Isolement de neurones cellules souches / progénitrices de la région périventriculaire du Rat des adultes et de la moelle épinière humaine

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules souches neuronales à partir de la région paraventriculaire de la moelle épinière d'un rat adulte ou d'un être humain. Cette étape est réalisée en prélevant d'abord la moelle épinière par laminectomie. La deuxième étape consiste à couper transversalement la moelle épinière en segments d'un centimètre et à disséquer la région paraventriculaire à partir de chaque segment de la moelle épinière.

Ensuite, le tissu haché est découpé en morceaux d'un millimètre, puis dissocié enzymatiquement. La dernière étape consiste à séparer les cellules intactes par centrifugation sur un gradient de densité discontinu et à ensemencer la suspension cellulaire. Enfin, la formation de neurosphères et la prolifération des cellules souches neuronales peuvent être évaluées par microscopie en immunofluorescence.

Aujourd'hui, je vais démontrer comment isoler des cellules souches neuronales à partir de la région paraventriculaire de la moelle épinière de rat adulte. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées pour aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches neuronales, telles que lesquels facteurs exogènes favorisent la restriction de lignage ou comment ces cellules réagissent à divers stimuli ou stress. Pour commencer, préparez la culture, les milieux et les tampons de dissection comme décrit dans le protocole textuel accompagnant.

Ensuite, après une surdose d'anesthésique, stérilisez la peau du rat et utilisez de grands ciseaux de dissection pour enlever la surface dorsale, exposant ainsi la colonne vertébrale. Tenez les ciseaux de dissection perpendiculairement à la surface dorsale et sectionnez transversalement. Coupez la colonne vertébrale au-dessus des membres postérieurs.

Ensuite, utilisez de petites ciseaux pour inciser longitudinalement le muscle dorsal recouvrant la colonne vertébrale en direction rostrale afin d'exposer les apophyses épineuses à partir de l'extrémité caudale mise à nu. Insérez un petit instrument contondant de coupe osseuse par voie extra-orale dans la partie latérale du canal rachidien, dans l'espace situé entre la moelle épinière et la colonne vertébrale. Placez la lame de façon superficielle et parallèle à la moelle.

Ensuite, effectuez de petites incisions dans la lame et détachez soigneusement celle-ci afin d'exposer la moelle épinière. Cet angle empêche d'endommager la moelle épinière sous-jacente. Poursuivez le retrait de la lame en direction rostrale.

Pour exposer la moelle épinière thoracique et cervicale à l’aide de pinces à tissus contondantes, soulevez délicatement la moelle épinière à partir de la colonne vertébrale et sectionnez les racines avec des ciseaux microchirurgicaux. Pour libérer la moelle, placez-la dans une boîte de Pétri contenant une solution de dissection pour rat stérile et glacée. Rincez le tissu avec la solution de dissection glacée, puis utilisez des ciseaux pour couper transversalement la moelle épinière en segments d’un centimètre. Pour chaque segment, tenez le tissu avec une pince fine d’une main, et de l’autre main, utilisez des ciseaux microchirurgicaux pour retirer soigneusement la substance blanche ainsi que la majeure partie de la substance grise, en ne laissant que la région périvermiculaire de la moelle épinière.

Prélève le tissu périventriculaire disséqué dans une boîte de Petri stérile de 10 centimètres contenant du tampon de dissection pour rat glacé. Pour commencer l'isolement des cellules souches neuronales de rat, utilise des ciseaux microchirurgicaux pour hacher le tissu périventriculaire disséqué en morceaux d'un millimètre cube. Ensuite, prépare le tampon de dissociation enzymatique en ajoutant d'abord cinq millilitres de solution saline équilibrée d'Earle dans un flacon de papaine provenant d'un kit de dissociation à base de papaine.

Placer le flacon à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes afin que la papaine soit complètement dissoute et que la solution apparaisse limpide. Ensuite, ajouter 500 microlitres de solution saline équilibrée d'Earle dans le flacon contenant les ADN du kit de dissociation. Après avoir mélangé doucement, ajouter 250 microlitres de la solution d'ADN dans le flacon contenant la papaine et mélanger délicatement.

Ensuite, ajoutez environ 0,2 gramme de tissu haché dans le flacon, puis placez le flacon sur une plateforme agitateur à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes à une heure. Après l'incubation, triez le mélange à l’aide d’une pipette de 10 millilitres pour dissocier les éventuels morceaux de tissu résiduels et obtenir une suspension cellulaire trouble. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique stérile de 15 millilitres et centrifugez à 300 G pendant cinq minutes.

À température ambiante pendant la centrifugation, préparez la solution OVO moid en mélangeant 2,7 millilitres de solution saline équilibrée d'Earl avec 300 microlitres de la solution réconstituée d'inhibiteur d'albumine OVO MOID. Dans un tube conique de 15 millilitres, ajoutez 150 microlitres de la solution d'ADN préparée précédemment à la solution d'oval moid et mélangez en retournant le tube, jetez le surnageant des cellules en culot, puis remettez immédiatement en suspension le culot cellulaire dans le mélange dilué d'inhibiteur d'albumine contenant l'ADN. Ensuite, préparez un gradient de densité discontinu en ajoutant cinq millilitres de solution d'inhibiteur d'albumine dans un tube de 15 millilitres et en superposant délicatement et lentement, à l’aide d’une pipette de cinq millilitres, la suspension cellulaire sur la solution d'inhibiteur d'albumine.

Centrifuger l'échantillon à 70 g pendant six minutes à température ambiante. Une fois terminé, éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans un millilitre de milieu EFH pour rat préchauffé, préparé comme décrit dans le protocole accompagnant. Déterminer la densité de cellules viables à l'aide d'un hémocytomètre et ensemencer les cellules dans un flacon de culture T 25 à une densité de 10 cellules par microlitre dans le milieu EFH.

Incuber les flacons à 37 degrés Celsius dans un atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone et laisser les cultures croître sans perturbation pendant une semaine afin d'éviter l'agrégation des sphéroïdes. On observe ici une coupe transversale de moelle épinière de rat colorée au bleu luxal rapide, ainsi qu'à l'hématine et à l'éosine, afin de mettre en évidence les limites entre la substance blanche et la substance grise. Le trait en pointillés délimite le tissu périventriculaire restant disséqué, qui a été isolé dans ce protocole à partir de cette région.

Des neurosphères telles que celles illustrées ici se développeront en suspension, libres, en culture, à fort grossissement. Des micro-excroissances peuvent être observées en protrusion à partir des neurosphères, qui prolifèrent comme le montre la coloration positive au KI 67, où les neurosphères ont été dissociées et ensemencées dans des puits revêtus de matrigel. De plus, elles exprimeront principalement la nestine, un marqueur des cellules souches neuronales.

Après cette procédure, des facteurs exogènes peuvent être ajoutés aux cellules cultivées afin de favoriser leur différenciation. Les cellules souches neurales adultes ou leurs progéniteurs peuvent également être transplantés dans divers modèles animaux afin d'évaluer leur capacité à effectuer une réparation régénérative. J'espère que cette vidéo vous sera utile, et bonne chance dans vos expériences.