Imagerie sur cellule vivante pendant stretch mécanique

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer le rôle de la contrainte mécanique sur la mécanobiologie cellulaire en temps quasi réel. Cela est réalisé en premier lieu en construisant un système comportant des membranes flexibles sur lesquelles des cellules sont cultivées et étirées. Dans un deuxième temps, la membrane est étirée afin d'étalonner les impulsions moteur par rapport à la déformation de la membrane.

Ensuite, les cellules épithéliales pulmonaires de souris sont étirées et les noyaux sont observés en microscopie. Afin de démontrer que la déformation membranaire est transmise aux cellules, les étireurs sont ensuite intégrés dans un microscope à force atomique (A FM) pour réaliser une nano-indentation permettant de mesurer la rigidité des cellules individuelles avant et après l'étirement. Les résultats montrent des dommages directs aux cellules dus à l'étirement appliqué.

Toujours fondée sur l'imagerie de fluorescence, la production d'espèces réactives de l'oxygène augmente avec l'étirement. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie mécanique du poumon, notamment de déterminer si les cellules épithéliales peuvent être endommagées par une ventilation mécanique. Elle peut fournir des informations sur la biologie mécanique des cellules pulmonaires et peut également être appliquée à d'autres tissus mous, tels que des tranches de foie ou de cartilage de croissance.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison de la combinaison peu conventionnelle d'outils utilisés dans ces expériences, comme le microscope à force atomique. Commencez par préparer une membrane de PDMS revêtue de collagène, modifiée pour être utilisée en culture cellulaire, comme décrit dans le protocole accompagnant le texte. Ensuite, semez des cellules épithéliales pulmonaires de souris à raison de 2,5 millions de cellules par puits sur une membrane souple stérile recouverte de collagène.

Incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 %CO2 pendant deux jours jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence. Ensuite, utilisez un poinçon de biopsie de 1,5 millimètre pour percer deux trous dans chacun des six onglets de serrage, à 20,5 millimètres du centre de la construction si aucune précontrainte n'est souhaitée. Puis retirez le milieu de culture cellulaire.

Veillez à ce que l'actionneur mécanique soit en position de déformation nulle, puis placez la membrane sur le dispositif d'étirement de manière à ce que les trous d'encrage s'alignent avec les broches et les pinces. Mettez en place les pinces supérieures, puis serrez les vis une par une, en alternant entre les côtés opposés. Ajoutez un millilitre de milieu de culture cellulaire avant de placer l'appareil sur la platine du microscope.

Centre l'appareil sur le trajet de la lumière. Ensuite, fixe l'appareil sur la platine. Focalise sur la membrane en ajustant les positions dans le plan et verticale du dispositif mécanique à l’aide du contrôleur de platine du microscope dans le bloc d’entrée de destination.

Saisissez une valeur de nombre de tours du moteur, qui correspond au niveau de contrainte souhaité à appliquer. Ensuite, réglez la valeur dans le bloc d'entrée de vitesse à 10 tr/min ou moins afin d'observer le même champ avant et après l'étirement, car le champ peut se déplacer par rapport à l'objectif du microscope, et il peut être nécessaire d'ajuster le plateau du microscope pendant l'étirement. Une fois tout configuré, cliquez sur « go ».

Commencez par effectuer des réglages sur le microscope à force atomique. Augmentez la hauteur de la tête FM à sa position maximale dans la direction Z. Ensuite, placez des rallonges sur les pieds afin de surélever le plan auquel le levier FM entre en contact avec l'échantillon.

Ensuite, retirez la platine du scanner A FM et l'objectif souhaité du microscope. Ajoutez un entretoise à l'objectif, puis remontez-le sur le microscope. Replacez ensuite la platine du scanner sur l'A FM. La hauteur de l'entretoise dépendra de l'objectif et de la configuration spécifique de l'A FM, mais l'utilisation d'une entretoise est nécessaire si l'on souhaite réaliser un imaging optique, car le plan d'observation sera décalé dans la direction Z.

Ensuite, lancez le logiciel de MFA, le logiciel du microscope optique et toutes les sources de lumière nécessaires, y compris la source de lumière pour les mesures de fluorescence. Montez sur la MFA une puce munie d'une poutre en console ayant une rigidité de 200 piconewtons par nanomètre ou moins afin de mesurer le module d'élasticité de cellules vivantes. Alignez ensuite le laser, puis placez une lame de verre sur l'appareil et utilisez-la pour étalonner la rigidité de la console conformément aux recommandations du fabricant. Juste avant de monter la membrane sur le dispositif d'étirement, découpez les parois à une hauteur d'environ un millimètre.

Cela réduit les interférences entre les parois de la membrane et la cellule de charge. Ensuite, retirez le milieu de culture cellulaire et fixez la membrane sur le dispositif mécanique. Placez le dispositif mécanique muni de l'adaptateur sur le scanner à l'aide du logiciel.

Étirez la membrane jusqu'au niveau de déformation en traction souhaité avant l'indentation nano. Ajoutez 0,5 millilitre ou moins de milieu sur les cellules pour les maintenir hydratées, tout en prenant soin d'éviter tout déversement pouvant endommager le scanner FM ou le microscope. Ensuite, engagez la poutre en porte-à-faux avec la membrane.

Suivez le protocole propre à l'appareil de microscopie à force atomique (AFM) pour balayer les zones d'intérêt. Lorsqu'une déformation de 20 % a été appliquée à des cellules ensemencées sur la membrane, les cellules se sont déplacées de 20 %, comme indiqué ici. L'impact des cellules sur la production d'espèces réactives de l'oxygène a été mesuré dans des cellules épithéliales bronchiques à l'aide d'un capteur cumulatif de superoxyde mitochondrial, tel que décrit dans le protocole accompagnant le texte. En l'absence d'étirement mécanique, la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) n'a pas augmenté de manière significative au cours de 60 minutes lorsque un seul étirement de 17 % a été appliqué et maintenu.

Il y a eu une augmentation des ERO mitochondriaux qui s'est maintenue pendant encore 60 minutes avec l'intégration de l'étireur mécanique dans le microscope à force atomique. Le module d'élasticité, ainsi que les cartes de cellules épithéliales pulmonaires de souris avant et après une déformation en traction de 10 %, ont été obtenus à partir des régions délimitées ici. Trois cents courbes individuelles de déflexion forcée ont été enregistrées sur une zone de 40 par 40 micromètres, montrant un changement dans la localisation des régions à haut module lors de l'application de la déformation.

Une fois maîtrisée, l'étirement des cellules peut être réalisé en 15 minutes. Alors qu'une nanoindentation par MF peut prendre deux heures pour être correctement effectuée, il est important de manipuler les cellules avec précaution mais rapidité lors de cette procédure, car les résultats pourraient être altérés par une agitation ou une exposition prolongée à l'air ambiant avant la collecte des données. N'oubliez pas que travailler avec une MF peut s'avérer extrêmement difficile.

Des précautions telles que maintenir tous les liquides à distance du scanner doivent être prises lors de l'exécution de cette procédure.