puits (pré-coATED comme ci-dessus à l&#39;étape 4.12) à une densité de 10 5 cellules / puits dans un volume total de 5 ml EFH / puits. Le rendement typique de NSPCs humaines à des passages est d&#39;environ 2 x 10 6 cellules et généralement cela va doubler avec le passage. Généralement, de maintenir les cultures avec 50% de milieu EFH conditionné 2 - 3 fois par semaine entre passages. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Au cours de la dissection de la moelle épinière soins de tissu de rat doivent être prises pour ne pas endommager la moelle épinière tout en effectuant la laminectomie. Il est plus facile d&#39;isoler le tissu périventriculaire lorsque les segments de la moelle épinière sont intacts. Les segments de tissus devraient être complètement immergés dans un tampon de dissection et les méninges recouvrant la matière blanche et peuvent être découpées en bandes longitudinales avec microciseaux. Alternativement, forceps de tissu fi...

NSPCs cellules multipotentes sont commis à la lignée de neurones qui peut auto renouveler et élargir facilement in vitro. Nous nous référons à ces cellules comme une population mixte de cellules souches / progénitrices neurales car ils présentent des propriétés de cellules souches multipotentes auto-renouvellement et les progéniteurs plus restreints. NSPCs se trouvent à la fois dans le cerveau du fœtus et de l&#39;adulte et la moelle épinière 1,2. Chez l&#39;adulte, NSPCs sont normalement repos et résident dans des niches spécifiques, y compris la zone sous-ventriculaire qui tapisse les ventricules latéraux 2-4, et dans la région périventriculaire entourant le canal central de la moelle épinière de 5,6. Typiquement, NSPCs sont cultivées comme neurosphères flottants ou comme monocouches adhérentes dans un milieu sans sérum supplémenté avec de l&#39;EGF et bFGF, qui sélectionnent mitogenes pour les populations de cellules souches / progénitrices. Le dosage de neurosphère initialement développé par Reynolds et Weiss 2, est le plus couramment utilisé pour la culture etdévelopper des cellules souches neurales. NSPCs montrent multipotence quand ils sont étalées dans un milieu contenant du sérum exempt de facteur de croissance, se différencier en neurones, astrocytes, oligodendrocytes et. Multipotentes, NSPCs d&#39;auto-renouvellement peuvent être isolés et mis en culture à partir du rongeur adulte moelle épinière lorsque le tissu en culture comprend les régions du canal central 6,7. Un avantage potentiel dans l&#39;utilisation de NSPCs générées lors de la moelle épinière adulte, par opposition à générer des cellules provenant d&#39;autres régions est que ces cellules spécifiques d&#39;un tissu ressemblent plus étroitement les cellules de la moelle épinière qui sont perdues ou endommagées après une blessure ou d&#39;une maladie. Des travaux antérieurs ont montré que neurosphères dérivées de la moelle épinière adulte humaine ne pouvaient pas être propagées à long terme ou des passages pour générer un nombre suffisant de cellules 8,9. Cependant, avec des modifications dans des conditions de culture, nous avons signalé l&#39;expansion et la transplantation de NSPCs adultes de la moelle épinière humaine dérivés, ce qui démontre que l&#39;auto-renouvellementNSPCs multipotentes et peuvent être isolées à partir de moelle épinière de l&#39;adulte humain de donneurs de transplantation d&#39;organes 10. En premier lieu, l&#39;élimination de la majeure partie de la matière blanche au cours de la dissection et la culture de ces cellules adhérentes sur un substrat dans un milieu de croissance enrichi en facteur choisi pour adultes humains en prolifération NSPCs de la moelle épinière. Dans ce protocole, nous décrivons la récolte de la moelle épinière de rats adultes et à partir de donneurs humains de transplantation d&#39;organes, la dissection du tissu péri-ventriculaire, et l&#39;isolement, la culture et l&#39;expansion de NSPCs.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td>#10010023</td><td>Tampon de dissection</td></tr><tr><td>1x HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>#14175095</td><td>Tampon de dissection</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td># G-6152</td><td>Préparez une solution mère de glucose à 30 % pour le tampon de dissection et le mélange d’hormones</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>#15140-148</td><td>Tampon de dissection et milieu de culture</td></tr><tr><td>Neurobasale-A&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>#10888-022</td><td>Milieu de culture</td></tr><tr><td>L-glutamine, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>#25030-081</td><td>Milieu de culture</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>#12587010</td><td>Milieu de culture</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>#11885084</td><td>Mélange d’hormones</td></tr><tr><td>F12</td><td>Life Technologies</td><td>#21700-075</td><td>Mélange d’hormones</td></tr><tr><td>NaHCO 3</td><td>Sigma</td><td># S-5761</td><td>Préparer une solution mère de NaHCO3 pour mélange d’hormones</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>#H9136</td><td>Préparer 1M de solution mère HEPES pour un mélange d’hormones</td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma</td><td>#I-5500</td><td>Mélange d’hormones</td></tr><tr><td>Apo-transferrine</td><td>Sigma</td><td>#T-2252</td><td>Mélange d’hormones</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td># P7505</td><td>Hormone mélange</td></tr><tr><td>Sélénium</td><td>Sigma</td><td>#S-9133</td><td>Mélange d’hormones</td></tr><tr><td>Progestérone</td><td>Sigma</td><td>#P-6149</td><td>Mélange d’hormones</td></tr><tr><td>EGF, souris</td><td>Sigma</td><td>#E4127</td><td>Préparer 100 &mu ; g/ml de stocks en B27 et en aliquote ; EFH moyen</td></tr><tr><td>EGF, humain recombinant</td><td>Sigma</td><td>#E9644</td><td>Préparer 100 &mu ; g/ml de stocks en B27 et en aliquote ; EFH moyen</td></tr><tr><td>bFGF, humain recombinant</td><td>Sigma</td><td>#F0291</td><td>Préparer 100 &mu ; g/ml de stocks en B27 et en aliquote ; EFH moyen&nbsp ;</td></tr><tr><td>Héparine, 10 000 U</td><td>Sigma</td><td>#H3149</td><td>Préparez des stocks de 27,3 mg/ml dans un mélange d’hormones et une aliquote ; </td></tr><tr><td>Kit de dissociation de la papaïne</td> moyenne EFH <td>Worthington Biochemicals</td> <td>#LK003150</td><td>Contient de l’EBSS, de la papaïne, de la DNase, un inhibiteur de la protéase ovomucoïde avec BSA</td></tr><tr><td>Sodium Pentobarbital</td><td>Bimeda &ndash ; MTC Animal Health Inc</td><td>Pince à tissus DIN 00141704</td><td></td></tr> : <tr><td>Addisons</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11006-12&nbsp ;</td><td>Pointe standard dentelée ; micro-pointe également disponible</td></tr><tr><td>Pince fine : Dumont #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Microciseaux</td><td>Fine Science Tools</td><td>#15024-10</td><td>Vannas</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Bausch & Lomb</td><td>N1430</td><td></td></tr><tr><td>10 mm Boîtes de Pétri</td><td>Nunc</td><td>1501</td><td></td></tr><tr><td>T25 Fioles de culture</td><td>Nunc</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu ; m crépine à cellules en nylon</td><td>VWR</td><td>CA21008-949</td><td></td></tr><tr><td>6 plaques de puits</td><td>Nunc</td><td>CA73520-906</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, facteur de croissance réduit (100x)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Décongeler selon les instructions et congeler les aliquotes ; utilisation diluée dans un rapport de 40 &mu ; l Matrigel : 1 ml de SFM</td></tr></tbody></table>

isolement de neurones cellules souches / progénitrices de la région périventriculaire du rat des adultes et de la moelle épinière humaine

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Rat adulte et les cellules humaines de la moelle épinière neurales souches / progénitrices (NSPCs) cultivées dans un milieu de croissance enrichi en facteur permet la prolifération des multipotentes, et les cellules souches neurales expansibles auto-renouvellement. Dans des conditions sérum, ces NSPCs multipotentes seront différencier, générer des neurones, des astrocytes et des oligodendrocytes,. Le tissu prélevé est enzymatiquement dissocié dans une solution de papaïne-EDTA et ensuite dissocié mécaniquement et séparés par un gradient de densité discontinu pour obtenir une suspension cellulaire unique, qui est plaqué dans un milieu neurobasal additionné de facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF ), et de l&#39;héparine. Rats adultes de la moelle épinière NSPCs sont cultivées comme neurosphères flottants et adultes humains NSPCs de la moelle épinière sont cultivées comme cultures adhérentes. Dans ces conditions, adultes de la moelle épinière NSPCs prolifèrent, marqueurs expresses de cellules précurseurs, et peuvent être élargies en permanence lors du passage. Ces cellules peuvent be étudiée in vitro en réponse à divers stimuli, et des facteurs exogènes peuvent être utilisés pour promouvoir restriction de la lignée d&#39;examiner la différenciation des cellules souches neurales. Multipotentes NSPCs ou leur progéniture peuvent également être transplantées dans divers modèles animaux pour évaluer la réparation régénérative.

Rats adultes de la moelle épinière cellules cultivées dans une culture en suspension dans un milieu EFH se former de petites neurosphères (colonies de cellules non différenciées) dans 1 semaine de placage initial. Dans les cultures primaires, la plupart des cellules étalées mourront et les cellules souches du facteur sensible croissance va proliférer et sont choisis dans le milieu EFH. Par passage 3, il y aura de nombreux neurosphères flottant librement à environ 100 m de diamètre (figure 2A). Neurosphè...

La moelle épinière de mammifère adulte contient des cellules souches neurales/progénitrices (NSPC) qui peuvent être isolées et développées en culture. Ce protocole décrit le prélèvement, l’isolement, la culture et le passage de NSPC générés à partir de la région périventriculaire de la moelle épinière adulte à partir de rats et de donneurs d’organes humains.

Isolement de neurones cellules souches / progénitrices de la région périventriculaire du Rat des adultes et de la moelle épinière humaine

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules souches neuronales à partir de la région paraventriculaire de la moelle épinière d'un rat adulte ou d'un être humain. Cette étape est réalisée en prélevant d'abord la moelle épinière par laminectomie. La deuxième étape consiste à couper transversalement la moelle épinière en segments d'un centimètre et à disséquer la région paraventriculaire à partir de chaque segment de la moelle épinière.Ensuite, le tissu haché est découpé en morceaux d'un millimètre, puis dissocié enzymatiquement. La dernière étape consiste à séparer les cellules intactes par centrifugation sur un gradient de densité discontinu et à ensemencer la suspension cellulaire. Enfin, la formation de neurosphères et la prolifération des cellules souches neuronales peuvent être évaluées par microscopie en immunofluorescence.Aujourd'hui, je vais démontrer comment isoler des cellules souches neuronales à partir de la région paraventriculaire de la moelle épinière de rat adulte. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées pour aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches neuronales, telles que lesquels facteurs exogènes favorisent la restriction de lignage ou comment ces cellules réagissent à divers stimuli ou stress. Pour commencer, préparez la culture, les milieux et les tampons de dissection comme décrit dans le protocole textuel accompagnant.Ensuite, après une surdose d'anesthésique, stérilisez la peau du rat et utilisez de grands ciseaux de dissection pour enlever la surface dorsale, exposant ainsi la colonne vertébrale. Tenez les ciseaux de dissection perpendiculairement à la surface dorsale et sectionnez transversalement. Coupez la colonne vertébrale au-dessus des membres postérieurs.Ensuite, utilisez de petites ciseaux pour inciser longitudinalement le muscle dorsal recouvrant la colonne vertébrale en direction rostrale afin d'exposer les apophyses épineuses à partir de l'extrémité caudale mise à nu. Insérez un petit instrument contondant de coupe osseuse par voie extra-orale dans la partie latérale du canal rachidien, dans l'espace situé entre la moelle épinière et la colonne vertébrale. Placez la lame de façon superficielle et parallèle à la moelle.Ensuite, effectuez de petites incisions dans la lame et détachez soigneusement celle-ci afin d'exposer la moelle épinière. Cet angle empêche d'endommager la moelle épinière sous-jacente. Poursuivez le retrait de la lame en direction rostrale.Pour exposer la moelle épinière thoracique et cervicale à l’aide de pinces à tissus contondantes, soulevez délicatement la moelle épinière à partir de la colonne vertébrale et sectionnez les racines avec des ciseaux microchirurgicaux. Pour libérer la moelle, placez-la dans une boîte de Pétri contenant une solution de dissection pour rat stérile et glacée. Rincez le tissu avec la solution de dissection glacée, puis utilisez des ciseaux pour couper transversalement la moelle épinière en segments d’un centimètre. Pour chaque segment, tenez le tissu avec une pince fine d’une main, et de l’autre main, utilisez des ciseaux microchirurgicaux pour retirer soigneusement la substance blanche ainsi que la majeure partie de la substance grise, en ne laissant que la région périvermiculaire de la moelle épinière.Prélève le tissu périventriculaire disséqué dans une boîte de Petri stérile de 10 centimètres contenant du tampon de dissection pour rat glacé. Pour commencer l'isolement des cellules souches neuronales de rat, utilise des ciseaux microchirurgicaux pour hacher le tissu périventriculaire disséqué en morceaux d'un millimètre cube. Ensuite, prépare le tampon de dissociation enzymatique en ajoutant d'abord cinq millilitres de solution saline équilibrée d'Earle dans un flacon de papaine provenant d'un kit de dissociation à base de papaine.Placer le flacon à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes afin que la papaine soit complètement dissoute et que la solution apparaisse limpide. Ensuite, ajouter 500 microlitres de solution saline équilibrée d'Earle dans le flacon contenant les ADN du kit de dissociation. Après avoir mélangé doucement, ajouter 250 microlitres de la solution d'ADN dans le flacon contenant la papaine et mélanger délicatement.Ensuite, ajoutez environ 0,2 gramme de tissu haché dans le flacon, puis placez le flacon sur une plateforme agitateur à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes à une heure. Après l'incubation, triez le mélange à l’aide d’une pipette de 10 millilitres pour dissocier les éventuels morceaux de tissu résiduels et obtenir une suspension cellulaire trouble. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique stérile de 15 millilitres et centrifugez à 300 G pendant cinq minutes.À température ambiante pendant la centrifugation, préparez la solution OVO moid en mélangeant 2,7 millilitres de solution saline équilibrée d'Earl avec 300 microlitres de la solution réconstituée d'inhibiteur d'albumine OVO MOID. Dans un tube conique de 15 millilitres, ajoutez 150 microlitres de la solution d'ADN préparée précédemment à la solution d'oval moid et mélangez en retournant le tube, jetez le surnageant des cellules en culot, puis remettez immédiatement en suspension le culot cellulaire dans le mélange dilué d'inhibiteur d'albumine contenant l'ADN. Ensuite, préparez un gradient de densité discontinu en ajoutant cinq millilitres de solution d'inhibiteur d'albumine dans un tube de 15 millilitres et en superposant délicatement et lentement, à l’aide d’une pipette de cinq millilitres, la suspension cellulaire sur la solution d'inhibiteur d'albumine.Centrifuger l'échantillon à 70 g pendant six minutes à température ambiante. Une fois terminé, éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans un millilitre de milieu EFH pour rat préchauffé, préparé comme décrit dans le protocole accompagnant. Déterminer la densité de cellules viables à l'aide d'un hémocytomètre et ensemencer les cellules dans un flacon de culture T 25 à une densité de 10 cellules par microlitre dans le milieu EFH.Incuber les flacons à 37 degrés Celsius dans un atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone et laisser les cultures croître sans perturbation pendant une semaine afin d'éviter l'agrégation des sphéroïdes. On observe ici une coupe transversale de moelle épinière de rat colorée au bleu luxal rapide, ainsi qu'à l'hématine et à l'éosine, afin de mettre en évidence les limites entre la substance blanche et la substance grise. Le trait en pointillés délimite le tissu périventriculaire restant disséqué, qui a été isolé dans ce protocole à partir de cette région.Des neurosphères telles que celles illustrées ici se développeront en suspension, libres, en culture, à fort grossissement. Des micro-excroissances peuvent être observées en protrusion à partir des neurosphères, qui prolifèrent comme le montre la coloration positive au KI 67, où les neurosphères ont été dissociées et ensemencées dans des puits revêtus de matrigel. De plus, elles exprimeront principalement la nestine, un marqueur des cellules souches neuronales.Après cette procédure, des facteurs exogènes peuvent être ajoutés aux cellules cultivées afin de favoriser leur différenciation. Les cellules souches neurales adultes ou leurs progéniteurs peuvent également être transplantés dans divers modèles animaux afin d'évaluer leur capacité à effectuer une réparation régénérative. J'espère que cette vidéo vous sera utile, et bonne chance dans vos expériences.

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Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo présente une méthode pour isoler les cellules souches neurales/progénitrices du tissu périventriculaire de la moelle épinière chez des rats adultes. La technique comprend l’incubation des fragments de tissu dans une solution contenant des enzymes protéolytiques pour perturber la matrice extracellulaire et libérer les cellules. Par la suite, les cellules libérées sont plaquées dans un milieu contenant des facteurs de croissance spécifiques qui favorisent la prolifération des souches...

Isolement de cellules progénitrices souches neurales de la région périventriculaire de la moelle épinière d’un rat adulte

des matrices de fibrine contenant des facteurs de croissance ont été utilisés pour conserver des cellules souches neurales dans des sites greffés complète de transection de la moelle épinière. Cellules greffées complètement remplis la cavité de la lésion et différenciées en plusieurs types de cellules neurales, y compris les neurones qui s'étendaient axones dans la moelle épinière hôte sur de longues distances.

Promotion de la survie et de la différenciation des cellules souches neurales de fibrine et du facteur de croissance Cocktails après Spinal Cord Injury sévère

Les cellules souches neurales récoltés dans le cerveau adulte sont de plus en plus utilisés dans des applications allant de la recherche fondamentale du développement du système nerveux à l'exploration des applications cliniques potentielles en médecine régénérative. Cela rend le contrôle rigoureux des conditions d'isolement et de culture utilisés pour cultiver ces cellules essentielles au son des résultats expérimentaux.

Grandir cellules souches neurales de régions classiques et non conventionnelles du cerveau adulte rongeurs

Ce protocole décrit un procédé de découpage mécanique nouvelle qui permet l'expansion de souches et de cellules progénitrices neurales agrégats sphériques sans dissociation d'une suspension cellulaire unique. Maintenir le contact cellule / cellule permet une croissance rapide et stable depuis plus de 40 passages.

Une méthode d&#39;extension cGMP applicable pour les agrégats de neurones humains des cellules souches et progénitrices dérivées de cellules souches pluripotentes ou fœtale tissu cérébral

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la production simultanée de cultures de cellules de précurseur de neurones, soit comme des monocouches ou des neurosphères adhérentes, à partir de la zone sous-ventriculaire et le gyrus denté de souris individuels adultes.

Une souris, deux cultures: Isolement et culture des cellules souches adultes de neurones à partir des deux Neurogenic Zones de souris individuelle

Lésion de la moelle épinière est une condition traumatique qui entraîne une morbidité grave et une mortalité élevée. Dans ce travail, nous décrivons en détail un modèle de contusion de blessure de la moelle épinière chez la souris suivie d'une transplantation de cellules souches neurales.

Neural Transplantation de cellules souches dans la partie expérimentale Modèle contusion de la moelle épinière des blessures

La mise en place de systèmes de culture pour l’expansion des cellules souches neurales adultes (CSNa) permet l’examen et l’application des CSNa à des fins thérapeutiques. La zone sous-calleuse (SCZ) a récemment été reconnue comme une nouvelle région formant des neuroblastes chez les souris adultes. Ici, les méthodes d’isolement, d’expansion et de différenciation des SCZ-aNSC sont décrites.

Isolement et culture des adultes cellules souches neurales de la Subcallosal Zone Souris

Les cellules stromales de la moelle (MSC) avec potentiel neuronal existent dans la moelle osseuse. Notre protocole enrichit cette population de cellules par un préconditionnement hypoxique et les dirige ensuite pour devenir des cellules Schwann matures.

Le préconditionnement hypoxique des cellules progénitrices dérivées de la moelle en tant que source pour la génération de cellules Schwann mûres

Ici, nous démontrons la performance d’un modèle de blessures médullaires minime dans une souris adulte qui épargne la niche de canal central logement cellules souches neuronales endogènes (CNS). Nous montrons comment le dosage Neurosphère peut être utilisé pour quantifier l’activation et la migration des CNS primitifs et définitifs après une blessure.

Un dosage Neurosphère pour évaluer l’Activation endogène cellules souches neurales dans un modèle murin de minime de la moelle épinière

Ici, nous présentons une nouvelle technique microchirurgicale pour isoler des cellules souches neurales de l’éminence E13 souris embryon ganglionnaire.

Isolement et Culture des embryons de souris des cellules souches neurales

Une méthode d’isolement de cellules souches neurales et de cellules progénitrices d’oligodendrocytes à partir du cerveau de rats vivants est présentée ici en détail expérimental. Il permet de multiples prélèvements de ces cellules chez les mêmes animaux sans compromettre leur bien-être.

La méthode de « traite cérébrale » pour l’isolement de cellules souches neurales et de cellules progénitrices d’oligodendrocytes provenant de rats vivants

Apprenez l'isolement de cellules souches neurales de la région périventriculaire de la moelle épinière adulte chez le rat et l'humain. Cette méthode par dissociation enzymatique permet d'étudier la formation de neurosphères en culture.

Isolement de neurones cellules souches / progénitrices de la région périventriculaire du Rat des adultes et de la moelle épinière humaine (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement de neurones cellules souches / progénitrices de la région périventriculaire du Rat des adultes et de la moelle épinière humaine

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