Name: Souris Naïf CD4 + Isolement des cellules T et In vitro Différenciation en sous-ensembles de cellules T (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Apprenez à isoler des cellules T CD4+ naïves de souris et à les différencier en vitro en sous-populations T helper distinctes. Cette méthode utilise la séparation magnétique et les cytokines pour étudier la polarisation cellulaire.

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Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du laboratoire Reynolds au Rosalind Franklin Université de médecine et des sciences, et le laboratoire Chen Dong à l&#39;Université du Texas MD Anderson Cancer Center pour l&#39;optimisation de ce protocole. Ce travail a été financé par une subvention de JMR de la National Institutes of Health (K22AI104941).

Toutes les procédures expérimentales sont effectuées en utilisant les protocoles approuvés par le bureau de la santé et de la sécurité de l&#39;environnement à l&#39;Université Franklin Rosalind de médecine et des sciences. C57BL / 6 (acheté chez NCI) utilisé pour ce protocole ont été logés dans des conditions exemptes d&#39;organismes pathogènes spécifiques, et toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en utilisant des protocoles approuvés par le Comité soin et l&#39;utilisation institutionnelle des animaux (IACUC) au Franklin Université Rosalind de médecine et Science. 1. Préparation des instruments, des fournitures et réactifs <ol><li> Manteau de 48 puits ou à 24 puits avec des plaques anti-CD3 et anti-CD28 (Tableau 1) dans PBS stérile, couvrir et envelopper dans du parafilm pour éviter l&#39;évaporation et la contamination, puis incuber O / N à 4 o C le jour avant T isolement des cellules. Alternativement, revêtir les puits 1 h à 37 o C. Effectuer conditions Th0, Th1, Th2, et en revêtant la fois iTreg anti-CD3 et anti-CD28 à 1 pg / ml dans 0,5 à 1 ml dele volume tal (plaque 48 puits). Pour Th17, nous typiquement couche anti-CD3 à 2 ug / ml et anti-CD28 à 1 ug / ml. REMARQUE: Nous avons trouvé qu&#39;une concentration inférieure anti-CD3 est optimale pour la génération Th1, Th2, et iTreg alors qu&#39;une concentration plus élevée anti-CD3 est optimale pour la génération Th17. Ainsi, l&#39;anti-CD3 et anti-CD28 concentrations doivent être titrés et optimisés pour les laboratoires individuels (tableau 2). </li><li> Stériliser un ensemble d&#39;outils de dissection (des ciseaux et des pinces) par une solution autoclave ou désinfectant. Un tube ou petit bécher contenant 70% d&#39;éthanol seront nécessaires pour la stérilisation rapide d&#39;outils entre les dissections. Enfin, un flacon pulvérisateur contenant 70% d&#39;éthanol sera nécessaire pour la stérilisation de la surface de la souris avant la dissection. </li><li> Préparer une surface de dissection en enroulant un morceau plat de styromousse ou de liège dans une feuille d&#39;aluminium. Épingles ou des aiguilles de dissection sont utilisés pour fixer l&#39;animal en place. </li><li> Préparer des plats ou des plaques de collecte de tiquest. Si les tissus de mise en commun, 60mm plats séparés contenant 3 ml de solution stérile PBS + 1% de FBS (PBS +) pour les tissus de la rate et des ganglions lymphatiques est suffisante. Si gardant tissus provenant de souris individuelles séparées, préparer un 1ml plaque de 24 puits contenant de PBS + dans le nombre souhaité de puits. </li><li> Préparer du milieu RPMI complet pour la culture cellulaire et pré-chaud avant utilisation (tableau 1). NOTE: Nous utilisons régulièrement RPMI mais d&#39;autres médias tels que IMDM et DMEM peut être tout aussi efficace ou supérieure selon le laboratoire et l&#39;expérience. </li><li> Couper des carrés de 2x2 cm nylon engrènent avec une taille de pores de 120 um et autoclave pour stériliser (tableau 1). </li><li> Facultatif: si vous utilisez la cellule magnétique à haute vitesse système de tri comme autoMACS pour l&#39;enrichissement de cellules CD4 +, la course pré-chaud et le rinçage tampons C dans un bain d&#39;eau à 37 o pour éviter d&#39;endommager la machine. </li><li> NOTE: L&#39;enrichissement est recommandé d&#39;augmenter le rendement de tri et de diminuer le temps de tri. </li><li> Tousétapes de préparation, à l&#39;exception de dissection, doivent être effectuées dans une hotte de culture tissulaire stérile. </li></ol> 2. Isolement des ganglions lymphatiques et la rate de souris <ol><li> Euthanasier le nombre requis d&#39;animaux en utilisant une technique institutionnellement approuvé. Utilisez C57BL / 6 souris femelles, l&#39;âge 5-10 semaines, en raison de leur pourcentage élevé de cellules T naïves et graisse du bas du corps en comparaison aux hommes ou à des souris âgées. REMARQUE: Les cellules dérivées de souris mâles se effectuer de façon similaire in vitro et les étapes du protocole restent les mêmes. Des souris femelles, âgées de 5 à 10 semaines, donne habituellement 3-6 x 10 6 cellules naïves T CD4 + par souris. Cependant, en utilisant différentes souches de souris peuvent affecter le rendement et la performance. Par exemple, des cellules provenant de souris C57BL / 6 sont meilleurs pour générer des cellules Th1 tandis que les cellules provenant de souris Balb.c sont meilleurs pour générer des cellules Th2. </li><li> Répartir les membres de l&#39;animal et les épingler en place comme le montre la figure 1. Couper la peau à longitudinally de l&#39;anus vers le menton tout en faisant attention à ne pas percer des tissus plus profonds. </li><li> Déployez la peau avec une pince et la broche de la peau en place pour permettre un accès facile aux ganglions lymphatiques comme le montre la figure 1. </li><li> Récolter les ganglions lymphatiques accessibles depuis les emplacements indiqués sur la figure 1. Saisir le ganglion lymphatique avec une paire de pinces pendant que le tissu de séparation avec une autre paire de pinces permet un retrait facile. Placez le tissu dans le plat de collecte. </li><li> Récolter la rate à partir de l&#39;emplacement représenté sur la figure 1. Dans ce cas, la découpe soigneuse dans le péritoine est nécessaire pour accéder à la rate. Placez le tissu dans un plat de collecte. </li><li> Répétez la procédure si d&#39;autres tissus seront récoltés. Procéder autrement pour les prochaines étapes. À ce stade, effectuer toutes les étapes restantes sur la glace jusqu&#39;à ce que le placage des cellules T après le tri. </li></ol> 3. Traitement des tissus et CD4 + Enrichissement<ol><li> Traiter les ganglions lymphatiques et la rate dans différents plats pour augmenter le rendement de préparations de cellules ganglionnaires ne nécessitent pas la lyse des érythrocytes, ce qui peut entraîner la mort de leucocytes mineur. Par conséquent, les étapes ci-dessous décrivent un procédé pour traiter des populations de rate et de ganglions lymphatiques puis en combinant séparément avant l&#39;étiquetage pour le tri. </li><li> Retirer le tissu (la rate ou des ganglions lymphatiques communs) de la boîte de collecte et dans une nouvelle boîte de 60 mm contenant 3 ml de PBS +. Placer un carré de nylon stérile maillage sur le tissu en utilisant des pinces stériles. </li><li> Prenez le côté du pouce d&#39;un piston de la seringue (3-10 ml) et casser doucement le tissu contre la maille. Presque tous les tissus devrait aller en suspension. Sinon, placez le tissu entre deux lames dépolies autoclaves et broyé en suspension. </li><li> Introduire à la pipette la suspension de haut en bas à quelques reprises pour briser les mottes solubles restantes. Placez un nouveau carré de filet de nylon sur l&#39;ouverture d&#39;une15 ml de tube conique et filtrer la suspension à travers pour éliminer les débris restants. </li><li> Répétez les étapes 2-4 pour ganglionnaire supplémentaires et le tissu splénique. </li><li> Une fois que la suspension a été filtrée dans un tube de 15ml remplir le reste du tube avec du PBS + et retournant plusieurs fois. Centrifuger les cellules à 475 g pendant 5 min à 4 o C. </li><li> Pour les cellules spléniques, aspirer le surnageant après centrifugation et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml d&#39;une solution glacée ACK par rate 1X pendant 1 min pour lyser les érythrocytes. Ensuite, ajoutez 10 ml de PBS + sur le dessus de l&#39;ACK, inverser le tube et centrifuger 475 g pendant 5 min à 4 o C. </li><li> Pour les cellules de ganglions lymphatiques, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 2 ml de PBS +. Si on le désire ceux-ci peuvent être combinés avec les cellules spléniques après leur lyse ACK et l&#39;étape de lavage. </li><li> Aspirer le surnageant après centrifugation des splénocytes et remettre en suspension dans 10 ml de PBS +. A ce stade, la suspension de ganglion lymphatique peut être undded au-dessus de la suspension de rate si la mise en commun des tissus est nécessaire pour le tri. Centrifuger le tube à nouveau à 475 g pendant 5 min à 4 o C. </li><li> Le culot de cellules peut alors être préparé pour l&#39;enrichissement CD4. Si cette étape ne sera pas exécutée, passer aux étapes de préparation de tri. </li><li> Pour l&#39;enrichissement CD4 en utilisant le système de tri cellulaire magnétique à haute vitesse, remettre en suspension le culot cellulaire avec des billes CD4. Typiquement 15 ul de billes dilué dans 85 pi de PBS + est utilisé pour étiqueter les tissus de 1 souris. Montée en puissance du volume de mélange de perles au besoin, remettre le culot, et incuber pendant 15-30 min à 4 o C. </li><li> Laver les cellules avec 10 ml de PBS +, passer la suspension à travers nylon dans un nouveau tube de 15 ml pour enlever les débris, et centrifuger à nouveau à 475 g pendant 5 min à 4 o C. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 100 pl de PBS par souris + et procéder à une sélection positive sur le système de tri à haute vitesse cellule magnétique. Si l&#39;on utilise un système de séparation manuelle, fuivez les instructions du fabricant pour l&#39;enrichissement. En variante, remettre en suspension les échantillons dans du tampon FACS: PBS avec 1 mM d&#39;EDTA (pH = 8) et BSA à 1%, stérilisée par filtration. </li><li> Retirez la fraction positive et laver de nouveau avec 10 ml de PBS +. La fraction enrichie en cellules CD4 + est maintenant prêt à être étiqueté pour le tri. </li></ol> 4. cellules Tri Naïf T CD4 + <ol><li> Marquer le culot de cellules avec du PBS + contenant des anticorps fluorescents dirigés contre CD62L, CD44, CD25, CD4 et. Si l&#39;on utilise les anticorps énumérés dans le tableau 1, pour chacune des dilutions sont fournis. Pour la coloration, un volume de 100 pl de cocktail d&#39;anticorps est utilisé par les tissus d&#39;une souris. </li><li> Reprendre le culot de cocktail d&#39;anticorps et incuber pendant 15-30 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules avec 10 ml de PBS et centrifuger + 475 g pendant 5 min à 4 o C. </li><li> Passez le mélange sur un autre capuchon de filtre en nylon ou un tamis cellulaire à nouveaudéplacer tout débris. Pipeter des cellules marquées dans un tube qui est compatible pour le trieur de cellules. Gardez cellules sur la glace et à l&#39;abri de la lumière jusqu&#39;à la sorte. </li><li> Préparer des tubes de prélèvement par aspiration de 1-2 ml du milieu RPMI complet ou de FBS dans le fond de tubes compatibles pour la collecte sur un trieur de cellules. </li><li> Trier les cellules naïves T CD4 + en tant que CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - population (Figure 2). Laver les cellules recueillies avec du milieu RPMI complet et centrifuger comme décrit ci-dessus. </li><li> Reprendre le culot dans RPMI complet, compter les cellules naïves, et ajuster la concentration de 1 x 10 6 cellules / ml. </li></ol> 5. Configuration de la différenciation in vitro <ol><li> Aspirer les puits des plaques revêtues anti-CD3 et anti-CD28 et laver chaque puits avec 1 ml de PBS stérile (pas de FBS). Pour les plaques à 48 puits, la plaque 0,5 x 10 6 cellules / puits dans 0,5 ml de RPMI. Pour les plaques à 24 puits, la culture 1 x 10 6 cellules / puits dans 1,0 ml de RPMI. </li><li> Si tester l&#39;influence d&#39;un facteur tel qu&#39;un médicament ajouter la substance dans les puits appropriés, soit avant, pendant ou après le processus de différenciation en fonction de l&#39;expérience. Ensuite, compléter le milieu de culture avec des cytokines et des anticorps de blocage en conséquence. Th0: 30 U / ml hIL-2. Th1: 15 ng / ml de rmIL-12, 30 U / ml de hIL-2, et 5 000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml de rmIL-4, 30 U / ml de hIL-2, 2000 ng / ml 37,51 soluble, et 5 000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml de hIL-2, XMG1.2 5000 ng / ml et 5,000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml de rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, XMG1.2 5000 ng / ml et 5,000 ng / ml 11B11. REMARQUE: Les conditions présentées ci-dessus ont été trouvés être optimale pour maximiser la production de cytokines tel que mesuré à la fin de l&#39;expérience de différentiation (section des résultats représentatifs). Cependant, chaque condition doit être optimisée pour les laboratoires individuels (tableau 2 </strong&gt;). En outre, l&#39;addition d&#39;anti-CD28 soluble en plus de l&#39;anti-CD28 lié à une plaque a été trouvé pour améliorer la production de cytokines Th2 dans notre laboratoire, mais n&#39;a aucun effet sur les autres sous-ensembles de cellules T: </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 4-5 D avant l&#39;analyse de l&#39;expression génétique et la production de cytokines. Alternativement, éliminer les cellules des stimuli TCR après 2 d, ajustée à 1 x 10 6 cellules / ml avec un milieu frais, et la plaque dans de nouveaux puits (non-couché) pour améliorer la prolifération et le rendement final. Dans ce cas, les cytokines polarisantes frais et les anticorps ne sont pas nécessaires, mais 10 U / ml d&#39;IL-2 devraient être ajoutés aux nouveaux médias pour Th0, Th1, Th2 et cultures iTreg. </li></ol> 6. Analyse de la différenciation <ol><li> Pour l&#39;analyse des cytokines par cytométrie de flux, restimuler chaque puits avec 10 ng / ml de PMA et 1 000 ng / ml d&#39;ionomycine ou 1 pg / ml anti-CD3 pendant 4-6 heures en présence d&#39;un inhibiteur de Golgi comme brefeldine A (Tableau1). Effectuer une coloration de cytokine intracellulaire en fonction de l&#39;expérience (figure 3). REMARQUE: Teinture des cytokines ou des facteurs de transcription, comme l&#39;IL-4 (non représenté) et non-IFNy spécifique lignée (figure 3) pour les cultures Th17, pour chaque état ​​en tant que témoins négatifs et comme un indicateur de l&#39;efficacité de la différenciation. En outre, la tache de Foxp3 cultures Th17 que le développement réciproque des Treg peut se produire avec l&#39;ajout de TGFß. </li><li> Pour la quantification des protéines, de recueillir les surnageants provenant de chaque puits de dosage et spécifique à une cytokine par ELISA (figure 3). Si l&#39;on craint que le facteur mis à l&#39;essai a influencé la prolifération par rapport aux échantillons de contrôle, les cellules peuvent être lavées, comptées, normalisée, puis restimulées avec 1 ug / ml d&#39;anti-CD3 pour 24 h avant de recueillir surnageants pour les tests ELISA. Si le dosage de l&#39;IL-4 de type Th2 conditions, le lavage et restimulating est nécessaire d&#39;éliminer l&#39;IL-4 qui peut être leftover partir de la culture initiale de différenciation. </li><li> Pour l&#39;analyse de l&#39;expression du gène par PCR en temps réel, les cellules de récolte après la période d&#39;incubation, laver, normaliser et pour stimuler la re-2-6 h avec 1 pg / ml d&#39;anti-CD3 avant la récolte de l&#39;ARNm (figure 3). </li></ol>

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<li>Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+signaling+in+T+cells+promotes+autoimmune+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).</li>
<li>Reynolds, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+2+signaling+in+CD4%28%2B%29+T+lymphocytes+promotes+T+helper+17+responses+and+regulates+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pathogenic+TH17+cells+by+inducible+salt-sensing+kinase+SGK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1.</a> Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).</li>
<li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pathogenic+T%28H%2917+cells+in+the+absence+of+TGF-beta+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).</li>
<li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li>
<li>Avni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T%28H%29+cell+differentiation+is+accompanied+by+dynamic+changes+in+histone+acetylation+of+cytokine+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes.</a> Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), (2007).</li>
<li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+th17+differentiation+of+naive+CD4+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (79), e50765(2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrentes.

Bien que la rate contient des cellules Th naïves, la proportion de cette population dans les ganglions lymphatiques est beaucoup plus élevé. L&#39;incapacité d&#39;identifier correctement et enlever les ganglions lymphatiques dans ce protocole se traduira par un mauvais rendement des cellules naïves. Cela peut être particulièrement difficile dans les souris des souris mâles âgés ou qui ont plus de tissus gras. Comme le montre la figure 1, une fixation correcte et piégeage des membres et de la peau anima...

Le concept de lignées ou sous-ensembles de CD4 + T auxiliaires distinctes (Th) cellules a été autour depuis la dernière partie du 20 e siècle 1. Reconnaissance de l&#39;antigène correspondant à la présence de signaux de co-stimulation dans les résultats de plusieurs cycles de la prolifération cellulaire et la différenciation ultérieure dans les cellules Th effecteur. Le type de cellule Th générée lors de ce processus dépend de l&#39;environnement de cytokines présentes lors de l&#39;activation 2. Initialement, les cellules Th naïves étaient considérés polariser en deux lignées distinctes suivantes récepteur de cellule T (TCR) d&#39;activation, co-stimulation CD28 ligation et la signalisation des cytokines. 1 des cellules auxiliaires de type Th1 () sont caractérisées par leur production de la cytokine effectrice IFNy ainsi que leur exigence pour l&#39;IL-12 au cours de la signalisation de 3,4 processus de différenciation. Finalement, il a été découvert que les cellules Th1 différenciées ont un profil génétique qui se caractérise plus distinctement by l&#39;expression de la boîte de T facteur de transcription de la famille, Tbx21 (T-bet), qui est considéré comme le régulateur maître du programme génétique Th1 5. En outre, l&#39;IL-12 ainsi que IFN peut favoriser l&#39;expression T-bet 6,7. Dans la réponse immunitaire, les cellules Th1 sont importants pour la défense de l&#39;hôte contre les pathogènes intracellulaires ainsi que des promoteurs forts de l&#39;inflammation auto-immune. En revanche, les cellules de type 2 auxiliaires (Th2) nécessitent l&#39;IL-4 pour leur développement et leur cytokines effectrices, y compris l&#39;IL-4, IL-5 et IL-13, sont importantes pour entraîner des réponses de lymphocytes B et sont pathogènes dans l&#39;allergie 8, 9. Semblables à des cellules Th1, Th2 ont été trouvés pour exprimer leur propre régulateur maître de transcription, appelé GATA-3 10,11. Fait intéressant, la présence de cytokines polarisantes et la génération d&#39;une lignée Th spécifique sont antagonistes à l&#39;élaboration d&#39;autres 2,12, ce qui suggère que seul un sous-ensemble particulier Th peut devenir dominante au cours d&#39;une re immunitaireréponse. Depuis l&#39;identification des lignées Th1 et Th2, d&#39;autres travaux ont démontré sous-ensembles encore plus unique de cellules T auxiliaires, y compris folliculaire aide (TFH), IL-9-production (Th9), et IL-22-production (TH22) (récemment en revue dans 13). Aux fins d&#39;expériences in vitro de différenciation, ce protocole se concentrer uniquement sur ​​deux sous-ensembles Th supplémentaires, appelés cellules T régulatrices (Treg) et les cellules T CD4 + IL-17-production (Th17). cellules T régulatrices CD25 + peuvent se produire naturellement (nTreg) dans le thymus; cellules Th naïves peuvent également être induites (iTreg) pour devenir réglementaire dans la périphérie (revue dans 14,15). Les deux types de Tregs expriment un facteur de transcription caractéristique, appelé boîte forkhead P3 (Foxp3), ce qui est essentiel pour leurs mécanismes de suppression effectrices qui incluent la production soluble anti-inflammatoire médiateur, IL-2 la consommation, et la cellule mécanismes de contact dépendant 14,15. Le manque de Foxp3 résultats d&#39;expression dans un grave, plusieurs organes trouble auto-immune appelés dysrégulation immunitaire, polyendocrinopathie, entéropathie, le syndrome lié à l&#39;X (IPEX), démontrant le rôle critique de ce sous-ensemble Th dans la résolution de l&#39;inflammation et de réglementer la tolérance périphérique aux antigènes du soi 16. In vitro, les cellules T helper CD4 + naïfs jusqu&#39;à régulent Foxp3 et adhérer au programme Treg lors de la stimulation par l&#39;IL-2 et TGF-β 14,15. Il peut être modérée à la plasticité considérable lignées de cellules T CD4 +, en particulier lorsque l&#39;on considère que la production de cytokines (revue dans 17,18). Toutefois, pour les fins de protocoles in vitro de différenciation, nous allons discuter chaque sous-ensemble comme une lignée unique. Récemment, un sous-ensemble de cellules Th17 qui produit la cytokine IL-17 a été identifié comme une lignée unique avec des fonctions pro-inflammatoires qui sont particulièrement pathogène pendant une inflammation auto-immune 19-21. Th17 cellules expriment un facteur de transcription unique appelé liés rétinoïde-récepteur orphelin gamma t (RORγt) qui coordonne le programme génétique 22 Th17. TGFß est important pour la génération de la lignée Th17 par l&#39;induction de RORγt. Cependant, on croit l&#39;effet de la signalisation TGF pour induire seul engagement sur ​​Th17 synergie avec l&#39;IL-6 (revue dans 12). D&#39;autres études ont montré qu&#39;une variété d&#39;autres signaux qui peuvent réguler positivement l&#39;engagement Th17, y compris l&#39;IL-1β, l&#39;augmentation de sodium et de signalisation TLR 23-26. D&#39;autres rapports ont suggéré que les cellules Th17 pathogènes in vivo sont ceux qui contournent effectivement signalisation TGFß et se appuient sur ​​une combinaison de IL-1, IL-6, IL-23 et de 27 leur différenciation. Ainsi, les cellules Th17 peuvent être dérivées d&#39;une variété de voies de signalisation; aux fins de ce protocole, l&#39;couramment utilisé (TGFß et de l&#39;IL-6) voie d&#39;un engagement de la lignée Th17sera présenté. Les protocoles décrits ci-dessous de différenciation pour toutes les lignées effectrices repose sur l&#39;anticorps fixe comme stimuli pour le TCR et CD28 pendant toute la durée de l&#39;expérience. Cependant, d&#39;autres ont démontré que l&#39;activation du TCR avec des cellules présentatrices d&#39;antigène 28 ou de reticulation anti-CD3 et anti-CD28 avec un anticorps de hamster pendant 2 jours 29 sont également des moyens très efficaces pour induire la production de divers sous-ensembles Th. Le protocole présenté ici se appuie sur les méthodes précédemment rapportées pour isoler des cellules T CD4 + murines des organes lymphoïdes secondaires 30 et générer des cellules Th17 31. Une différence majeure est que ce protocole repose sur l&#39;utilisation d&#39;un trieur de cellules pour isoler les cellules T CD4 + naïfs provenant de tissus lymphoïdes. Cependant, de nombreuses entreprises offrent maintenant des kits de séparation rapides qui peuvent enrichir des cellules naïves T CD4 +, qui peuvent être en mesure de contourner l&#39;exigence fou le tri en fonction de l&#39;expérience. Les méthodes et les réactifs présentés dans ce protocole sont ce que nous utilisons régulièrement et de trouver pour être le plus efficace. Cependant, gardez à l&#39;esprit que les réactifs et les méthodes alternatives existent pour la plupart des étapes présentées ci-dessous et ce est au laboratoire individu de déterminer ce qui fonctionnera le mieux pour leurs fins.

<table><tbody><tr><td>RPMI complet :</td><td></td><td></td><td>Réchauffer dans un bain-marie de 37 oC avant utilisation</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>10 % FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1000X 2-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>100X Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>100X L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>maille en nylon de 120 microns</td><td>Amazon</td><td>CMN-0120-10YD</td><td>Coupé en carrés de 2 cm2 et autoclave</td></tr><tr><td>Alternative : crépines à cellules de 100 microns</td><td>Fisher</td><td>08-771-19</td><td>Alternative à la découpe du tampon</td></tr><tr><td>de roulement autoMACS</td> en maille de nylon <td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td>Réchauffer dans un bain-marie de 37 oC avant utilisation</td></tr><tr><td>solution de rinçage autoMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-222</td><td>Réchauffer dans un bain-marie de 37 oC avant utilisation</td></tr><tr><td>billes CD4</td><td>Miltenyi</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse ACK</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Cytokines :</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Humaines (h) IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante (rm) IL-4</td><td>Peprotech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>rmIL-6</td><td>R & D Systems</td><td>406-ML-025</td><td></td></tr><tr><td>rmIL-12</td><td>Peprotech</td><td>210-12</td><td></td></tr><tr><td>hTGFb</td><td>R & D Systems</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2C11 (anti-CD3)</td><td>BioXcell</td><td>BE0001-1</td><td></td></tr><tr><td>37.51 (anti-CD28)</td><td>BioXcell</td><td>BE0015-1</td><td></td></tr><tr><td>11B11 (anti-IL-4)</td><td>BioXcell</td><td>BE0045</td><td></td></tr><tr><td>XMG1.2 (anti-IFNg)</td><td>BioXcell</td><td>BE0055</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD62L-FITC</td><td>BioLegend</td><td>104406</td><td>Utilisation à 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD25-PE</td><td>BioLegend</td><td>102008</td><td>Utilisation à 1:400</td></tr><tr><td>anti-CD4-PerCP</td><td>BioLegend</td><td>100434</td><td>Utilisation à 1:1000</td></tr><tr><td>anti-CD44-APC</td><td>BioLegend</td><td>103012</td><td>Utilisation à 1:500</td></tr><tr><td>Phorbol&nbsp ; 12-myristate 13 acétate (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8139</td><td>Préparer une pâte à 0,1 mg/ml dans du DMSO et congeler les aliquotes à -20 oC</td></tr><tr><td>Ionomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-0634</td><td>Préparer une mère à 0,5 mg/ml dans du DMSO et congeler les aliquotes à -20 oC</td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>eBioscience</td><td>00-4506-51</td><td>Utiliser à 1:1000</td></tr></tbody></table>

souris naïf cd4<sup&gt; +</sup&gt; isolement des cellules t et<em&gt; in vitro</em&gt; différenciation en sous-ensembles de cellules t

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigène Les lymphocytes T CD4+ inexpérimentés (naïfs) subissent une expansion et une différenciation en sous-ensembles effecteurs au moment de la reconnaissance par le récepteur des lymphocytes T (TCR) de l’antigène apparenté présenté sur le CMH de classe II. Les signaux cytokiniques présents dans l’environnement au moment de l’activation du TCR sont un facteur majeur dans la détermination du devenir effecteur d’un lymphocyte T CD4+ naïf. Bien que l’environnement des cytokines lors de l’activation des lymphocytes T naïfs puisse être complexe et impliquer à la fois des signaux redondants et opposés in vivo, l’ajout de diverses combinaisons de cytokines lors de l’activation des lymphocytes T CD4+ naïfs in vitro peut facilement favoriser l’établissement de lignées T auxiliaires effectrices avec l’expression caractéristique des cytokines et des facteurs de transcription. De telles expériences de différenciation sont couramment utilisées comme première étape pour l’évaluation de cibles censées favoriser ou inhiber le développement de certains sous-ensembles auxiliaires de CD4+ T. L’ajout de médiateurs, tels que des agonistes de signalisation, des antagonistes ou d’autres cytokines, au cours du processus de différenciation peut également être utilisé pour étudier l’influence d’une cible particulière sur la différenciation des lymphocytes T. Ici, nous décrivons un protocole de base pour l’isolement des lymphocytes T naïfs de souris et les étapes ultérieures nécessaires pour polariser les cellules naïves à diverses lignées effectrices T auxiliaires in vitro.

Le point de temps pour l&#39;analyse de la différenciation peut varier en fonction de l&#39;état en cours de test Th, ainsi que la force de l&#39;activation du récepteur de cellule T. Après 2-3 jours de différenciation, les cellules peuvent être visualisées par microscopie optique afin de déterminer l&#39;étendue de la prolifération des lymphocytes T. Wells présentant vaste prolifération et l&#39;agglutination des cellules sera probablement prêt pour l&#39;analyse au jour 4. conditions de différenciation reposant sur l&...

Les lymphocytes T CD4+ naïfs se polarisent en divers sous-ensembles en fonction de l’environnement au moment de l’activation. La différenciation des lymphocytes T CD4+ naïfs en divers sous-ensembles effecteurs peut être réalisée in vitro par l’ajout de stimuli des récepteurs des lymphocytes T et de signaux spécifiques de cytokines.

Souris Naïf CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolement des cellules T et<em&gt; In vitro</em&gt; Différenciation en sous-ensembles de cellules T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

L'objectif général de la procédure suivante est de polariser des lymphocytes T CD4 positifs naïfs isolés à partir de ganglions lymphatiques et de rates de souris, en sous-ensembles distincts de lymphocytes T helper. In vitro, cela est réalisé en premier lieu par le traitement des rates et des ganglions lymphatiques prélevés sur des souris adultes de type sauvage. Dans une deuxième étape, la population de cellules CD4 positives est enrichie par séparation magnétique à l'aide de billes, puis triée plus précisément selon l'expression de marqueurs de lymphocytes T naïfs.Dans la dernière étape, les cellules sont traitées avec des facteurs d'activation des récepteurs des lymphocytes T et des cytokines polarisantes afin d'induire leur différenciation en diverses lignées de lymphocytes T helper. Enfin, la cytométrie en flux, le test ELISA et la PCR en temps réel sont utilisés pour évaluer l'efficacité de la différenciation des lymphocytes T helper.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules T auxiliaires, telles que la manière dont l'expression de molécules spécifiques ou le traitement par des médicaments précis influence la nature de la réponse d'une cellule T. Commencez par fixer les membres d'une souris C57BL/6 âgée de cinq à dix semaines sur la planche de dissection, puis incisez la peau longitudinalement de l'anus jusqu'au menton, en prenant soin de ne pas percer le tissu péritonéal sous-jacent. Ensuite, écartez la peau en l'épinglant et utilisez une première paire de forceps pour saisir le ganglion lymphatique et une seconde paire pour disséquer le tissu provenant de chacun des emplacements indiqués sur l'image.À mesure que chaque ganglion lymphatique est prélevé, placez-le dans une boîte de collecte contenant du PBS supplémenté avec 1 % de FBS ou du PBS plus, puis ouvrez soigneusement le péritoine et retirez la rate. Placez également la rate dans la boîte de collecte, puis transférez la boîte dans un seau à glace afin d'enrichir en cellules CD quatre positives. Répartissez les ganglions lymphatiques et la rate dans deux boîtes distinctes de 60 millimètres contenant chacune trois millilitres de PBS plus, à l’aide de pinces stériles.Placez ensuite un carré de maille en nylon stérile sur les spléens et utilisez la face du pouce du piston d'une seringue pour écraser doucement les tissus contre la maille jusqu'à ce que presque tout le tissu passe en suspension. Passez la suspension plusieurs fois de haut en bas à l’aide d’une pipette afin de dissocier les derniers agrégats solubles, puis placez un nouveau morceau de maille en nylon sur l’ouverture d’un tube conique de 15 millilitres. Filtrez la suspension dans le tube pour éliminer tous les débris résiduels.À présent, répétez la dissociation mécanique pour les ganglions lymphatiques et remplissez les deux tubes de cellules filtrées avec du PBS plus. Retournez ensuite les tubes plusieurs fois et centrifugez les cellules. Remettez en suspension le culot de ganglions lymphatiques dans deux millilitres de PBS.Ajouter un millilitre de solution CK glacée par souris au culot de cellules spléniques. Après une minute, arrêter la lyse des globules rouges avec 10 millilitres de PBS plus. Retourner le tube et centrifuger à nouveau les cellules.Ensuite, resuspendre le culot de rate dans 10 millilitres supplémentaires de PBS plus, ajouter les cellules des ganglions lymphatiques et centrifuger la suspension cellulaire combinée. Cette fois, resuspendre le culot dans 15 microlitres de billes magnétiques CD4 diluées dans 85 microlitres de PBS plus par souris, pendant 15 à 30 minutes à quatre degrés Celsius. Puis diluer les cellules dans 10 millilitres de PBS plus.Filtrer la suspension à l’aide d’un tamis en nylon dans un nouveau tube de 15 millilitres et centrifuger les cellules. Ensuite, re-centrifuger le culot dans 100 microlitres de PBS plus par souris et sélectionner positivement les cellules CD4 positives par sélection magnétique à billes, selon les instructions du fabricant. Après avoir obtenu la fraction cellulaire CD4 positive, laver les cellules dans 10 millilitres de PBS plus afin d’isoler la fraction de lymphocytes T CD4 positifs.Ensuite, étiquetez les cellules avec les anticorps fluorescents appropriés pendant 15 à 30 minutes à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière, après lavage. Filtrez les cellules marquées pour éliminer tous les débris et transférez-les dans un tube FACS sur de la glace, en protégeant du jour, afin de trier la population CD4 positive, CD25 négative, CD62L positive, CD44 négative dans un milieu RPMI complet. Une fois que toutes les cellules ont été récupérées.Lavez les lymphocytes T naïfs dans un milieu complet frais. Ensuite, resuspendez le culot, comptez les lymphocytes T naïfs dans du RPMI complet et ajustez la concentration à un fois dix puissance six cellules par millilitre afin d'induire la différenciation in vitro des sous-populations de lymphocytes T helper. Puis, lavez chaque puits des plaques de culture cellulaire préalablement revêtues d'anticorps anti-CD3 et anti-CD28 avec un millilitre de PBS stérile sans FBS, puis semez les cellules.Les cellules complètent finalement le milieu de culture avec les cytokines appropriées et des anticorps bloquants, comme indiqué dans le tableau, puis incubent les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre à cinq jours supplémentaires après quatre à cinq jours de culture. Une coloration intracellulaire des cytokines des lymphocytes T CD4 positifs issus des cultures in vitro de TH1, TH2, de treg induits et de TH17 peut alors être réalisée afin de confirmer que chaque sous-ensemble de lymphocytes T présente le profil de cytokines attendu.En effet, après une re-stimulation de 24 heures avec des EIS anti-CD3, A montre que les sous-populations présentent également la production extracellulaire des protéines de cytokines exprimées intracellulairement. La PCR en temps réel des facteurs de transcription spécifiques aux lignées confirme davantage les profils adéquats de facteurs de transcription des sous-populations de lymphocytes T CD4 positifs différenciés in vitro. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler et de traiter les cellules des ganglions lymphatiques miroirs et de la rate afin d'obtenir des cellules T auxiliaires naïves CD4 positives.En outre, vous serez en mesure de différencier ces lymphocytes T en TH1, TH2, TH17 ou cellules Treg.

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