Name: Microchambres agarose à long terme de limagerie calcique Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Découvrez l'imagerie calcique à long terme de Caenorhabditis elegans dans des microchambres agarose. Cette méthode permet de suivre l'activité neuronale et le comportement sur plusieurs stades de développement.

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La Société Max Planck et une allocation Junior Groupe Göttingen Graduate School à HB a financé ce travail.

1. Instruments, Culture Media, et Plats <ol><li> Utilisation d&#39;un microscope qui est capable de maintenir l&#39;échantillon au point et qui est équipé d&#39;une étape automatique. Construire un couvercle chauffe-mesure ou acheter une solution commerciale. Mettre en place un EMCCD LED-système de caméra dans lequel l&#39;exposition de la caméra déclenche l&#39;éclairage LED à travers un signal TTL en utilisant les instructions du fabricant. Remarque: Voir la discussion pour plus de détails. </li><li> Polydimethylsiloxane (PDMS) timbres: <ol><li> Fabriquer PDMS timbres dans un centre de la microfluidique ou PDMS ont les timbres produits par une fonderie commerciale. Pour utiliser une fonderie commerciale, envoyer un fichier autocad à la société et spécifier la profondeur (15 um, par exemple) de l&#39;appareil. Après la livraison de la fonderie, couper la puce PDMS dans ses 16 timbres au moyen d&#39;un scalpel. </li><li> Lier chaque timbre individu à une lame de verre en utilisant du plasma de l&#39;air. Pour le collage, exposer à la fois le timbre de PDMS et la lame de verre à plasma d&#39;air pour uncombat 1 min (en utilisant les paramètres les plus élevés de plasma à 0,5 mbar). Veiller à ce que les surfaces de collage sont confrontés à la hausse au cours du traitement par plasma. Ensuite, placez le timbre PDMS sur la lame de verre. </li></ol></li><li> Prenez un plat en bas de 3,5 cm et découpez un carré de 18 x 18 mm à partir du centre du fond du plat à l&#39;aide d&#39;une fraiseuse verticale et couteaux rotatifs tranchants. Utiliser une faible vitesse de rotation du dispositif de coupe et d&#39;alimentation lente pour empêcher la matière plastique de la fonte en raison de la chaleur produite par le frottement. Préparer plusieurs plats à la fois. Remarque: Le fond plat peut être réutilisé plusieurs fois après l&#39;expérience si elle est nettoyée après trempage dans de l&#39;éthanol pur O / N. </li><li> Agarose: <ol><li> Dissoudre 3 g de point de fusion élevé agarose dans 100 ml S-basale (5,85 g NaCl, 1 g de K 2 HPO 4, 6 g de KH 2 PO 4, 1 ml cholestérol (5 mg / ml dans de l&#39;éthanol), H 2 O à 1 L, stériliser à l&#39;autoclave) par ébullition. Assurez aliquotes du agarose dissout dans 2 ml tubes Eppendorf et store. En outre, de préparer un lot de bas point de fusion agarose exactement de la même manière que le point de fusion élevé agarose. </li><li> Avant utilisation, placer 3 aliquotes de point de fusion élevé agarose sur un bloc de chauffage à 95-98 ° C. Avant utilisation, placer une aliquote de bas point de fusion agarose sur un bloc de chauffage à 95-98 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit fondu, puis sur un bloc de chauffage à 30 - 35 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Sélection des animaux <ol><li> Cultivez les vers à une faible densité sur des plaques NGM ensemencées pour obtenir des animaux propres. Assurez-vous que il ya beaucoup de nourriture et seuls quelques animaux sur la plaque. </li><li> Pour l&#39;imagerie larves L1, transférer environ 30 oeufs contenant des embryons au stade de bretzel sur une nouvelle plaque ensemencée NGM. Pour transférer les stades larvaires plus tard ou adultes C. elegans, transférer environ 30 vers sur une nouvelle plaque ensemencée NGM. </li></ol> 3. Préparation de Agarose microchambres <ol><li> Préparation du plat: <ol><li>Prenez un plat en plastique avec une ouverture carrée de 18 x 18 mm à la base et placez-le à l&#39;envers avec l&#39;ouverture vers le haut. Fermez l&#39;ouverture en plaçant un morceau de ruban adhésif double-face collante de 20 x 20 mm sur l&#39;ouverture. Mettez le plat autour de sorte que le ruban adhésif est sur le fond et placer le plat sur une surface dure. Couper l&#39;ouverture libre à l&#39;aide d&#39;un scalpel. </li><li> Avec une pipette P1000, remplissez 2 ml de 3% point de fusion élevé agarose dans S-Basal dans le plat. Placez le agarose sur la zone qui entoure l&#39;ouverture et laisser solidifier. Attendez jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose est solide. </li><li> Tourner autour du plat et de décoller le film de protection qui recouvre l&#39;adhésif double-face collante de sorte que le côté collant restera sur le plat et sera exposée. Remarque: Par conséquent, un anneau amende de ruban adhésif va entourer l&#39;extérieur de l&#39;ouverture. L&#39;agarose sert de réservoir d&#39;humidité qui seront ensuite entourer l&#39;échantillon. </li></ol></li><li> Fonderie de microchambres: <ol><li> Exposer ee surface de PDMS pour le moulage avec un plasma d&#39;air pour 20 à 60 sec. Remarque: Ce traitement par plasma rend les PDMS surface hydrophile, ce qui empêche le piégeage de bulles d&#39;air et produit des impressions nettes. </li><li> Construire deux entretoises de hauteur égale par l&#39;empilement de 5-9 des lames de verre. Place, en parallèle à leurs côtés longs, la première entretoise pile, puis une lame de verre unique, puis de nouveau une entretoise pile. Passer la lame de verre qui contient le tampon PDMS orthogonalement à travers les pièces d&#39;écartement. Ajuster la hauteur des entretoises de sorte qu&#39;il existe un espace d&#39;environ 1,5 mm entre la surface de moulage du poinçon PDMS et la lame de verre unique. </li><li> Déposer une goutte de liquide chaud-point de fusion élevé agarose sur la lame de verre unique près du timbre en PDMS et rapidement glisser les PDMS timbre verticalement dans l&#39;agarose liquide. Laissez le agarose solidifier. Vérifiez que cela devient un aspect opaque, qui prend habituellement environ 2 min. Retirez le timbre verticalement avec un mouvement. Remarque: Il est commode à GLue l&#39;entretoise glisse avec du ruban double-face collante. Le mouvement vertical du tampon empêche les bulles d&#39;air de se trouver piégé dans l&#39;agarose. </li></ol></li><li> Transférer les œufs ou les vers avec des bactéries OP50 sur le agarose en utilisant une amende choix de fil de platine. Distribuez un oeuf ou un ver par chambre avec de la nourriture à l&#39;aide d&#39;un cil. Remplissez environ 30 oeufs sur un plot agarose. </li><li> Couper la dalle agarose contenant les microchambres remplis dans un carré d&#39;environ 15 x 15 mm afin qu&#39;il tienne bien dans l&#39;ouverture de la coupelle. Ramassez la dalle agarose carré avec une pince et placez-le à l&#39;envers sur une lamelle de verre de 20 x 20 mm. Une fois tombé, ne pas soulever à nouveau ou faites-le glisser autour parce que cela peut causer des bactéries et des vers de terre pour être poussés hors de leurs chambres. </li><li> Assemblée de l&#39;antenne: <ol><li> Placer la lamelle de verre sur l&#39;ouverture de la coupelle en plastique. Appuyez doucement la lamelle de verre sur la bague faite de ruban adhésif double-face collante.Prenez soin de ne pas briser le verre. </li><li> Mettez le plat à l&#39;envers et utiliser une pipette P1000 pour combler l&#39;écart entre la dalle agar contenant les microchambres et le réservoir de liquide agarose à bas point de fusion agarose refroidi à environ 30 ° C. Attendez jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose est solidifié. </li><li> Sceller le plat avec un couvercle. Pour microscopes inversés utiliser un couvercle chauffant. Pour les microscopes droits utiliser un couvercle normal et sceller le plat avec du Parafilm. </li></ol></li><li> Après avoir terminé la préparation de microchambres, vérifiez-les sous un stéréomicroscope. L&#39;exactitude de remplissage est crucial. Voir la discussion pour plus de détails. </li></ol> 4. Imagerie de calcium <ol><li> Utilisez souches transgéniques exprimant capteurs de calcium génétiquement codés tels que HBR16 (goeIs5 [rmnp-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3&#39;UTR, unc-119 (+)]) 27. </li><li> Utilisez un microscope composé équipée pour grand champ épifluorescence. Connectez la sortie TTL de la caméra EMCCD àl&#39;entrée TTL de la LED, de sorte que chaque fois que la caméra enregistre une image de l&#39;échantillon est éclairé. Utilisez un temps d&#39;exposition d&#39;environ 5 ms. Utilisez le gain EM dans la gamme de 50 - 300. </li><li> Spécifiez un film d&#39;éclatement fonctionnement pendant 24 heures à chaque ver imagé tous les 15 - 30 min abord pendant 20 secondes avec DIC, puis pendant 20 secondes avec une fluorescence de la GFP pour enregistrer GCaMP, et ensuite prendre une image finale du signal mKate2 est pris pour le contrôle des niveaux d&#39;expression. Utilisez un taux de 2 / sec de cadre lors de chaque salve. </li><li> Pour l&#39;inspection visuelle de données, utilisez une carte en fausses couleurs pour améliorer la visibilité de petites variations de l&#39;intensité de fluorescence. Terrain données fluorescentes que AF / F, avec F étant la valeur de base moyenne de fluorescence. Une description détaillée de l&#39;analyse des données de calcium peuvent être trouvées dans la littérature 20. </li></ol> 5. parallèle AMI de Worms multiples <ol><li> Placer le plat contenant les microchambres sur le microscope, se concentrer sur l&#39;échantillon et engager le autofocus. Mettre en place un protocole de logiciel de sorte que la caméra prend une rafale de 40 trames d&#39;image en 20 sec chaque demi-heure pendant 24 heures, ce qui se traduira par 1.920 images par vis sans fin, une quantité raisonnable de données. Mettre en place la numérisation de sorte qu&#39;il visite chaque ver utilisant la scène. Viser à filmer environ 30 vers en un seul passage. </li><li> Image de multiples vers de zoom arrière, soit en utilisant un faible grossissement. Utilisez un faible grossissement pour couvrir plusieurs microchambres avec la puce de la caméra et de filmer plusieurs microchambres adjacentes simultanément. Après la fin de l&#39;acquisition d&#39;image, séparer les données pour chaque chambre individuelle par découpe d&#39;une région d&#39;intérêt portant sur un animal. </li><li> Pour évaluer rapidement les données de mobilité, utiliser de soustraction 28-32. </li></ol> 6. imagerie différentes étapes de la vie de C. elegans <ol><li> Utilisez microchambres agarose pour toutes les étapes de la vie de C. elegans de L1 à l&#39;âge adulte et dont dauers. Utilisez les dimensions de la chambre appropriées pour différentes étapes de la vie qui apparaissent dans le tableau 1. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> l&#39;étape de vie </td><td> taille de la Chambre </td><td> Profondeur de champ </td><td> Durée d&#39;enregistrement typique </td><td> Grossissement </td></tr><tr><td> L1 </td><td> 190 x 190 um </td><td> 10 - 15 um </td><td> oeuf - mi L2 </td><td> 400X </td></tr><tr><td> L2 </td><td> 370 x 370 um </td><td> 15 pm </td><td> oeuf - L3 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> Dauer larve </td><td> 370 x 370 um </td><td> 25 um </td><td> 4 jours </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L3 </td><td> 700 x 700 um </td><td> 45 um </td><td> L2 - L4 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L4 </td><td> 700 x 700 um </td><td> 45 um </td><td> L4 jeune - jeune adulte </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Jeune adulte </td><td> 700 x 700 um </td><td> 45 um </td&gt; <td> 12 - 24 h </td><td> 100X </td></tr></tbody></table> Tableau 1. tailles Chambre pour les différentes étapes de la vie. Montré sont dimensions de la chambre et de grossissements qui sont utiles pour diverses étapes optimisés pour une puce de caméra 8 x 8 mm.

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<li>Schwarz, J., Lewandrowski, I., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+activity+of+a+sensory+neuron+during+a+sleep-like+state+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Reduced activity of a sensory neuron during a sleep-like state in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 21, R983-R984 (2011).</li>
<li>Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus%5BTitle%5D)+AND+%22Worm%22%5BJournal%5D)">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1, 12-14 (2012).</li>
<li>Schwarz, J., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+sleep-like+quiescence+in+both+hyperactive+and+hypoactive+mutants+of+the+Galphaq+Gene+egl-30+during+lethargus+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 8, e75853(2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Matériel L&#39;objectif d&#39;un microscope sera généralement la dérive lors de l&#39;acquisition d&#39;image à long terme. Pour microscopes composés, se concentrer maintien systèmes peuvent être achetés auprès des principaux fabricants de microscopes. Dans le cas d&#39;un microscope composé avec commande de mise au point est trop cher, une alternative simple serait d&#39;utiliser une loupe binoculaire. Microscopes composés permettent l&#39;utilisation d&#39;objectifs avec une ouverture numérique élevée (NA) et peuvent être facilement automatisés. Objectifs de pétrole 40X sont bien adaptés. lentilles d&#39;immersion de l&#39;eau ne sont pas idéal en raison de l&#39;évaporation lors de l&#39;imagerie à long terme. Contraste interférentiel différentiel (DIC) génère un joli contraste qui permet de suivre les changements morphologiques et comportementales, mais simple, l&#39;imagerie du champ lumineux peut également être utilisé. Pour DIC ou l&#39;imagerie en champ clair, utiliser la lumière rouge en plaçant un filtre de lumière rouge dans le chemin dia-éclairage du microscope. Pour la numérisation de plusieurs microchambres une étape automatisée est nécessaire. Meilleure performance est achieved quand une étape est utilisé qui a accélération et de décélération non linéaire et peut être programmé à basse vitesse de balayage pour éviter de perturber les animaux lors de la numérisation. Nous avons pas observé les réactions comportementales ou augmentation de calcium dans les neurones mécanosensibles (ALM et PLM) pendant le balayage, ce qui suggère en effet que la numérisation lente ne pas activer le système mécanosensible du ver (données non présentées). Systèmes à DEL commerciaux peuvent être utilisés. Plusieurs compagnies offrent des solutions prêtes à l&#39;emploi qui incluent les diodes à différentes longueurs d&#39;onde. La LED devrait avoir la possibilité de déclencher l&#39;extérieur de la LED avec un signal TTL. Une caméra très sensible est nécessaire pour l&#39;imagerie de calcium des animaux en mouvement. caméras EMCCD sont les caméras les plus sensibles sur le marché. La caméra doit avoir une sortie TTL lors de l&#39;exposition (aussi appelé de sortie &quot;de feu&quot;). Dispositif de chauffage du couvercle est nécessaire pour éviter la condensation sur le couvercle si l&#39;on utilise un microscope inversé. Sur un microscope droit, le plat sera placé de telle sorte que le couvercle wiserai en bas et ainsi on empêche la condensation et pas de chauffage du couvercle est nécessaire. Le couvercle doit fermer hermétiquement le plat pour éviter l&#39;évaporation de l&#39;eau lors de l&#39;imagerie à long terme. PDMS timbres La surface du tampon de PDMS contenant la structure pour le moulage de l&#39;agarose est confronté à une distance de la lame de verre, qui supporte le timbre PDMS. Une liste des entreprises qui offrent des puces microfluidiques personnalisé peut être trouvée sur Wikipedia ( <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies" target="_blank">http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies</a> ). Combler les nématodes dans leurs chambres Ceci est l&#39;étape la plus critique dans le protocole et les points suivants doivent être pris en considération: A) La moiteur de l&#39;agarose est crucial pour transférer les vers et pour l&#39;imagerie. Si l&#39;agarose est trop humide, à savoir, il est un liquide coveRing une superficie de plusieurs microchambres, il ne sera pas possible de distribuer de la nourriture et les vers bactérienne d&#39;une manière contrôlée parce que le liquide rendra les bactéries écoulent. Si l&#39;agarose est trop sec puis les bactéries et les vers ne peuvent pas descendre le pick facilement, ce qui signifie que plus de force doit être utilisée pour déposer les vers et les bactéries qui provoque facilement des dommages à l&#39;agarose. Lors du remplissage dans un grand nombre de vers l&#39;agarose peut tarir. Dans le pire des cas, l&#39;agarose sera tellement sec à la fin ce que les chambres seront effondrer. Si l&#39;agarose est trop sec, il peut être réhydraté en plaçant une petite goutte (environ 2 pi) de S-basale sur le côté de la puce où il n&#39;y a pas de vers. Puis tremper le fil de platine ramasser dans le liquide et même tirer une partie du liquide dans la zone où les chambres sont remplies avec des vers. B) La quantité de nourriture est essentiel pour le succès de l&#39;imagerie à long terme. Si il n&#39;y a pas assez de nourriture, les vers peuvent courir hors de lui. En cas de nourriture excessive de la cavité de la chambrene sera pas se comporter comme un liquide, mais plutôt comme un solide et permettra des vers d&#39;échapper à la chambre en poussant les bactéries. Viser à obtenir une suspension bactérienne qui remplit toute la chambre. Les vers sont en contact physique constant avec la surface de la gélose et le verre le long de la plupart de leur longueur pendant l&#39;expérience et le comportement ramper semble similaire au mouvement sur une plaque et différente de rosser en liquide. C) mécanique dommageable de l&#39;agarose peut ruiner l&#39;expérience. Une amende choix est essentiel. Il ne doit pas avoir des coins pointus. Un cils douce attaché à une pointe de pipette peut être utilisé pour déplacer des bactéries ou des vers dans les chambres au lieu d&#39;utiliser un pick de platine. Dans la plupart des cas, cependant, l&#39;agarose surséchée est la raison de dommages. Le pic ou cils devraient, idéalement, à peine toucher le agarose lui-même, et le film d&#39;eau sur la surface d&#39;agarose devrait retirer les vers et les bactéries. Quand les chambres d&#39;étanchéité, de plus, l&#39;humidité de l&#39;agarose est essentielle. Il ne devrait pasêtre tout liquide libre sur la surface de la gélose parce que cela peut laver les bactéries et les vers pendant le scellement. Grosses bulles peuvent être enlevés en soulevant doucement un coin de la dalle agar. De petites bulles plus petites que la chambre souvent piégés à l&#39;intérieur des chambres. Ces bulles ne sont pas un problème et vont disparaître par absorption. Après le montage de l&#39;antenne, vérifier à nouveau que l&#39;agarose est pas trop sec ou trop humide. Les chambres doivent être bien fermés et il ne devrait pas y avoir de flux de liquide entre les chambres. Si l&#39;agarose est trop humide, les chambres ne sont pas étanches. Worms peuvent échapper ou leur nourriture seront emportés. Si l&#39;échantillon est trop humide, simple d&#39;ouvrir le couvercle et laisser sécher agarose pendant une minute ou deux. Si l&#39;agarose est trop sec, les chambres peuvent effondrer et les vers vont échapper. Mise à l&#39;échelle par un zoom arrière Pour l&#39;imagerie de fluorescence, un zoom arrière est limitée par la faible quantité de lumière obtenue à faible grossissement. En outre, EMCCD caméras sont optimisé pour une sensibilité et ont souvent une résolution relativement faible. Toutefois, la mise à l&#39;imagerie quatre fois est bien possible. Par exemple, quatre chambres de 190 um x 190 um peuvent tenir sur une image lors de l&#39;utilisation 140X grossissement (réalisé en utilisant un 20X Objectif et une caméra 0.7X montage) et un pixel de 512 x 512, 8 x 8 mm caméra. Une caméra haute résolution avec une grande puce (comme sCMOS caméras, 16,6 mm x puce de 14 mm, 2560 x 2560 pixels = 5.5 mégapixels) optimise l&#39;intensification des DIC et l&#39;imagerie en champ clair. Par exemple, jusqu&#39;à 30 vers L1 à 190 um x 190 um chambres peuvent tenir sur chaque image de cette caméra en utilisant un grossissement 100x (voir Figure 3). En principe, un zoom arrière et la numérisation peut également être combinés pour obtenir encore plus de numéros d&#39;animaux. La plupart des neurones restent tout à fait bien au point, de sorte qu&#39;un seul plan focal doit être imagée. Si les neurones se trouvent à sortir de la mise au point, az numérisation à l&#39;aide d&#39;un lecteur de piézo peut être prise à chaque fois point. Adaptation aux différents comportements Ce protocole donne une bonne idée du comportement à travers des échelles de temps longues. Il est évident que la synchronisation des salves doit être adaptée à différents comportements et stades de la vie. Limites de la technique Plusieurs facteurs limitent la durée de l&#39;imagerie. Le plus important est la quantité de nourriture. Une fois que la nourriture est consommée, les larves cessé de se développer. Ainsi, dans de petites chambres (190 x 190 um) vers se développent jusqu&#39;au stade L3, puis arrêter. Si une durée de temps de formation d&#39;image est nécessaire, de plus grandes chambres doivent être utilisés. La durée maximale de l&#39;imagerie à long terme est de l&#39;ordre de 2,5 à 3 jours. Si plus imagerie est nécessaire, les vers doivent être récupérés et placés dans de nouvelles chambres. Lorsque imagerie vers adultes, une autre limitation est causée par la progéniture de ces vers. Les vers adultes pondent des œufs à partir de laquelle les larves éclosent. Ces larves sera également rester à l&#39;intérieur de la chambre, Consommer de la nourriture, et peuvent perturber l&#39;analyse d&#39;image. Si la progéniture est un problème, une solution est d&#39;utiliser soit les adultes stériles ou de placer plusieurs reprises les vers dans les chambres fraîches. Pour récupérer les vers, la dalle agarose contenant la chambre est coupée gratuit avec un scalpel, on arrache la lamelle, et est placé sur une plaque NGM à partir de laquelle les vers peuvent être récupérés. Une autre limite est la restriction des vers à des zones relativement petites. Cela peut être un problème si le mouvement à long terme doit être analysé. Alors que les animaux dans les chambres peuvent être stimulées mécaniquement et optogenetically 21,27,34,35, la nature fermée de la chambre, il sera difficile d&#39;appliquer stimulants solubles ou volatiles. Gaz biologiquement importants tels que l&#39;oxygène ou le dioxyde de carbone peuvent se diffuser librement dans la gélose. Le grand réservoir d&#39;air dans le plat devrait maintenir les concentrations de gaz dans les chambres constants sur le temps nécessaire pour les expériences. Cependant, il faut garder à l&#39;esprit que la Concentratio locale d&#39;oxygènen dans la chambre peut ressembler de plus les conditions trouvées dans une culture liquide de la culture sur la plaque. Importance par rapport aux méthodes existantes Les dispositifs microfluidiques ont grandement avancé comportement et du développement étudié en C. elegans. Souvent, les structures microfluidiques sont faites de PDMS 12. Ici, nous décrivons un protocole pour générer des chambres de culture microfluidiques fabriqués à partir d&#39;agarose. La force de cette technique est la combinaison de haute qualité d&#39;imagerie, la corrélation du comportement avec des mesures physiologiques, imagerie à long terme, et un assez haut débit. Haute qualité d&#39;image est obtenue par l&#39;imagerie à travers la lamelle de verre en utilisant des objectifs à grande ouverture numérique. Par conséquent, l&#39;imagerie par fluorescence tel que l&#39;imagerie de calcium et l&#39;imagerie confocale de structures sous-cellulaires peut être effectuée. Parce que les animaux ne sont pas immobilisés comme dans d&#39;autres systèmes, il permet une corrélation avec le comportement des mesures physiologiques. Because les animaux ont suffisamment de nourriture, ils continuent à développer l&#39;imagerie permettant à long terme. Ce système peut l&#39;image de beaucoup de vers en une seule opération parce que les animaux sont limités à leurs chambres définies. Ainsi, ce procédé peut être facilement mis à l&#39;échelle en place 9,27,34-36. Les applications futures Jusqu&#39;à présent, ce système a été utilisé principalement pour étudier le comportement de sommeil en C. elegans larves L1. Cependant, l&#39;adaptation à toutes les étapes, il sera possible d&#39;étudier un large éventail de comportements aussi dans dauers et les adultes. Un large éventail de comportements peut être étudiée avec cette technique allant de l&#39;accouplement à la ponte.

Caenorhabditis elegans a été établi comme système modèle pour étudier le comportement1. En raison de son adaptation à la génétique, les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents au comportement peuvent être étudiés. De nombreux comportements se produisent sur de longues échelles de temps. Deux approches principales peuvent être utilisées pour observer les animaux mobiles sur de longues échelles de temps. La première approche consiste à suivre l’animal pendant son mouvement à l’aide d’une platine automatisée ou d’une caméra2-8 et la seconde consiste à restreindre le mouvement à une portée au moins aussi petite que le champ de vision de la caméra9-14. Les deux méthodes ont leurs avantages. Le pistage permet de suivre un animal sur de longues distances spatiales, mais limite le nombre d’animaux qui peuvent être discernés dans une expérience. La restriction des mouvements des animaux permet d’étendre l’observation à de nombreux individus en même temps en utilisant des réseaux de compartiments restreints. 
Parce que le nématode est transparent, l’imagerie fluorescente en direct peut être réalisée de manière non invasive15. L’imagerie calcique fournit une lecture fonctionnelle de l’activité des cellules excitables et est établie pour C. elegans16-20. Le calcium pénètre dans la cellule par des canaux dans la membrane plasmique qui s’ouvrent lors de la dépolarisation. Ainsi, le calcium agit comme un proxy de l’activité neuronale. Les capteurs de calcium peuvent être regroupés en deux grandes classes, les capteurs ratiométriques et les capteurs non ratiométriques. Les deux classes utilisent des changements conformationnels des protéines de liaison au calcium induits lors de la liaison du calcium. Les capteurs ratiométriques contiennent deux protéines fluorescentes. Lorsque la protéine fluorescente de longueur d’onde inférieure est excitée, une partie de l’énergie lumineuse est transmise à la protéine fluorescente de longueur d’onde supérieure en fonction de leur distance dans un processus appelé transfert d’énergie de résonance de fluorescence ou transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET)21. Les capteurs non ratiométriques sont basés sur la GFP permutée circulairement et utilisent la détrempe du fluorophore causée par la liaison au calcium22. Chaque classe a ses avantages. Alors que les capteurs ratiométriques sont moins sensibles aux artefacts de mouvement ou d’expression, les capteurs non ratiométriques ont généralement une plage dynamique plus élevée. Les capteurs ratiométriques et non ratiométriques ont été utiles pour étudier l’activité des cellules excitables chez C. elegans16-20,23,24. 
Lors de l’imagerie de fluorescence à long terme, l’expérimentateur devra faire face à plusieurs défis potentiels : 1. Perturbation du comportement par la lumière d’excitation : Les vers sont sensibles à la lumière d’excitation de fluorescence de courte longueur d’onde et évitent la lumière de la gamme violette à bleue qui est utilisée pour l’imagerie calcique25,26. Les vers répondent par une réponse d’échappement vers l’arrière ou vers l’avant25,26. Ainsi, la quantité de lumière doit être contrôlée. 2. Blanchiment de la protéine du capteur fluorescent : Souvent, le blanchiment de la protéine fluorescente entrave l’imagerie à long terme. En règle générale, cependant, les intensités lumineuses nécessaires pour observer le blanchissement sont plus élevées que les intensités lumineuses qui provoquent des effets perturbateurs sur le comportement des animaux. Ainsi, le blanchiment n’est qu’un problème théorique dans ce type d’imagerie calcique. 3. Les vers à l’intérieur des microchambres ne sont pas fixes et se déplacent constamment pendant le comportement de sillage et les images peuvent apparaître floues si le ver n’est pas immobilisé. Tous ces défis peuvent être résolus en utilisant des temps d’exposition extrêmement courts avec une faible intensité lumineuse. Cela peut être réalisé en utilisant une caméra EMCCD très sensible avec des temps d’exposition courts et un déclenchement externe d’une diode électroluminescente (LED). Pour exposer les vers à la lumière d’éclairage aussi brièvement que possible (uniquement pendant le temps d’exposition de l’appareil photo), la LED est déclenchée de l’extérieur à l’aide d’un signal logique transistor-transistor (TTL) que l’appareil photo émet pendant l’exposition, ce qui entraîne un éclairage du ver pendant le temps précis pendant lequel la puce de l’appareil photo est exposée. Cela signifie également que la puce EMCCD sera sombre lors de la lecture des données, ce qui est optimal pour les performances de lecture de cette puce. 
Auparavant, des microchambres d’agarose ont été développées pour l’imagerie par fluorescence à long terme des larves de C. elegans 9. Ici, il est décrit comment les micro-chambres d’agarose peuvent être utilisées pour l’imagerie calcique à long terme pour n’importe quel stade de vie de C. elegans, comment l’imagerie calcique peut être réalisée et comment cette méthode peut être mise à l’échelle pour tester de nombreux vers individuels en parallèle.

<table><tbody><tr><td>Agarose à point de fusion élevé</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP(E)164-1000</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à point de fusion bas Vision Top Vision</td> Système LED <td>R0801</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>CoolLED</td><td>pE-2</td><td></td></tr><tr><td>Microscope composé</td><td>Nikon</td><td>TiE</td><td></td></tr><tr><td>Caméra</td><td>Leica</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>maintenant vendu sous le nom d’iXon Ultra 897</td></tr><tr><td>Caméra sCMOS</td><td>Andor</td><td>Neo</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur de plasma</td><td>Harrick</td><td>PDC-23G2</td><td></td></tr><tr><td>Chauffage de couvercle</td><td>Atelier MPI</td><td>sur</td><td></td>mesure</tr><tr><td>Plat en plastique</td><td>Falcon</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Platine Z pour le microscope</td><td>Platine Nano</td><td>Scan Z</td><td></td></tr><tr><td>X-Y pour le microscope</td><td>Tampon PDMS Prior</td><td>Proscan III</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Abbott Laboratories</td><td>sur</td><td></td>mesure</tr><tr><td>Filtre à lumière rouge</td><td>Chroma</td><td>ET660/50m</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Boîte</td> de <td></td><td>Pétri Falcon Falcon Boîtes de Pétri jetables, stériles, Corning</td><td></td></tr><tr><td>Ruban adhésif double face</td><td>Sellotape/Henkel</td><td>double face 25 mm x 33 m</td><td>alternativement, du ruban adhésif double face avancé de Rubance Adhesives peut être utilisé.</td></tr></tbody></table>

microchambres agarose à long terme de l&#39;imagerie calcique<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Le comportement est contrôlé par le système nerveux. Imagerie calcique est une méthode simple chez le nématode Caenorhabditis elegans transparent pour mesurer l&#39;activité des neurones au cours de divers comportements. Pour corréler l&#39;activité neuronale avec le comportement, l&#39;animal ne doit pas être immobilisé, mais devrait être en mesure de se déplacer. Beaucoup de changements de comportement se produisent pendant de longues échelles de temps et nécessitent l&#39;enregistrement au cours de nombreuses heures de comportement. Cela rend également nécessaire à la culture des vers à la présence de nourriture. Comment les vers peuvent être cultivées et leur activité neuronale imagée sur des échelles de temps longues? Agarose Microchambre Imaging (AMI) a déjà été développé à la culture et observer les petites larves et a été adapté pour étudier toutes les étapes de la vie du début L1 jusqu&#39;au stade adulte de C. elegans. AMI peut être effectuée sur divers stades de vie de C. elegans. Imagerie calcique à long terme est obtenue sans immobiliser les animaux en utilisant des expositions à court extérieur déclenchées comcombinée avec une multiplication d&#39;électrons de dispositif d&#39;enregistrement (EMCCD) caméra à couplage de charge. Zoom arrière ou la numérisation peut évoluer jusqu&#39;à cette méthode à l&#39;image jusqu&#39;à 40 vers en parallèle. Ainsi, un procédé est décrit pour le comportement de l&#39;image et l&#39;activité neuronale sur des échelles de temps longues dans toutes les étapes de la vie de C. elegans.

Microchambres agarose peuvent être appliquées à toute étape de la vie de C. elegans. Comme on peut le voir sur la figure 1A, le développement des larves et le comportement au cours du sommeil L1 lethargus peuvent être observées. Affichés sont des tailles de chambre qui sont 190 x 190 um, 10 um de profondeur. Si des échelles de temps plus longues sont nécessaires, les grandes chambres peuvent être utilisés. Comme on peut le voir sur la figure 1B, en utilisant une chambre avec des dimensions plus grandes (370 x 370 um, 25 um de profondeur) permet le développement de C. elegans de l&#39;oeuf jusqu&#39;à l&#39;adulte. Figure 1C montre une analyse des changements à long terme dans le comportement en utilisant le principe de soustraction d&#39;un ver grandi dans une chambre de l&#39;oeuf jusqu&#39;à l&#39;adulte. Montré sont des intensités moyennes après soustraction d&#39;une image pour rafales sélectionnés pendant sillage et lethargus. La baisse de l&#39;intensité moyenne après les valeurs cadre de soustraction est élevé, plus la mobilité du ver. Montré sont choisis traces d&#39;éclatement d&#39;un état d&#39;éveil et une condition de lethargus par stade larvaire. Leaugmentation observée en intensité moyenne au cours du développement est principalement due à l&#39;augmentation de contraste et la taille de l&#39;animal. Figure 1D montre une larve dauer, un stade de remplacement de la vie qui est engagée dans des conditions environnementales défavorables 33. taille de la chambre est de 370 x 370 um, 15 um de profondeur. Notez que la larve de dauer a été placée dans la chambre sans nourriture bactérienne, ce qui provoquerait la sortie du stade larvaire dauer. Figure 1E montre un ver adulte qui a déjà mis beaucoup d&#39;oeufs dans la chambre. Dimensions de la chambre utilisée pour l&#39;adulte étaient 700 x 700 um, 45 um de profondeur. Enfin, la figure 1F montre un hermaphrodite adulte et un accouplement mâle à l&#39;intérieur d&#39;une chambre d&#39;adulte. Imagerie calcique dans les vers mobiles est possible avec des capteurs de calcium GCaMP. Figures 2A, B montrent imagerie calcique de la commande interneurone AVA pour une larve L1 27. Les figures 2C, D montrent une activité de calcium pour la SAme type de neurone dans un animal adulte. Mettre en place l&#39;imagerie à long terme est possible par la numérisation et en zoomant sur. Figure 3A montre la qualité d&#39;image de l&#39;imagerie simultanée de 30 vers sur une puce de la caméra avec un appareil photo de 5 mégapixels. La figure 3B montre la qualité de 4 vers calcium imagée simultanément d&#39;image. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" width="700" /> Figure 1. Adaptation de l&#39;AMI à tous les stades de la vie de C. elegans. (A) Larve imagée à partir de début L1 jusqu&#39;à ce stade précoce L2 en 190 x 190 um chambres. (B) le développement de l&#39;oeuf jusqu&#39;à l&#39;adulte dans une chambre 370 x 370 um. (C) La mobilité d&#39;un ver évaluée à l&#39;aide de soustraction. Montré est l&#39;intensité moyenne de toutes les images de l&#39;image après soustraction d&#39;une image pour un film en rafale sélectionnée pour chaque sta larvairege sillage et le comportement lethargus. (D) Une larve de dauer en l&#39;absence d&#39;alimentation dans une chambre de 370 x 370 um. Hermaphrodite (E) des adultes avec de nombreux œufs pondus dans une chambre de 700 x 700 um. (F) d&#39;accouplement d&#39;un mâle et d&#39;une hermaphrodite intérieur d&#39;une chambre de 700 x 700 pm. YA signifie jeune adulte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" width="700" /> Figure 2. imagerie de calcium avec AMI. (A) d&#39;imagerie de calcium avec GCaMP3 dans la commande interneurone AVA des larves L1 en utilisant le promoteur RMN-1. Montré sont deux images en fausses couleurs. Dans l&#39;image de gauche, l&#39;activité de AVA est faible et le ver ne fait pas un mouvement vers l&#39;arrière. Dans l&#39;image de droite l&#39;activité de AVA est<html> haute, et le ver se déplace vers l&#39;arrière. transitoires (B) de calcium dans le temps pour un ver L1. (C, D) transitoires de calcium dans un animal adulte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig3highres.jpg" width="700" /> Figure 3. imagerie multiples vers en parallèle par un zoom arrière. (A) de l&#39;imagerie simultanée de 30 L1 vers par trame utilisant 190 x 190 um chambres et un grossissement 100X (en utilisant un objectif 10X) et une puce de caméra 16,6 x 14 mm. (B) de l&#39;imagerie simultanée de quatre vers L3 par image à l&#39;aide de 370 x 370 um chambres et 100X et une région d&#39;intérêt d&#39;une puce de caméra 16,6 x 14 mm.et = &quot;_ blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

L’imagerie du comportement et de l’activité neuronale sur de longues échelles de temps sans immobilisation de l’animal est une condition préalable à la compréhension du comportement. L’imagerie des chambres microfluidiques à l’agarose (IAM) peut être utilisée pour imager l’activité neuronale et le comportement à tous les stades de la vie de Caenorhabditis elegans.

Microchambres agarose à long terme de l&#39;imagerie calcique<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de surveiller le développement du comportement et l'activité neuronale de plusieurs C. elegans âgés. Ceci est réalisé en cultivant les vers dans des chambres microfluidiques remplies de nourriture. Une imagerie calcique à long terme est effectuée à l'aide d'une caméra E-M-C-C-D et de temps d'exposition courts déclenchés par un signal TTL.Le protocole peut être amplifié en scannant plusieurs chambres séquentiellement ou en filmant plusieurs chambres simultanément. Les résultats montrent le comportement des larves et des adultes ainsi que les transitoires calciques des interneurones de commande. Le principal avantage de cette technique de microchambre est que le comportement et le développement peuvent être suivis sur une longue période avec un imagerie de haute qualité.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car il est difficile d'apprendre à remplir correctement les micro-chambres avec la quantité adéquate de nourriture et de chaleur. Pour commencer, configurez un microscope équipé d'un réchauffeur de plateau, d'une platine motorisée et d'un système de caméra E-M-C-C-D. Fabriquez des tampons en polyméthylséboxane dans un laboratoire de microfluidique ou à l'aide d'une fonderie commerciale.Découper la puce en PDMS en 16 tampons individuels à l’aide d’un scalpel. Ensuite, exposer le tampon et une lame de verre au plasma d’air pendant environ une minute avant de fixer le tampon sur la lame. Travailler lentement afin d’éviter de faire fondre le plastique.Découper une zone carrée au fond d'une boîte de 3,5 centimètres. Préparer plusieurs boîtes simultanément. Préparer des aliquotes stériles d'aéro à point de fusion élevé et à point de fusion bas avant utilisation.Placer trois aliquotes d'aéros à point de fusion élevé sur un bloc chauffant. En outre, faire fondre une éloqua d'aéros à point de fusion bas avant de la transférer sur un bloc chauffant séparé. Commencer par prendre le plat en plastique avec l'ouverture carrée créée précédemment et le placer à l'envers, l'ouverture tournée vers le haut.Utilisez un morceau de ruban adhésif double face pour couvrir l'ouverture. Retournez le plat afin que le ruban adhésif se trouve sur le dessous et placez le plat sur une surface dure. Découpez l'ouverture à l’aide d’un scalpel.Ensuite, remplissez la zone entourant l'ouverture avec deux millilitres d'agarose à point de fusion élevé. Attendez jusqu'à ce que l'agarose soit solidifiée. Une fois solidifiée, retirez le film protecteur recouvrant le ruban adhésif double face sur l'autre face.Cela donne un fin anneau de ruban adhésif qui entoure l'extérieur de l'ouverture. L'agar constitue un réservoir d'humidité qui entourera ultérieurement l'échantillon. Avant de construire les micro-chambres, préparez la surface du tampon en PDMS en l'exposant au plasma d'air pendant 20 à 60 secondes.Créez deux entretoises de hauteur égale en empilant de cinq à neuf lames de verre. Placez une lame de verre unique entre les deux piles d'entretoises. Ensuite, positionnez la lame de verre contenant le tampon en PDMS par-dessus les entretoises.Réglez la hauteur des entretoises de manière à obtenir un espace de 1,5 millimètre entre la surface de moulage et la lame de verre. Une fois prêt, déposez une goutte d’aros chaud à point de fusion élevé sur la lame, près du poinçon en PDMS, puis faites glisser rapidement le poinçon horizontalement dans le liquide d’aros. Lorsque l’aros est solidifié et apparaît opaque, retirez le poinçon verticalement d’un seul mouvement.À l’aide d’un fin crochet en platine, transférez les œufs ou les vers accompagnés des bactéries OP50 sur le aros. Utilisez un cil pour répartir un œuf ou un ver par chambre, avec de la nourriture. Un tampon aros doit contenir environ 30 vers.Découper la tranche d'agarose contenant les micro-chambres en un carré afin qu'elle s'insère bien dans l'ouverture de la boîte. Utiliser une pince pour soulever la tranche et la placer à l'envers sur une lame de couverture en verre ; une fois posée, ne pas soulever ni faire glisser la lame. Pour éviter de chasser les contenus hors de leurs chambres.Les chambres sont désormais scellées. Ensuite, placez la lame couvre-objet dans l'ouverture de la boîte en plastique. Appuyez doucement la lame couvre-objet contre l'anneau constitué de ruban adhésif double face.Prenez soin de ne pas casser le verre. Retournez le plat et utilisez de l'agarose à bas point de fusion pour combler l'espace entre la lame d'agarose et le réservoir d'agarose. Une fois l'agarose solidifiée, scellez le plat avec un couvercle et du parafilm.Après avoir terminé la préparation des microchambres, vérifiez-les correctement au microscope stéréoscopique. Le remplissage des chambres et le contrôle de l'humidité sont essentiels pour réussir. Pour commencer, placez la boîte contenant les microchambres sur le microscope et focalisez sur l'échantillon. Enregistrez 40 images en 20 secondes toutes les demi-heures pendant 24 heures.Ensuite, configurez le balayage pour qu'il visite chaque ver à l'aide de la platine. Essayez d'enregistrer environ 30 vers en une seule série. Plusieurs vers peuvent être imagés en effectuant un zoom arrière.Utilisez un grossissement plus faible pour couvrir plusieurs micro-chambres et filmer simultanément plusieurs micro-chambres adjacentes. À la fin de l'acquisition d'images, séparez les données pour chaque chambre individuelle en rognant une région d'intérêt couvrant un animal. La soustraction d'images peut être utilisée pour évaluer rapidement les données de mobilité.Après l'acquisition d'images, l'imagerie calcique est réalisée sur un microscope composé équipé pour la fluorescence épi en champ large. Pour limiter l'exposition à la lumière, utilisez un signal logique transistor-transistor qui déclenche une LED afin d'illuminer l'échantillon. En même temps, la caméra enregistre une image.Exécutez un film en rafales pendant 24 heures, en imagerie de chaque ver toutes les 15 à 30 minutes. Commencez par enregistrer 20 secondes en contraste de phase DIC.Ensuite, 20 secondes avec la fluorescence GFP. Et enfin, une image du signal MK deux pour les niveaux d'expression témoins. Pour l'inspection visuelle des données, utilisez une carte de couleurs fausses pour améliorer la visibilité des petites variations d'intensité de fluorescence.Enfin, effectuez l'analyse des données calciques en utilisant des procédures standard. Cet exemple montre le comportement larvaire. Une chambre aux dimensions plus grandes permet le développement d'un œuf à l'âge adulte sur le long terme ; les changements de comportement sont illustrés ici.La larve dauer présente ici est un stade de vie alternatif activé en cas de conditions environnementales défavorables. Ce ver adulte a pondu de nombreux œufs dans la chambre. Enfin, cette image montre un hermaphrodite adulte et un mâle en train de s'accoupler à l'intérieur d'une chambre adulte.L'imagerie calcique du motoneurone commandeur A VA chez une larve de stade L1 est présentée ici. Ces images montrent l'activité calcique pour le même type de neurone chez un animal adulte. L'augmentation de l'imagerie à long terme permet d'acquérir des images de 30 vers sur une seule puce de caméra.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de remplir les chambres avec la bonne quantité de nourriture et de s'assurer des mouvements corrects de l'agarro. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser l'imagerie par microchambre aros sur divers stades de vie de sea elegance.

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