Système de Gel concentrique à étudier le rôle biophysique de Matrix microenvironnement sur 3D migration cellulaire

L’objectif général de cette procédure est d’étudier les caractéristiques de migration des cellules dans des environnements 3D physiologiquement pertinents. Ceci est accompli en ensemenceant d’abord les cellules dans un gel de collagène interne qui est ensuite enfermé dans un gel de collagène externe acellulaire avec les propriétés matricielles souhaitées. Ensuite, les cellules sont autorisées à envahir et à migrer dans le gel externe au cours duquel elles peuvent être surveillées et analysées quantitativement.

En fin de compte, ce test sur gel concentrique est utilisé pour montrer comment le comportement de migration cellulaire est affecté par les propriétés biophysiques de la matrice extracellulaire. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le test de transfert ou le test de grattage, est que la migration de la cellule se produit dans un environnement physiologique pertinent dont les propriétés structurelles et biophysiques sont très faciles à contrôler. La démonstration visuelle de cette méthode est tout à fait essentielle car la formation du système de gel de défonceuse interne de concentré est assez délicate.

Une bonne interface de gel est très importante pour le succès de cette expérience, qui peut parfois être un peu difficile à réaliser. Commencer par une culture de cellules MD MBA 2 31 prêtes à être récoltées dans des flacons de T 25 à 80 % de fluidité. Tout d’abord, la trypsine est distribuée aux cellules à l’aide d’un millilitre de solution par flacon.

Ensuite, collectez les cellules sous forme de pastille en utilisant 200 G de force pendant quatre minutes, jetez le snat et remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de culture. Média. Mesurez maintenant la densité cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et déterminez le volume nécessaire pour 100 millions de cellules par millilitre. Ensuite, faites tourner les cellules à 200 G pendant quatre minutes.

Retirez le surnageant et remettez complètement la pastille en suspension dans le volume requis de milieu de culture sans sérum. Cette suspension est à 10 fois la concentration finale des sièges. Pour commencer, rassemblez les solutions mères requises dans un seau à glace, elles comprennent 10 XPBS milq d’eau et 0,1 molaire d’hydroxyde de sodium.

Refroidissez également plusieurs microtubes à centrifuger sous une hotte, en maintenant une technique stérile, aliquote la quantité de collagène souhaitée pour 50 microlitres de 2,4 milligrammes par millilitre de solution de gel interne. Ensuite, ajoutez lentement cinq microlitres de 10 XPBS au collagène mesuré. Faites tourner le tube au fur et à mesure que le PBS est ajouté, mais évitez de faire des bulles.

Ensuite, ajustez le pH du mélange à 7,4 avec la solution de base. Habituellement, cinq microlitres feront l’affaire. Un guide de dépannage est fourni dans le protocole texte.

Enfin, portez le volume à 45 microlitres avec un milieu de culture sans sérum en laissant de la place pour la suspension de 10 cellules. Pour commencer, ajoutez cinq microlitres de 10 x suspension cellulaire à la solution de collagène et remettez les cellules en suspension dans la solution sans former de bulles d’air. Maintenant, à une plaque inférieure préchauffée en verre, ajoutez 20 microlitres de suspension au centre.

Bien former une gouttelette en forme de dôme si une bulle se forme rapidement la rompre ou l’aspirer sans faire de dégâts. Couler le gel de la bonne manière peut être très délicat, surtout avec des solutions très visqueuses comme le collagène. Essayez d’éviter autant que possible de produire des bulles et ne faites pas tourbillonner la solution une fois qu’elle est prête à polymériser, car le gonflement pourrait entraîner un alignement artificiel des fibres.

Remettez maintenant le plat dans l’incubateur pendant 45 minutes pour laisser la couche interne polymériser 15 minutes avant la fin de l’incubation. Préparez 200 microlitres de solution de gel de collagène externe sur de la glace. Tout d’abord, aliquote le volume requis de collagène stock.

Deuxièmement, ajoutez lentement 20 microlitres de 10 XPBS en tourbillonnant doucement. Ajustez ensuite le pH à 7,4 comme précédemment, et amenez la solution jusqu’à 200 microlitres avec de l’eau Milli Q. Retirez maintenant le plat de l’incubateur et ajoutez doucement 180 microlitres de la solution de gel extérieure sur le dôme de gel intérieur.

Cela devrait couvrir complètement la solution interne et remplir le puits. Ne remuez pas la solution et évitez de toucher la solution de gel intérieure. Si une bulle se forme lors de l’éjection de la solution externe, soyez rapide pour la rompre ou aspirer à nouveau dans la pipette.

Une autre étape importante consiste à s’assurer qu’une interface de gel appropriée est obtenue. La clé de cette étape est d’ajouter la solution de gel externe. Lorsque le gel intérieur n’est pas encore certifié.

La cinétique de gélification peut varier avec les conditions de polymérisation et il est essentiel d’optimiser cette condition au préalable Pour laisser le gel extérieur polymériser, renvoyez le plat dans l’incubateur pendant 45 minutes. Après 45 minutes, le gel doit être assez solide, mais peut encore être délogé avec précaution. Ajoutez deux millilitres de milieu chaud pour immerger complètement le gel. Cela complète la culture concentrique en gel fournie tous les deux à trois jours.

En quelques jours, les cellules commenceront à migrer dans la matrice externe pour observer leur migration, colorer les cellules avec un tracker fluorescent. Remplacez les deux millilitres de milieu par un milieu frais contenant cinq microlitres de colorant et incubez pendant 30 minutes après la période d’incubation, lavez la culture avec un millilitre de PB S3 plusieurs fois pendant deux à trois minutes par lavage. Après les lavages, remplissez le plat avec un support normal.

Ensuite, installez l’antenne sur un microscope à environnement contrôlé. Utilisez maintenant un paramètre de volume d’utilisation pour scanner les régions externes du gel à côté de l’interface du gel. Numérisez généralement des vues carrées de 647 microns d’une épaisseur de 100 microns, en utilisant des intervalles de cinq microns sur la pile ZS.

Ensuite, scannez les régions intermédiaires et enfin scannez la périphérie du gel. Excluez les régions situées à moins de 50 microns des surfaces inférieure, supérieure ou latérale pour éviter les cellules susceptibles de souffrir d’un effet de bord. Pour analyser le mouvement des cellules à partir des données collectées, ouvrez d’abord les fichiers d’images dans un logiciel d’analyse de données tel que imas.

Commencez par sélectionner la commande surpass, puis la surface de commande. Cela ouvre l’option de suivi des surfaces. Au fil du temps, sélectionnez la région d’intérêt dans l’ensemble de données, c’est-à-dire les coordonnées cartésiennes et la période.

Ensuite, soustrayez l’arrière-plan de la région d’intérêt. Pour éviter de perdre une cellule à cause de l’élimination de l’arrière-plan, sélectionnez la plus grande sphère qui s’adapte à l’objet. Maintenant, divisez les objets connectés en sélectionnant le diamètre du point d’amorçage et procédez à la classification de tous les points d’amorçage.

L’étape suivante consiste à classer la surface maintenant manuellement. Regroupez les points de départ qui pointent vers le même objet. Faites-le entre tous les points temporels de la région d’intérêt.

Enfin, suivez les objets une fois le suivi terminé, classifiez les traces d’objets, puis générez l’ensemble de données quantitatives à analyser à l’aide d’une feuille de calcul. Après quelques jours de cultures de gel concentriques, les cellules ont percé l’interface externe interne du gel et ont commencé à envahir le gel externe. La population cellulaire s’étend vers l’extérieur dans une direction principalement radiale.

Le mouvement des cellules dans le gel externe de différentes densités de collagène a été comparé. L’imagerie a été réalisée sur une période de huit heures, et environ 200 trajectoires cellulaires ont été calculées à partir de chaque échantillon. Les cellules de la matrice la plus mince se sont déplacées sur le moins de distance.

Ce calcul a pris en compte toutes les cellules, et pas seulement les cellules migrant radialement vers l’extérieur. Dans tous les cas, la distance totale parcourue était supérieure au déplacement net. Comme une persistance attendue a été calculée comme un rapport entre le déplacement et la distance.

La valeur de persistance de 0,4 suggère que ces cellules avaient une migration directionnelle intrinsèquement faible. Les calculs de vitesse moyenne ont montré que la densité du collagène n’affectait pas la vitesse des cellules. Il est possible que la taille des pores de la matrice et la densité du collagène, qui sont inversement liées, aient eu l’effet inverse sur la vitesse de migration et se compensent ainsi.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de construire un système de gel concentrique et d’étudier cette migration des cellules dans un environnement 3D. En suivant cette procédure, vous pouvez faire beaucoup d’autres choses comme l’extraction de cellules, l’analyse de microréseaux, où vous pouvez essayer de répondre à des questions supplémentaires telles que la quantité de certaines protéines exprimées à différents moments de la migration.