Imagerie sur cellule vivante pendant stretch mécanique

L’objectif général de l’expérience suivante est d’observer le rôle de la contrainte mécanique sur la mécanobiologie cellulaire en temps quasi réel. Ceci est réalisé en construisant d’abord un système avec des membranes flexibles sur lesquelles les cellules sont cultivées et étirées. Dans un deuxième temps, étirez la membrane pour calibrer le nombre de moteurs avec la déformation de la membrane.

Ensuite, les cellules épithéliales pulmonaires de souris sont étirées et les noyaux sont imagés. Afin de montrer que la déformation membranaire est transmise aux cellules, les étireurs ont ensuite été incorporés dans l’A FM pour la nano-indentation afin de mesurer la rigidité des cellules individuelles avant et après l’étirement. Les résultats montrent des dommages directs sur les cellules en raison de l’étirement appliqué.

Également sur la base de l’imagerie de fluorescence, il est démontré que la production d’espèces réactives de l’oxygène augmente avec l’étirement. Eh bien, cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie mécanique pulmonaire, par exemple si les cellules épithéliales peuvent être blessées avec la ventilation mécanique. Cette méthode peut fournir des informations sur les cellules pulmonaires, la biologie mécanique et peut également être appliquée à d’autres tissus mous tels que le foie ou les tranches de plaque de croissance.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés en raison de la combinaison non conventionnelle d’outils utilisés dans ces expériences, tels que le microscope à force atomique. Pour commencer, préparez une membrane PDMS recouverte de collagène modifiée pour une utilisation en culture cellulaire comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Ensuite, ensemencez des cellules épithéliales pulmonaires de souris à 2,5 millions de cellules par puits sur une membrane stérile et flexible recouverte de collagène.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant deux jours jusqu’à ce qu’elles atteignent la concubinescence. Ensuite, utilisez un poinçon de biopsie de 1,5 millimètre pour percer deux trous dans chacune des six languettes de serrage, à 20,5 millimètres du centre de la construction si aucune prétention n’est souhaitée. Et retirez le milieu de culture cellulaire.

Assurez-vous que l’actionneur mécanique est en position de déformation nulle et positionnez la membrane sur la civière de manière à ce que les trous de perforation s’alignent avec les goupilles et les pinces. Placez les pinces supérieures en place, puis serrez les vis une par une, en alternant les différents côtés. Ajoutez un millilitre de milieu de culture cellulaire avant de placer l’appareil sur la platine du microscope.

Centrez l’appareil sur le chemin de la lumière. Ensuite, fixez l’appareil à la scène. Concentrez-vous sur la membrane en ajustant les positions dans le plan et verticales du dispositif mécanique à l’aide d’un contrôleur de platine du microscope dans le bloc d’entrée de destination.

Entrez une valeur de comptage de moteur, qui correspond au niveau de déformation souhaité à appliquer. Ensuite, réglez la valeur du bloc d’entrée de vitesse sur 10 tr/min ou moins pour observer le même champ avant et après l’étirement que le champ peut décaler par rapport à l’objectif du microscope, et il peut être nécessaire d’ajuster la platine du microscope pendant l’étirement. Une fois que tout est réglé, cliquez sur go.

Commencez par effectuer des réglages sur le microscope à force atomique. Augmentez la hauteur de la tête FM à sa position maximale dans la direction Z. Ensuite, placez des rallonges sur les jambes pour soulever le plan auquel un cantilever FM entre en contact avec l’échantillon.

Ensuite, retirez de l’appareil photo la plaque du scanner A FM et l’objectif souhaité du microscope. Ajoutez une entretoise à l’objectif, puis remontez-la sur le microscope. Replacez ensuite la plaque du scanner sur l’A FM. La hauteur de l’entretoise dépendra de l’objectif et d’une configuration FM spécifique, mais il est nécessaire d’utiliser l’intercalaire si l’imagerie optique est souhaitée car le plan d’observation sera décalé dans la direction Z.

Ensuite, démarrez le logiciel A FM, le logiciel du microscope optique et toutes les sources lumineuses nécessaires, y compris la source lumineuse pour les mesures de fluorescence. Montez une puce avec un faisceau en porte-à-faux d’une rigidité de 200 pico-newtons par nanomètre ou moins pour mesurer le module d’élasticité des cellules vivantes sur le A FM. Ensuite, alignez le laser, puis montez une lamelle en verre sur l’appareil et utilisez-le pour calibrer la rigidité en porte-à-faux selon les suggestions du fabricant. Immédiatement avant de monter la membrane sur le dispositif d’étirement, coupez les parois à environ un millimètre de hauteur.

Cela réduit les interférences subies entre les parois de la membrane et le capteur de pesage. Retirez ensuite le milieu de culture cellulaire et montez la membrane sur le dispositif mécanique. Placez le dispositif mécanique avec l’adaptateur sur le scanner à l’aide du logiciel.

Étirez la membrane jusqu’au niveau de déformation de traction souhaité avant la nano-indentation. Ajoutez 0,5 millilitre ou moins de milieu sur les cellules pour les garder hydratées, mais veillez également à éviter un déversement qui pourrait endommager un scanner FM ou un microscope. Engagez ensuite la poutre en porte-à-faux avec la membrane.

Suivez le protocole de l’appareil A FM particulier pour balayer les zones d’intérêt. Lorsqu’une souche de 20 % a été appliquée à des cellules ensemencées sur la membrane, les cellules ont déplacé 20 %Comme indiqué ici, l’impact des cellules sur la production d’espèces réactives de l’oxygène a été mesuré dans les cellules épithéliales bronchiques à l’aide d’un capteur de superoxyde mitochondrial cumulatif comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement. En l’absence d’étirement mécanique, la production de ROS n’a pas augmenté de manière significative sur 60 minutes lorsqu’un seul étirement de 17 % a été appliqué et maintenu.

Il y a eu une augmentation de la ROS mitochondriale qui a persisté pendant encore 60 minutes avec l’incorporation de la civière mécanique dans le microscope à force atomique. Le module d’élasticité et les cartes des cellules épithéliales pulmonaires de souris avant et après une déformation de traction de 10 % ont été obtenues dans les régions décrites ici. 300 courbes de déflexion forcée individuelles ont été enregistrées sur une zone de 40 par 40 micromètres, montrant un changement dans la localisation des régions à haut module avec l’application de la déformation.

Une fois maîtrisé, l’étirement cellulaire peut être effectué en 15 minutes. Bien qu’une nano-indentation FM puisse prendre deux heures de fonctionnement correct Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de manipuler les cellules avec précaution mais rapidement, car les résultats peuvent être affectés négativement par l’agitation et l’exposition prolongée à l’air ambiant avant que les données ne soient rapportées. N’oubliez pas que travailler avec un FM peut être extrêmement difficile.

Des précautions telles que garder tous les liquides à l’écart du scanner doivent être prises lors de l’exécution de cette procédure.