Name: Étiquetage et à médiation virale transplantation de Medial ganglionnaire Eminence (MGE) Cellules pour In Vivo Études (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Apprenez à transduire viralement des cellules de l'éminence ganglionnaire médiane (MGE) avant transplantation dans le cortex hôte. Cette méthode permet d'étudier les interneurones GABAergiques modifiés génétiquement dans un environnement physiologique naturel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été financé par des subventions à JLRR de: Autism Speaks, Nina Irlande, Weston Havens Fondation, NIMH R01 MH081880 et NIMH R37 MH049428. PRW a été soutenue par une bourse de la National Science Council de Taiwan. SFS a été soutenu par F32 (MH103003).

<ol><li>Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+GABA+innervation+in+the+cerebral+and+cerebellar+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).</li>
<li>Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+of+autism%3A+increased+ratio+of+excitation%2Finhibition+in+key+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+brain%2C+and+behavior%22%5BJournal%5D)">Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems.</a> Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).</li>
<li>Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+migration+from+basal+forebrain+to+neocortex%3A+dependence+on+Dlx+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes.</a> Science. 278 (5337), 474-476 (1997).</li>
<li>Wonders, C. P., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+specification+of+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The origin and specification of cortical interneurons.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).</li>
<li>Gelman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Wide+Diversity+of+Cortical+GABAergic+Interneurons+Derives+from+the+Embryonic+Preoptic+Area%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area.</a> J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).</li>
<li>Miyoshi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate+mapping+reveals+that+the+caudal+ganglionic+eminence+produces+a+large+and+diverse+population+of+superficial+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons.</a> J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).</li>
<li>Batista-Brito, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+integration+of+cortical+interneurons+into+a+functional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">The developmental integration of cortical interneurons into a functional network.</a> Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).</li>
<li>Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Bias+in+the+Mitotic+Origins+of+Somatostatin%5BTitle%5D)+AND+%22and+Parvalbumin-Expressing+Interneuron+Subgroups+and+the+Chandelier+Subtype+in+the+Medial+Ganglionic%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin.</a> and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Resource+of+Cre+Driver+Lines+for+Genetic+Targeting+of+GABAergic+Neurons+in+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Bio%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Bio. 3 (5), e159(2005).</li>
<li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> Science. 344 (6180), 1240622(2014).</li>
<li>Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+progenitors+grafted+into+the+adult+epileptic+brain+control+seizures+and+abnormal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal.</a> Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).</li>
<li>Braz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+GABAergic+Neuron+Precursors+Integrate+into+Adult+Spinal+Cord+and+Reduce+Injury-Induced+Neuropathic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain.</a> Neuron. 74, 663-675 (2012).</li>
<li>Vogt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lhx6+Directly+Regulates+Arx+and+CXCR7+to+Determine+Cortical+Interneuron+Fate+and+Laminar+Position%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position.</a> Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).</li>
<li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).</li>
<li>Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKX2.1+specifies+cortical+interneuron+fate+by+activating+Lhx6%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6.</a> Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).</li>
<li>Arguello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dapper+Antagonist+of+Catenin-1+Cooperates+with+Dishevelled-1+during+Postsynaptic+Development+in+Mouse+Forebrain+GABAergic+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67679(2013).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+in+prefrontal+cortex+receive+subtype-specific+forms+of+excitation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition.</a> Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).</li>
<li>Chen, Y. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+%E2%80%9CMGE+Enhancers%E2%80%9D+for+Labeling+and+Selection+of+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Medial+Ganglionic+Eminence+%28MGE%29+Progenitors+and+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons.</a> PLoS ONE. 8 (5), e61956(2013).</li>
<li>Pattabiraman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+enhancers+active+in+protodomains+of+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

L&#39;utilisation de précurseurs des interneurones GABAergiques corticale des éminences ganglionnaires embryonnaires (GES) pour les thérapies à base de cellules est prometteuse pour de nombreuses affections 12 -1 4. Techniques moléculaires précises sont nécessaires pour suivre et exprimer des gènes d&#39;intérêt dans les sous-groupes des interneurones spécifiques. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour le marquage des cellules embryonnaires MGE avec lentivirus avant la transplantation et montrons co...

GABAergiques interneurones corticaux comprennent ~ 20-30% de neurones dans le néocortex des mammifères, tandis que le reste correspond aux neurones excitateurs principaux glutamatergiques. Interneurones sont très diverses dans les propriétés électrophysiologiques, axone et la morphologie des dendrites et synaptique ciblage 1, et les déséquilibres dans le ton excitateur / inhibitrice sont émis l&#39;hypothèse à la base des phénotypes de troubles neuropsychiatriques / neurologiques, y compris l&#39;autisme, la schizophrénie et l&#39;épilepsie 2. L&#39;objectif global du protocole décrit ici est de fournir un moyen de modifier efficacement génétiquement GABAergiques progéniteurs des interneurones corticaux avant la transplantation in vivo analyses. Interneurones corticaux GABAergiques sont nés dans les éminences ganglionnaires médial et caudal (MGE et CGE, respectivement) 3,4 ainsi que l&#39;aire préoptique 5. Progéniteurs des interneurones corticaux subissent longue distance la migration tangentielle suiviepar la migration radiale pour atteindre leurs objectifs finaux. À l&#39;arrivée à leur destination, ces interneurones corticaux doivent intégrer correctement dans le réseau neuronal existant, et chaque sous-groupe de interneurone uniques contribueront à circuit cortical de manière spécifique. Quatre sous-groupes principaux peuvent être distingués par marqueurs moléculaires: la somatostatine MGE dérivés (SST) + et parvalbumine (PV) + sous-groupes, et le peptide dérivé CGE-intestinal vasoactif (VIP) + et + Reelin; SST - 6 sous-groupes. Différents sous-groupes des interneurones corticaux sont nés au cours des moments différents au cours du développement embryonnaire dans la CGE et MGE 7, 8. Ceux-ci et d&#39;autres marqueurs corticales d&#39;interneurones GABAergiques ont été utilisées pour générer des lignées Cre-pilote spécifique pour bon nombre de ces sous-groupes 9-11. La transplantation de progéniteurs de MGE a émergé comme une thérapie à base de cellules potentiel pour traiter les troubles qui peuvent être causés par des déséquilibresdans l&#39;excitation / inhibition 12-24. Ces avantages thérapeutiques peuvent être dues en partie à la capacité unique de progéniteurs de MGE (pour disperser, de se différencier et de se intégrer dans un cerveau de l&#39;hôte), ou potentiellement parce que beaucoup de péri-somatiques PV inhibitrice + cellules sont dérivées de la MGE. MGE cellules peuvent également être rapidement et efficacement transduction avec lentivirus avant la transplantation 15, permettant aux cellules qui sont génétiquement modifiées in vitro pour être étudiées in vivo. La justification de l&#39;élaboration de cette approche était de surmonter les obstacles à l&#39;étude GABAergique développement des interneurones corticaux et la maturation. En particulier, MGE transplantation a permis aux chercheurs d&#39;étudier le développement de cellules mutantes in vivo, lorsque la souris mutante aurait autrement mort à un point de contrôle d&#39;avance. En outre, par l&#39;introduction de gènes d&#39;intérêt avant la transplantation, les effets de gènes spécifiques d&#39;un phénotype mutant ont pu être évalués dans un effmanière isant. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la transduction de cellules MGE avec lentivirus avant la transplantation. En outre, nous montrons comment cette technique peut être adaptée pour exprimer un gène d&#39;intérêt dans les sous-groupes des interneurones spécifiques dans un groupe hétérogène de précurseurs des interneurones corticaux, en utilisant une combinaison de lentivirus d&#39;expression Cre-dépendantes et des lignées de souris Cre-pilote disponibles. En outre, ce protocole introduit des techniques et une plateforme pour les chercheurs à modifier génétiquement des interneurones GABAergiques précurseurs corticale pour les études in vivo d&#39;une manière unique. Un avantage de cette technique par rapport à d&#39;autres approches actuelles est que les cellules transplantées MGE se disperser à distance du site d&#39;injection. Aussi, contrairement à injections virales focaux, après que les cellules de MGE dispersent leur morphologie est plus facile à évaluer. Cette approche peut être utilisée pour étudier l&#39;effet de l&#39;introduction de gènes d&#39;intérêt dans le type sauvage ou cellules mutantes, l&#39;introduction d&#39;un type de cellule spécifiquereporter pour évaluer la morphologie, ou potentiellement pour étudier l&#39;effet d&#39;allèles pathologiques in vivo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Réactifs et matériel pour la transplantation de cellules MGE</td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml</td><td>REF 309602</td><td>BD, Becton Dickinson et compagnie</td><td></td></tr><tr><td>30 1/2 G</td><td>aiguille 305106</td><td>BD, Becton Dickinson et compagnie</td><td></td></tr><tr><td>Alésage de précision pour livrer 5 &micro ; l (livré avec piston)</td><td>5-000-1005</td><td>Drummond scientific company</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PM-999</td><td>Polysciences, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope avec perche **</td><td>MZ6</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Digital juste pour souris instrument stéréotaxique **</td><td>51725D</td><td>Stoelting company</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur fin hydraulique à huile mono-axe **</td><td>MO-10</td><td>Narishige</td><td></td></tr><tr><td>Biseauteur</td><td></td> rotatif diamanté <td>fabriqué en interne</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de pipette à aiguille</td><td>730</td><td>Kopf instruments</td><td></td></tr><tr><td>Huile</td><td></td> minérale <td>Toute droguerie ou pharmacie</td><td></td></tr><tr><td>Toute pipette et embouts pouvant être fiables mesure 1 & micro ; l de volume</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">** Ce sont les modèles particuliers que nous utilisons, mais de nombreuses autres configurations devraient fonctionner</td></tr><tr><td colspan="4">Réactifs optionnels (pour la fabrication de lentivirus)</td></tr><tr><td>25 mm, 0.45 &micro ; Filtre m</td><td>09-719B</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger ultra-clairs (25 x 89 mm)</td><td>344058</td><td>Beckman Coulter&reg ;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 (format 1,5 ml)</td><td>11668019</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Autres fournitures disponibles dans le commerce</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE plasmide codant pour gag/pol</td><td>12251</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev codant pour le plasmide Rev</td><td>12253</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G plasmide codant pour VSVG</td><td>12259</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-Flex-GFP</td><td>28304</td><td>Addgene</td><td></td></tr></tbody></table>

Étiquetage et à médiation virale transplantation de medial ganglionnaire eminence (mge) cellules pour<em&gt; in vivo</em&gt; Études

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

GABAergiques interneurones corticaux, provenant de la médiane embryonnaire et éminences ganglionnaires caudale (MGE et CGE), sont fonctionnellement et morphologiquement diversifié. Incursions ont été réalisés dans la compréhension des rôles des différents sous-groupes de interneurones corticaux, cependant, il ya encore de nombreux mécanismes pour être élaborés qui peuvent contribuer au développement et à la maturation des différents types de cellules GABAergiques. De plus, la signalisation GABAergique modifié peut contribuer à des phénotypes de l&#39;autisme, la schizophrénie et l&#39;épilepsie. Lignes Cre-pilote spécifique ont commencé à morceler les fonctions de sous-groupes de interneurones uniques. Malgré les progrès réalisés dans des modèles de souris, il est souvent difficile d&#39;étudier efficacement des interneurones GABAergiques progéniteurs corticale avec des approches moléculaires in vivo. Une technique importante utilisée pour étudier la programmation autonome des cellules de ces cellules est une transplantation de cellules dans le cortex MGE hôtes. Ces cellules transplantées migrent largement, différencier, une intégrer fonctionnellement. En outre, les cellules peuvent être efficacement MGE transduites avec des lentivirus immédiatement avant la transplantation, ce qui permet une multitude d&#39;approches moléculaires. Ici, nous en détail un protocole de transduire efficacement des cellules MGE avant la transplantation pour l&#39;analyse in vivo, en utilisant des lignes disponibles Cre-conducteur et des vecteurs d&#39;expression Cre-dépendantes. Cette approche est avantageuse car elle combine la manipulation génétique précise de la capacité de ces cellules à se disperser après la transplantation, ce qui permet une plus grande résolution spécifique de type cellulaire in vivo.

Comme les cellules de MGE ont la capacité unique de migrer et intégrer lorsqu&#39;elles sont transplantées dans un néocortex hôte 16, ils fournissent un excellent système modèle pour la manipulation génétique avant que des études in vivo. Ici, nous montrons comment on peut isoler les tissus MGE partir d&#39;embryons de E13.5 (figures 1 et 2), qui peut ensuite être transduites avec lentivirus in vitro ou d&#39;une manière rapide avant la transplantation pour les études in...

GABAergiques progéniteurs des interneurones corticaux dispersent, développer et synaptique intégrer dans un cortex hôte après la transplantation. Ces cellules peuvent être facilement transduites avant la transplantation pour les études in vivo de précurseurs GABAergiques génétiquement modifiés. Ici, nous montrons les techniques de marquage viraux pour cibler des sous-groupes de interneurones spécifiques utilisant des lignes existantes et les journalistes Cre Cre-dépendantes.

Étiquetage et à médiation virale transplantation de Medial ganglionnaire Eminence (MGE) Cellules pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Études

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

L'objectif général de cette procédure est de transduire rapidement de manière virale des cellules progénitrices neuronales GABAergiques issues du MGE avant leur transplantation dans un hôte pour des études in vivo. Cela est réalisé en isolant tout d'abord les cellules du MGE à partir d'un embryon donneur positif pour Cre. La deuxième étape consiste à marquer rapidement et efficacement les cellules du MGE isolées à l'aide d'un virus conçu pour une fonction spécifique, comme l'étiquetage d'un type cellulaire particulier.Ensuite, les cellules trans utilisées sont transplantées dans un hôte et laissées se développer in vivo. En fin de compte, la microscopie à odeur ou d'autres techniques peuvent être utilisées pour évaluer les cellules transduites et transplantées au moment approprié. L'un des principaux avantages de cette approche par rapport à d'autres techniques, comme l'injection directe de virus, est que les cellules MGE migrent sur de longues distances à partir du site d'injection, qui constitue un site de lésion, ce qui permet d'étudier les cellules dans un environnement plus normal.Étant donné que les cellules de l’EMG sont des progéniteurs de neurones corticaux, un type cellulaire impliqué dans des troubles neuropsychiatriques tels que l’autisme, la schizophrénie et l’épilepsie, nous pensons que les techniques décrites ici aideront effectivement à comprendre les bases biologiques de certaines de ces maladies neuropsychiatriques. De plus, cette technique permet de modifier génétiquement ces cellules rapidement pour des études in vivo. Après avoir préparé le lentivirus et disséqué l’EMG selon les instructions du protocole écrit, recueillir les deux hémisphères de l’EMG et placer le tissu dans deux tubes de collecte de 1,5 millilitre contenant chacun 500 microlitres de DMEM avec 10 % de FBS. Conserver les échantillons sur glace jusqu’à ce que tout le tissu soit récolté.Ensuite, transférez les tubes dans une hotte certifiée de niveau de sécurité biologique deux. Aspirez soigneusement le milieu sans perturber le tissu MGE qui s'est déposé au fond du tube. Ajoutez ensuite environ 500 microlitres de milieu DMEM préchauffé avec 10 % de FBS.Ajouter du poly cerveau à une concentration finale de huit microgrammes par millilitre et triturer à l’aide d’une pipette P 1000 jusqu’à obtention d’une suspension monocellulaire. Ensuite, ajouter 15 à 20 microlitres du lentivirus concentré à chaque tube. Puis fermer chaque tube hermétiquement, l’inverser pour mélanger, et placer tous les tubes dans un incubateur à 37 degrés Celsius.Incubez les cellules avec le lentivirus pendant au moins 30 minutes, mais pas plus d'une heure, car des durées plus longues ont entraîné une diminution de la viabilité cellulaire. Retournez les tubes toutes les 10 minutes après l'incubation.Retirez les tubes de l'incubateur et centrifugez à 700 fois G à quatre degrés Celsius pendant trois minutes. Pour former un culot des cellules dans la hotte BSL deux, retirez le surnageant et jetez-le dans de l'eau de javel à 10 %. Ensuite, ajoutez un millilitre de DMEM contenant 10 % de FBS et rétro.Resuspendez le culot deux à trois fois pour le laver après la centrifugation. Comme précédemment, répétez ce lavage. Effectuez cette étape deux à trois fois supplémentaires pour éliminer l'excès de virus. Après le dernier lavage, retirez autant de milieu que possible et placez chaque tube sur de la glace en raison du milieu résiduel sur les parois du tube.Environ deux à trois microlitres de milieu recouvriront le culot cellulaire au moment où la procédure de transplantation commencera. En veillant à maintenir une technique stérile tout au long de l'opération, aspirez de l'huile minérale dans une seringue d'un millilitre, puis, à l'aide d'une aiguille de calibre 30 et demi, remplissez complètement la pipette en verre avec l'huile minérale. Ensuite, fixez la pipette en verre au dispositif stéréotaxique et, à l'aide d'un assistant, chargez-la sur le piston en utilisant l'entraînement hydraulique.Déplacez le piston d'environ la moitié de la longueur dans la pipette en verre, en éliminant l'huile minérale qui déborde à l’aide d’un essuie-tout propre. Ensuite, roulez l’angle d’un essuie-tout stérile en une pointe fine et utilisez-la pour retirer délicatement l’excès de milieu situé au-dessus du culot cellulaire de mge. Cela permettra de concentrer la densité cellulaire afin de réaliser des volumes d’injection plus faibles.Ensuite, utilisez une pipette P2 pour prélever lentement le culot cellulaire et aspirez-le une à deux fois avant de le déposer sur une surface hydrophobe. Le volume doit être légèrement inférieur à un microlitre. Introduisez la pointe de l'aiguille dans la suspension cellulaire et, à l’aide de l’entraînement hydraulique, aspirez la suspension cellulaire dans la pipette.Après avoir anesthésié un spécimen par hypothermie, vérifiez l'efficacité de l'anesthésie. En pinçant la peau entre les orteils avec une pince, aucune réaction ne devrait être observée. Ensuite, placez le spécimen sur un moule situé sous le dispositif d'injection et tendez la peau en tirant doucement la peau de la tête, puis fixez-la.À l'aide d'un ruban adhésif de laboratoire standard, manipulez rapidement le bras du stéréotaxique afin de positionner la pointe de la pipette en verre perpendiculairement à la surface de la tête du petit. Lorsque la pipette entre en contact avec la tête, considérez cette position comme le zéro. Ensuite, enfoncez la pipette à travers la surface de la peau et du crâne jusqu'au cortex.Insérez ensuite la pipette et retirez-la deux fois avant d'arrêter le ciblage des cellules dans le néocortex. Les injections sont réalisées lorsque la micropipette se trouve à 0,1 millimètre. Une fois l'aiguille en position, faites tourner le dispositif hydraulique pour avancer le piston dans la pipette en verre et injectez de 50 à 70 nanolitres par site.Répétez cette procédure sur trois à six sites différents situés à divers niveaux rostro-caudaux de la moelle. Si une large distribution de cellules transformées dans tout le néocortex est nécessaire, une fois les injections terminées, retirez le petit de la platine et marquez-le conformément aux procédures approuvées. Une fois que le petit s'est remis et est capable de se déplacer seul, remettez-le avec la femelle allaitante et le reste de la portée.Vérifiez les petits après la procédure et le jour suivant afin de vous assurer qu'il n'y a aucun signe de détérioration de leur état de santé au cours de cette expérience. Des cellules de type E 13,5, positives pour la somatostatine, provenant de l’iris crew, l’AI 14 flock et du MGE, ont été greffées ou transduites avec le lentivirus CAG flex GFP avant d’être transplantées dans des néocortex de type sauvage, puis évaluées sept jours après la transplantation. Ces images d’immunofluorescence de néocortex, prises à sept ou 35 jours après la transplantation, montrent des cellules transplantées du MGE positives au tomate ; ici, des images d’immunofluorescence de cellules du MGE transfectées avec le lentivirus CAG flex GFP et évaluées à sept jours post-transplantation (DPT) sont présentées.Cet histogramme montre la quantification de la proportion de cellules positives au tomate 2D exprimant la GFP sept jours après la transplantation. Pour les images suivantes, les cellules du MGE ont été prélevées chez des souris E 13,5 positives pour la somatostatine IRIS CRE et transduites avec un lentivirus CAG flex GFP, puis transplantées dans le néocortex de lots P un de type sauvage avant évaluation. À 35 jours post-transplantation, cette image représentative provenant du néocortex d'hôtes transplantés démontre l'expression de la GFP provenant du vecteur Flex.Ici, le tissu a été marqué pour la somatostatine afin de déterminer la co-expression des neurones GABAergiques exprimant la GFP et la somatostatine, et ici, le tissu a été marqué pour l'albumine parvalbumine. Ces images fusionnées, doublement marquées avec le DAPI, démontrent le degré de colocalisation de la GFP avec la somatostatine et l'albumine parvalbumine. Enfin, cet histogramme montre la quantification de la proportion de cellules GFP qui coexpriment la somatostatine ou l'albumine parvalbumine. Suite aux méthodes décrites dans cette procédure, d'autres outils moléculaires, par exemple un virus associé au dentaire, peuvent également être utilisés pour marquer les cellules dans des études in vivo. N'oubliez pas que le travail avec des lentivirus peut présenter des dangers extrêmes ; des précautions, telles que le port d'équipements de protection individuelle (EPI) adéquats et la manipulation en laboratoire de niveau de sécurité biologique (BSL), doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

viral-mediated-labeling-transplantation-medial-ganglionic-eminence

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

Cet article décrit une séquence d'événements optimisé pour l'imagerie multimodale de greffons cellulaires dans le cerveau des rongeurs en utilisant: (i) de la bioluminescence in vivo et l'imagerie par résonance magnétique, et (ii) post mortem analyse histologique. La combinaison de ces modalités d'imagerie sur un seul animal permet cellulaire d'évaluation du greffon avec une résolution, la sensibilité et une spécificité élevées.

Imagerie multimodale d&#39;implantation de cellules souches dans le système nerveux central de souris

Ici, nous développons les outils nécessaires...

Ex vivo d&#39;imagerie en temps réel de simples divisions cellulaires dans neuroépithélium de souris

Cette vidéo démontre le marquage viral et la transplantation de cellules d’éminence ganglionnaire médiale (MGE) pour des études in vivo. Il décrit les étapes impliquées dans la transduction des cellules MGE avec un rapporteur viral, la transplantation de ces cellules transduites dans le cortex d’un bébé souris et la possibilité de l’expression du rapporteur dans des sous-types spécifiques d’interneurones.

Marquage et transplantation à médiation virale de cellules d’éminence ganglionnaire médiale pour des études in vivo

Source : Pereira, M. et. al., In vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo démontre l’injection stéréotaxique d’un virus adéno-associé dans le cortex cérébral d’une souris transgénique pour délivrer des gènes de reprogrammation neuronale et de rapporteur fluorescent dépendants de Cre dans les cellules gliales.

Injection stéréotaxique de vecteurs viraux pour la reprogrammation des cellules gliales dans un modèle murin

Source : Denaxa, M., el al., Transplantation de progéniteurs d’interneurones corticaux modifiés par chimiogénétique dans des cerveaux de souris postnatals précoces. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre la procédure d’injection d’un vecteur plasmidique porteur du gène d’intérêt dans les progéniteurs interneurones d’une tranche de cerveau embryonnaire, suivie d’une électroporation pour l’entrée du plasmide et l’expression génique. Ces progéniteurs modifiés peuvent ensuite être utilisés pour...

TRANSFERT DE GÈNES ASSISTÉ PAR ÉLECTROPORATION INCORPORÉ DANS L’AGAROSE DANS DES PROGÉNITEURS D’INTERNEURONES CORTICAUX DE SOURIS

Nous décrivons ici une procédure basée sur l’utilisation de particules lentivirales pour la modification génétique à long terme des cellules souches neurales et/ou de leurs cellules épendymaires adjacentes dans la niche neurogène ventriculaire-sous-ventriculaire adulte qui permet l’analyse séparée des effets autonomes et non autonomes des cellules dépendantes de la niche sur les cellules souches neurales.

Stable et efficace modification génétique de cellules dans le Adulte souris V-SVZ pour l&#39;analyse des cellules souches neurales autonome et effets non autonomes

Ici, nous fournissons une méthode fiable et peu coûteuse pour générer organotypiques électroporation cerveau d’embryons de souris appropriés pour la microscopie confocale et techniques d’imagerie en direct.

Ex Utero Électroporation et culture organotypique tranche de cerveaux de souris embryonnaires pour vivre-imagerie de la migration des interneurones GABAergiques

Ce protocole vise à générer des interneurones directement reprogrammés in vivo, à l'aide d'un système viral à base d'AAV dans le cerveau et d'un journaliste GFP piloté par la synapsine FLEX, qui permet l'identification cellulaire et une analyse plus approfondie in vivo.

In Vivo Reprogrammation directe des cellules gliales résidentes en interneurones par injection intracérébrale de vecteurs viraux

La microdissection laser (LMD) est une technique sensible et hautement reproductible qui peut être utilisée pour découvrir des voies qui médité glioma hétérogénéité et invasion. Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour isoler les zones discrètes du tissu de gliome utilisant le LMD laser suivi de l’analyse transcriptomique.

Microdissection laser de sous-régions de Glioma pour la caractérisation spatiale et moléculaire de l’hétérogénéité intratumorale, des oncostreams et de l’invasion

Nous présentons des protocoles améliorés pour la transduction rétrovirale des récepteurs de trafic et le guidage compétitif afin d’étudier le positionnement des lymphocytes spécifiques aux organes et au microenvironnement médiés par les récepteurs. Cette méthode offre des informations précieuses sur les mécanismes de trafic des cellules immunitaires et a des applications potentielles dans la recherche fondamentale et thérapeutique future.

Transduction rétrovirale efficace et guidage compétitif pour l’étude de la localisation des lymphocytes T médiée par les RCPG dans divers microenvironnements tissulaires

Apprenez à transduire viralement des cellules de l'éminence ganglionnaire médiane (MGE) avant transplantation dans le cortex hôte. Cette méthode permet d'étudier les interneurones GABAergiques modifiés génétiquement dans un environnement physiologique naturel.

Étiquetage et à médiation virale transplantation de Medial ganglionnaire Eminence (MGE) Cellules pour

Explorer plus de vidéos