Name: Imagerie sur cellule vivante pendant stretch mécanique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Découvrez l'imagerie en temps réel de cellules vivantes soumises à une traction mécanique. Cette méthode utilise un actionneur motorisé pour étudier les réponses mécanobiologiques des cellules épithéliales pulmonaires de souris.

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Les auteurs souhaitent remercier que Fedex Institut de technologie de l&#39;Université de Memphis pour leur soutien. Les auteurs tiennent à remercier les étudiants du groupe de projet de conception principal au Département de génie mécanique à l&#39;Université de Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn du département Université de Memphis Technologie du génie pour le contrôle moteur , et le Dr Bin Teng et Mme Charlean Luellen pour leur aide dans la culture cellulaire. Ce travail a été soutenu par K01 HL120912 (ER) et R01 HL123540 (CMW).

1. Construction de la membrane avec le bien Murs pour la rétention de Cell Culture, des Médias (voir la figure 1D pour le produit final) <ol><li> Utilisation de polydiméthylsiloxane (PDMS) tôles revêtues avec collagène I, découper le contour de la membrane flexible avec un scalpel ou une filière. </li><li> Placez chaque membrane dans une boîte de 60 mm de Pétri pour le stockage. </li><li> Création de murs: <ol><li> Mélanger PDMS à un ratio de 10: 1 en poids d&#39;élastomère élastomère A à B (durcisseur). </li><li> Verser 5 ml de PDMS entièrement mixtes en tubes de 50 ml. </li><li> Passer tubes de 50 ml avec PDMS non durcies à l&#39;horizontale dans un four à hybridation. </li><li> Utiliser la fonction de rotor pour revêtir les parois intérieures des tubes à huit tours par minute pendant le temps de durcissement. A température ambiante, le PDMS seront entièrement durcies dans les 2 jours. </li><li> Retirer les PDMS à partir du tube dans une hotte de culture cellulaire stérile. </li><li> Utilisation d&#39;une nouvelle lame de rasoir, partitionner le cylindre de PDMS en sections de 4 mm de hauteur. </li><li> Placez les sections, qui serviront de wa membranells, dans un plat contenant Petri sans permettre les murs pour se froisser. </li></ol></li><li> Sélectionnez et le centre d&#39;un mur de PDMS sur une membrane, tout en maintenant les deux dans la boîte de Pétri. </li><li> Placez délicatement PDMS non durcis (10: 1 ratio) sur le périmètre extérieur de la paroi pour être utilisés comme de la colle. Eviter la formation de lacunes entre le mur et la membrane, car il est là pour retenir le liquide. </li><li> Placer chaque boîte de Pétri contenant la membrane rempli et recouvert dans un four à 70 ° C pendant 24 heures pour durcir. </li></ol> 2. Corrélation des rotations moteur avec Clamp déplacement ou Radial croissance pour l&#39;étalonnage (Figure 2) <ol><li> Démarrez le logiciel de commande du moteur. </li><li> Déplacer les mâchoires de l&#39;appareil à l&#39;aide du réglage manuel dans le logiciel de moteur. </li><li> Mesurez la distance et enregistrer la position de comptage du moteur entre des pinces opposées à la fois le déplacement minimum et maximum des pinces. </li><li> Calculer le changement de pour cent dans la distance entre les pinces en fonction du comptage de moteur (~ 0-75k des chiffres). Cela indiquera la souche potentielle maximale atteinte sur la membrane. </li></ol> 3. Application du Plan sur la souris des cellules épithéliales du poumon Ligne (MLE12) <ol><li> Seed MLE12 cellules à 2,5 millions de cellules sur la membrane souple (étape 1) par puits à être confluentes dans les deux jours. La densité d&#39;ensemencement peut varier pour différents types de cellules. </li><li> Assurez-vous que l&#39;actionneur mécanique est dans une position complètement détendue. <ol><li> Retirer milieux de culture cellulaire. </li><li> Utilisation de 1,5 mm poinçons de biopsie, punch deux trous dans chacune des six pince (voir figure 1D) onglets de la membrane. Le positionnement radial des trous détermine la quantité de pré-tension de l&#39;expérience de la membrane initialement. Percez les trous dans un rayon de 20,5 mm sur les onglets de la membrane si aucune pré-tension est souhaitée. </li><li> Placer la membrane sur la civière avec les trous perforés alignant avec les broches à l&#39;intérieur des pinces.Placez pinces supérieures en place. Serrer les vis une par une alternance côtés. </li><li> Ajouter 1 ml de milieu de culture cellulaire. </li></ol></li><li> Placer l&#39;appareil sur la platine du microscope de centrage au milieu de la membrane avec le trajet de la lumière. </li><li> Utilisez du ruban adhésif ou des aimants (si possible) pour fixer le dispositif à la scène. Une fois fixé, le contrôle de l&#39;en-plan (parallèle à la membrane) et verticale (direction z) du dispositif mécanique avec le contrôleur de platine du microscope. </li><li> Appliquer tronçon avec le logiciel fourni par le fabricant en commandant manuellement la position et la vitesse de rotation du moteur 20. </li></ol> 4. Mesure de mitochondriales Reactive Oxygen Species (ROS) <ol><li> Une fois que les cellules sont confluentes, ajouter 2.1 ml de DMEM avec indicateur RT superoxyde mitochondrial (5 uM de concentration finale) directement sur les cellules. </li><li> Incuber pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Laver les cellules doucement trois fois avec un tampon réchauffé dans un bain d&#39;eau pour37 ° C. </li><li> Immédiatement placer la membrane flexible sur la civière (Étape 2.2) déjà en place en vertu d&#39;un microscope confocal verticale. </li><li> Ajouter 1 ml de DMEM avec du milieu sans rouge de phénol et 25 mM de HEPES. </li><li> Définir des filtres d&#39;excitation / émission de 510/580 nm. </li><li> Plusieurs champs image toutes les 15 min pour créer l&#39;évolution temporelle souhaitée de la production de superoxyde mitochondrial. </li><li> A partir d&#39;images capturées, l&#39;intensité de fluorescence fiche histogrammes à chaque intervalle de temps en utilisant un logiciel capable de quantifier l&#39;intensité de fluorescence. </li></ol> 5. Application de stretch et de microscopie à force atomique (AFM) Remarque: Ces étapes sont prévues pour un AFM spécifique et la combinaison de microscope optique (Figure 4 et liste des matières). <ol><li> Préparer l&#39;AFM pour l&#39;expérience. <ol><li> Augmentation de la hauteur de la tête AFM à sa position maximale dans la direction z. </li><li> Mettre diluants sur les jambes de l&#39;AFM àsoulever l&#39;avion à laquelle AFM contacts en porte à faux de l&#39;échantillon. L&#39;échantillon et la tête AFM doit être soulevé pour accueillir la hauteur du dispositif mécanique. </li></ol></li><li> Préparer le microscope optique (si disponible). <ol><li> Retirer la plaque du scanner de l&#39;AFM. Retirer l&#39;objectif souhaité. </li><li> Ajouter une entretoise à l&#39;objectif. La hauteur de l&#39;entretoise dépendrait de l&#39;objectif et l&#39;AFM spécifique set-up, mais il est nécessaire si l&#39;imagerie optique est souhaitée depuis plan d&#39;observation sera changement dans la direction z par un montant égal à la civière et la hauteur de l&#39;adaptateur (Figure 5A). Notez que l&#39;AFM fournit habituellement l&#39;imagerie à faible grossissement d&#39;un chemin optique au-dessus du dispositif. </li><li> Montez le dos objectif souhaité dans son emplacement. Placez le scanner à l&#39;AFM. </li><li> Démarrez le logiciel de l&#39;AFM. Lancer toutes les sources de lumière nécessaires, y compris la source de lumière pour les mesures de fluorescence. </li><li> Monter une puce avec un faisceau cantileverest approprié pour les mesures souhaitées. 200 PN / rigidité nm ou moins est préférable lorsque l&#39;on mesure le module d&#39;élasticité de cellules vivantes. </li><li> Aligner le laser et calibrer la rigidité en porte à faux selon les suggestions du fabricant sur une lamelle de verre monté sur le dispositif. </li></ol></li><li> Préparer une membrane comme dans l&#39;étape 1, mais avec les modifications suivantes. <ol><li> Immédiatement avant le montage de la membrane sur le dispositif d&#39;étirement, couper les murs à environ 1 mm de hauteur. Ceci permet d&#39;éviter les interférences entre les parois connu de membrane et la cellule de charge. </li><li> Monter la membrane sur le dispositif mécanique comme décrit 3.2.1-3.2.3. </li><li> Retirez le support de culture cellulaire pour éviter d&#39;endommager le scanner de l&#39;AFM en cas de déversement. </li><li> Couple l&#39;appareil avec un adaptateur (figure 5A). Placez le dispositif mécanique avec l&#39;adaptateur sur le scanner. </li><li> Étirer la membrane au niveau de la contrainte de traction désirée. </li></ol></li><li&gt; Nano-indentation des cellules étirées. <ol><li> Ajouter un limité (&lt;0,5 ml) du volume des médias sur les cellules pour éviter scanner AFM ou des dommages en raison d&#39;un microscope déversement. </li><li> Engager la poutre en porte à faux avec la membrane. </li><li> Suivez le protocole de l&#39;appareil de l&#39;AFM particulière à balayer des zones d&#39;intérêt. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Un dispositif unique pour l&#39;imagerie de cellules vivantes au cours stretch mécanique a été développé; et ce dispositif a été utilisé dans un protocole d&#39;étudier épithéliale du poumon cellule mécanobiologie. Dans des études préliminaires, on a constaté que seul un tronçon tenue stimulé la production de superoxyde mitochondriale dans les cellules épithéliales bronchiques. En outre, il a été démontré que l&#39;augmentation des niveaux de contrainte mécanique causé des dommages directs à l&#39;intégrité d&#39;une mo...

Les cellules sont soumises à des contraintes mécaniques dans de nombreux tissus, et cette stimulation mécanique a été montré pour promouvoir des changements dans les profils d&#39;expression de gène, la libération de facteurs de croissance, des cytokines, ou le remodelage de la matrice extracellulaire et du cytosquelette 4.1. Les signaux intracellulaires transduction de ces stimuli mécaniques se produisent à travers le processus de mécanotransduction 5-7. Dans le système respiratoire, une issue de mécanotransduction est l&#39;augmentation des espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) et 8,9 cytokines pro-inflammatoires dans 10 les cellules epitheliales pulmonaires en présence de contrainte de traction cyclique. Des preuves solides suggère également que la contrainte de tension excessive conduit à diriger un dommage à l&#39;épithélium alvéolaire, en plus des réactions biochimiques de cellules 11-14. Bien que l&#39;accent est mis ici principalement sur la réponse des cellules pulmonaires à la déformation mécanique, voies induites par mécanotransduction jouent un rôle clé dans les basic fonction de nombreux tissus dans le corps humain, y compris la régulation du tonus vasculaire 15 et le développement de la plaque de croissance 16. L&#39;intérêt croissant pour mécanotransduction a donné lieu à la mise au point de nombreux dispositifs pour l&#39;application de contraintes mécaniques physiologiquement pertinentes à des cellules en culture et des tissus. En particulier, les dispositifs en appliquant une contrainte de traction, qui est une forme courante de chargement mécanique subi par le tissu, sont populaires 11,17-19. Cependant, de nombreux dispositifs disponibles sont soit conçu comme un bioréacteur pour les applications d&#39;ingénierie tissulaire ou ne sont pas propices à une véritable imagerie de temps avec étirement. En tant que tel, il est nécessaire de développer des outils et des méthodes qui permettent de visualiser les cellules et les tissus en tension pour faciliter l&#39;étude des voies de transduction mécanique. Ici, un dispositif d&#39;étirement mécanique dans le plan a été conçu et protocoles ont été élaborés pour appliquer multiples formes de la souche de tissus et de cellules, tout en permettant l&#39;imagerie des réponses biochimiques et mécaniques en temps réel (figure 1A-D). Le dispositif utilise six pinces régulièrement espacées disposées circonférentiellement pour saisir une membrane flexible et d&#39;appliquer une dans le plan, une distension radiale jusqu&#39;à environ 20% (figure 1B). Le dispositif d&#39;actionnement peut être placé dans un incubateur de culture cellulaire pendant une période prolongée de temps, tandis que le moteur (Figure 1C) est placée à l&#39;extérieur de l&#39;incubateur et contrôlé par un logiciel propriétaire fourni par le fournisseur du moteur. Le moteur est connecté à un conducteur linéaire, ce qui fait tourner une came interne, entraînant les six pinces Châssis uniformément en tension et de détente. En plus du dispositif mécanique, les membranes flexibles personnalisés ont été créés à partir de culture disponibles dans le commerce des membranes de cellules prêtes à être utilisé dans le système mécanique. Ensuite, les parois circulaires (avec un diamètre d&#39;environ28 mm) ont été faites sur et fixé à la membrane souple de sorte que les cellules peuvent être cultivées seulement dans cette région de bien décrit le profil de contrainte. Afin de déterminer si le placement de ces membranes dans le dispositif d&#39;actionnement de fournir souche uniforme et isotrope dans le centre de la membrane flexible, l&#39;analyse d&#39;éléments finis a été réalisée en utilisant un logiciel disponible dans le commerce (figure 1E-F). La membrane flexible a été modélisée avec des conditions aux limites symétriques et en utilisant tous les éléments quadrilatères pour la maille. Les anneaux concentriques vu dans le tracé de contour de la souche maximum principal illustré à la figure 1F indiquent la distribution isotrope de la souche. La souche subie par la membrane a été mesurée en enregistrant des images des repères à travers chargement (figure 2). La figure 2D montre que la souche de membrane moyenne mesurée dans les directions radiale et axiale est approximativement linéaireen ce qui concerne le moteur appliqué compte jusqu&#39;à une déformation linéaire maximum de 20%. Il n&#39;y avait aucune différence significative entre les niveaux de déformation mesurées pendant la distension par rapport à celles mesurées pendant la rétraction à la position de repos. Ensuite, le déplacement de cellules epitheliales bronchiques humaines (16HBE) et de leurs noyaux de culture sur la membrane souple sur mesure ont été mesurées. Marqué par fluorescence (DAPI) noyaux des cellules ont été imagées 16HBE en utilisant un objectif 20X sous un microscope confocal, alors que le déplacement de la cellule entière a été mesuré à l&#39;aide des images à contraste de phase enregistrées avec un microscope numérique. Comme on le voit sur ​​la figure 3, la déformation mesurée par déplacement des noyaux était similaire à celle mesurée par déplacement de marquage sur la membrane, jusqu&#39;à environ 20% de déformation linéaire. Cela confirme que la contrainte appliquée aux membranes a été transmis aux cellules adhérentes. Les protocoles décrivant l&#39;utilisation de l&#39;appareil de mesure sur un microscope traditionnelle et un microscop à force atomiquee sont fournies dans les étapes suivantes.

<table><tbody><tr><td>SmartMotor NEMA 34 : Série 3400</td><td>MOOG Animatics</td><td>SM3416D</td><td>Moteur intégré, contrôleur, amplificateur, codeur et bus de communication</td></tr><tr><td>Membrane Flexcell (revêtement Collagen I)</td><td>Flexcell International Corp</td><td>SM2-1010C</td><td>3.5"&nbsp ; x&nbsp ; 5.25"&nbsp ; x&nbsp ; 0.020"</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>10:1</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1399</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>coloration MitoSOX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>Tiron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7389&nbsp ;</td><td>Marquage du superoxyde mitochondrial</td></tr><tr><td>Inhibiteur de superoxyde</td> <td>DMEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td> HEPES <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-19</td><td>N’importe quel tube de centriguge peut être utilisé pour créer une zone d’imagerie.</td></tr><tr><td>Four d’hybridation</td><td>Bellco Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLE12 Cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-2110</td><td>Cellules épithéliales pulmonaires de souris&nbsp ;</td></tr><tr><td>16Cellules</td><td>HBE ATCC</td><td>CRL-2741</td><td>Cellules épithéliales bronchiques humaines</td></tr><td colspan="4">AFM Indentation ExperimentsCantilever Beams for Nano-indentation Budget Sensors Si-Ni30 AFM&nbsp ;<tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Asylum Research</td><td>MFP3D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Olympus</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td>Microscope inversé avec objectifs 20X et 40X.</td></tr><tr><td>AFM Leg Extenders</td><td>Asylum Research</td><td>Non disponible</td><td>Microscope</td></tr><tr> AFM<td colspan="4">Finite Elements Analyses</td></tr><tr><td>ABAQUS</td><td>Simulia</td><td>6.12</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microscopes</td></tr><tr><td>Digital microscope</td><td>Life Technologies</td><td>EVOS XL Core</td><td>Initialement une entreprise autonome, aujourd’hui détenue par Life Technologies.</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710</td><td>Microscope droit à 2 photons</td></tr></tbody></table>

imagerie sur cellule vivante pendant stretch mécanique

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Il y a actuellement un intérêt significatif à comprendre comment les cellules et les tissus réagissent aux stimuli mécaniques, mais les approches actuelles sont limitées dans leur capacité à mesurer les réponses en temps réel dans des cellules vivantes ou des tissus viables. Un protocole a été mis au point à l’aide d’un actionneur cellulaire pour distendre les cellules vivantes cultivées sur un substrat élastique ou les tissus attachés à celui-ci lors de l’imagerie par microscopie confocale et à force atomique (AFM). Des études préliminaires montrent que l’étirement tonique des cellules épithéliales bronchiques humaines a provoqué une augmentation significative de la production de superoxyde mitochondrial. De plus, à l’aide de ce protocole, les cellules épithéliales alvéolaires ont été étirées et imagées, ce qui a montré des dommages directs aux cellules épithéliales par une surdistension simulant une forme de lésion pulmonaire in vitro. Un protocole pour effectuer une nano-indentation AFM sur des cellules étirées est également fourni.

Reactive Oxygen Species et Déformation Des études antérieures ont démontré une augmentation des espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) dans les voies aériennes et les cellules épithéliales alvéolaires en réponse à l&#39;étirement cyclique 21. Les espèces réactives de l&#39;oxygène comprennent des molécules et de radicaux libres dérivés de l&#39;oxygène moléculaire avec une haute réactivité pour les lipides, les protéines, les polysaccharides et les acides nucléiques <su...

Un nouveau protocole d’imagerie a été développé à l’aide d’un actionneur mécanique motorisé personnalisé pour permettre la mesure des réponses en temps réel à la déformation mécanique dans les cellules vivantes. Pertinent pour la mécanobiologie, le système peut appliquer des contraintes allant jusqu’à 20 % tout en permettant une imagerie en temps quasi réel avec la microscopie confocale ou à force atomique.

Imagerie sur cellule vivante pendant stretch mécanique

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer le rôle de la contrainte mécanique sur la mécanobiologie cellulaire en temps quasi réel. Cela est réalisé en premier lieu en construisant un système comportant des membranes flexibles sur lesquelles des cellules sont cultivées et étirées. Dans un deuxième temps, la membrane est étirée afin d'étalonner les impulsions moteur par rapport à la déformation de la membrane.Ensuite, les cellules épithéliales pulmonaires de souris sont étirées et les noyaux sont observés en microscopie. Afin de démontrer que la déformation membranaire est transmise aux cellules, les étireurs sont ensuite intégrés dans un microscope à force atomique (A FM) pour réaliser une nano-indentation permettant de mesurer la rigidité des cellules individuelles avant et après l'étirement. Les résultats montrent des dommages directs aux cellules dus à l'étirement appliqué.Toujours fondée sur l'imagerie de fluorescence, la production d'espèces réactives de l'oxygène augmente avec l'étirement. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie mécanique du poumon, notamment de déterminer si les cellules épithéliales peuvent être endommagées par une ventilation mécanique. Elle peut fournir des informations sur la biologie mécanique des cellules pulmonaires et peut également être appliquée à d'autres tissus mous, tels que des tranches de foie ou de cartilage de croissance.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison de la combinaison peu conventionnelle d'outils utilisés dans ces expériences, comme le microscope à force atomique. Commencez par préparer une membrane de PDMS revêtue de collagène, modifiée pour être utilisée en culture cellulaire, comme décrit dans le protocole accompagnant le texte. Ensuite, semez des cellules épithéliales pulmonaires de souris à raison de 2,5 millions de cellules par puits sur une membrane souple stérile recouverte de collagène.Incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 %CO2 pendant deux jours jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence. Ensuite, utilisez un poinçon de biopsie de 1,5 millimètre pour percer deux trous dans chacun des six onglets de serrage, à 20,5 millimètres du centre de la construction si aucune précontrainte n'est souhaitée. Puis retirez le milieu de culture cellulaire.Veillez à ce que l'actionneur mécanique soit en position de déformation nulle, puis placez la membrane sur le dispositif d'étirement de manière à ce que les trous d'encrage s'alignent avec les broches et les pinces. Mettez en place les pinces supérieures, puis serrez les vis une par une, en alternant entre les côtés opposés. Ajoutez un millilitre de milieu de culture cellulaire avant de placer l'appareil sur la platine du microscope.Centre l'appareil sur le trajet de la lumière. Ensuite, fixe l'appareil sur la platine. Focalise sur la membrane en ajustant les positions dans le plan et verticale du dispositif mécanique à l’aide du contrôleur de platine du microscope dans le bloc d’entrée de destination.Saisissez une valeur de nombre de tours du moteur, qui correspond au niveau de contrainte souhaité à appliquer. Ensuite, réglez la valeur dans le bloc d'entrée de vitesse à 10 tr/min ou moins afin d'observer le même champ avant et après l'étirement, car le champ peut se déplacer par rapport à l'objectif du microscope, et il peut être nécessaire d'ajuster le plateau du microscope pendant l'étirement. Une fois tout configuré, cliquez sur « go ».Commencez par effectuer des réglages sur le microscope à force atomique. Augmentez la hauteur de la tête FM à sa position maximale dans la direction Z. Ensuite, placez des rallonges sur les pieds afin de surélever le plan auquel le levier FM entre en contact avec l'échantillon.Ensuite, retirez la platine du scanner A FM et l'objectif souhaité du microscope. Ajoutez un entretoise à l'objectif, puis remontez-le sur le microscope. Replacez ensuite la platine du scanner sur l'A FM. La hauteur de l'entretoise dépendra de l'objectif et de la configuration spécifique de l'A FM, mais l'utilisation d'une entretoise est nécessaire si l'on souhaite réaliser un imaging optique, car le plan d'observation sera décalé dans la direction Z.Ensuite, lancez le logiciel de MFA, le logiciel du microscope optique et toutes les sources de lumière nécessaires, y compris la source de lumière pour les mesures de fluorescence. Montez sur la MFA une puce munie d'une poutre en console ayant une rigidité de 200 piconewtons par nanomètre ou moins afin de mesurer le module d'élasticité de cellules vivantes. Alignez ensuite le laser, puis placez une lame de verre sur l'appareil et utilisez-la pour étalonner la rigidité de la console conformément aux recommandations du fabricant. Juste avant de monter la membrane sur le dispositif d'étirement, découpez les parois à une hauteur d'environ un millimètre.Cela réduit les interférences entre les parois de la membrane et la cellule de charge. Ensuite, retirez le milieu de culture cellulaire et fixez la membrane sur le dispositif mécanique. Placez le dispositif mécanique muni de l'adaptateur sur le scanner à l'aide du logiciel.Étirez la membrane jusqu'au niveau de déformation en traction souhaité avant l'indentation nano. Ajoutez 0,5 millilitre ou moins de milieu sur les cellules pour les maintenir hydratées, tout en prenant soin d'éviter tout déversement pouvant endommager le scanner FM ou le microscope. Ensuite, engagez la poutre en porte-à-faux avec la membrane.Suivez le protocole propre à l'appareil de microscopie à force atomique (AFM) pour balayer les zones d'intérêt. Lorsqu'une déformation de 20 % a été appliquée à des cellules ensemencées sur la membrane, les cellules se sont déplacées de 20 %, comme indiqué ici. L'impact des cellules sur la production d'espèces réactives de l'oxygène a été mesuré dans des cellules épithéliales bronchiques à l'aide d'un capteur cumulatif de superoxyde mitochondrial, tel que décrit dans le protocole accompagnant le texte. En l'absence d'étirement mécanique, la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) n'a pas augmenté de manière significative au cours de 60 minutes lorsque un seul étirement de 17 % a été appliqué et maintenu.Il y a eu une augmentation des ERO mitochondriaux qui s'est maintenue pendant encore 60 minutes avec l'intégration de l'étireur mécanique dans le microscope à force atomique. Le module d'élasticité, ainsi que les cartes de cellules épithéliales pulmonaires de souris avant et après une déformation en traction de 10 %, ont été obtenus à partir des régions délimitées ici. Trois cents courbes individuelles de déflexion forcée ont été enregistrées sur une zone de 40 par 40 micromètres, montrant un changement dans la localisation des régions à haut module lors de l'application de la déformation.Une fois maîtrisée, l'étirement des cellules peut être réalisé en 15 minutes. Alors qu'une nanoindentation par MF peut prendre deux heures pour être correctement effectuée, il est important de manipuler les cellules avec précaution mais rapidité lors de cette procédure, car les résultats pourraient être altérés par une agitation ou une exposition prolongée à l'air ambiant avant la collecte des données. N'oubliez pas que travailler avec une MF peut s'avérer extrêmement difficile.Des précautions telles que maintenir tous les liquides à distance du scanner doivent être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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