Souris Naïf CD4 ⁺ Isolement des cellules T et In vitro Différenciation en sous-ensembles de cellules T

L’objectif global de la procédure suivante est de polariser quatre lymphocytes T positifs naïfs isolés des ganglions lymphatiques et des rates de souris en sous-ensembles T auxiliaires distincts. Pour ce faire, on traite d’abord la rate et les ganglions lymphatiques prélevés sur des souris adultes de type sauvage. Dans un deuxième temps, la population de cellules positives pour la CD est enrichie par séparation par billes magnétiques, puis triée en fonction de l’expression de leur marqueur naïf de cellules T.

Dans la dernière étape, les cellules sont traitées avec des facteurs d’activation des récepteurs des lymphocytes T et des cytokines polarisantes pour induire leur différenciation en diverses lignées T auxiliaires. En fin de compte, la cytométrie en flux. Elis A et la PCR en temps réel sont utilisés pour évaluer l’efficacité de la différenciation des lymphocytes T auxiliaires.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des lymphocytes T auxiliaires, telles que comment l’expression de molécules spécifiques ou le traitement avec des médicaments spécifiques influencent-ils la nature de la réponse des lymphocytes T. Commencez par épingler les membres d’une souris C 57 black six âgée de cinq à 10 semaines sur la planche de dissection, puis coupez la peau longitudinalement de l’anus au menton, en prenant soin de ne pas percer le tissu péritonéal sous-jacent. Ensuite, ouvrez la peau et utilisez une paire de pinces pour saisir le ganglion lymphatique et une autre pour séparer le tissu de chacun des endroits indiqués sur l’image.

Au fur et à mesure que chaque ganglion lymphatique est prélevé, placez-le dans une boîte de collecte contenant du PBS complété par 1 % FBS ou PBS plus, puis ouvrez soigneusement le péritoine et retirez la rate. Placez également la rate dans le plat de collecte et transférez le plat dans un seau à glace pour enrichir le CD de quatre cellules positives. Divisez les ganglions lymphatiques de la rate en deux boîtes distinctes de 60 millimètres contenant trois millilitres de PBS plus chacune à l’aide d’une pince stérile.

Ensuite, placez un carré de maille de nylon stérile sur la rate et utilisez le côté pouce d’un piston de seringue pour les écraser doucement contre la maille jusqu’à ce que presque tout le tissu passe en suspension. Pipez la suspension de haut en bas plusieurs fois pour briser les amas solubles restants, puis placez un nouveau morceau de maille de nylon sur l’ouverture d’un tube conique de 15 millilitres. Filtrez la suspension dans le tube pour éliminer tous les débris restants.

Répétez maintenant la dissociation mécanique pour les ganglions lymphatiques et remplissez les deux tubes de cellules filtrées avec PBS plus. Ensuite, retournez les tubes plusieurs fois et faites tourner les cellules. Suspendez à nouveau la pastille ganglionnaire dans deux millilitres de PBS.

Ajoutez un millilitre de glace froide, une solution de CK par souris à la pastille de cellules de rate. Après une minute, arrêtez la lyse des globules rouges avec 10 millilitres de PBS plus. Retournez le tube et faites tourner à nouveau les cellules.

Ensuite, remettez en suspension la pastille de rate dans 10 millilitres supplémentaires de PBS plus, ajoutez les cellules des ganglions lymphatiques et faites tourner la suspension cellulaire mélangée. Cette fois, mettez la pastille en suspension dans 15 microlitres de CD, quatre billes magnétiques diluées dans 85 microlitres de PBS, plus par souris pendant 15 à 30 minutes à quatre degrés Celsius. Diluez ensuite les cellules dans 10 millilitres de PBS plus.

Filtrez la suspension à travers une crépine en nylon dans un nouveau tube de 15 millilitres et faites tourner les cellules. Encore une fois, faites tourner la pastille dans 100 microlitres de PBS plus par souris et sélectionnez positivement pour le CD quatre cellules positives par sélection de billes magnétiques selon les instructions du fabricant. Après avoir obtenu la fraction cellulaire positive pour CD, lavez les cellules dans 10 millilitres de PBS plus pour trier la fraction positive des lymphocytes T CD.

Ensuite, étiquetez les cellules avec les anticorps fluorescents appropriés pendant 15 à 30 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité après le lavage. Filtrez les cellules étiquetées pour enlever tous les débris et transférez-les dans un tube de télécopie sur de la glace et protégez-le de la lumière, triez le CD quatre positifs, le CD 25 négatif, le CD 62 L, le positif CD 44 négatifs dans un support RPMI complet. Lorsque toutes les cellules ont été collectées.

Lavez les lymphocytes T naïfs dans un milieu frais et complet. Ensuite, remettez le granulé en suspension et comptez les lymphocytes T naïfs et ajustez la concentration à un fois 10 à six cellules par millilitre pour induire in vitro la différenciation du sous-ensemble T auxiliaire. Ensuite, lavez chaque puits de plaques de culture cellulaire préalablement enduites d’anti CD trois et d’anti CD 28 dans un millilitre de PBS stérile sans FBS et une plaque.

Enfin, les cellules complètent le milieu de culture avec les cytokines et les anticorps bloquants appropriés, comme indiqué dans le tableau, et incuberont les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre à cinq jours après quatre à cinq jours de culture. Il est possible d’effectuer une coloration intracellulaire par cytokines des cellules T CDquatre positives à partir des cultures différenciées in vitro TH un, TH deux treg inductibles et TH 17. Confirmer que chaque sous-ensemble de lymphocytes T présente le profil de cytokines attendu.

En effet, après une restimulation de 24 heures avec l’anti-CD trois EIS, A montre que les sous-ensembles présentent également la production extracellulaire correspondante des protéines cytokines exprimées intracellulairement. La PCR en temps réel pour les facteurs de transcription spécifiques à la lignée permet de vérifier en outre les profils de facteurs de transcription appropriés des sous-ensembles de cellules T différenciées in vitro de la MC à quatre positifs. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de traiter les cellules des ganglions lymphatiques et de la rate pour obtenir des cellules T auxiliaires NAÏVES CD 4 positives.

De plus, vous serez en mesure de différencier ces lymphocytes T en cellules TH un, TH deux TH 17 ou ireg.