Imagerie in vivo et le suivi de technétium 99m Étiqueté moelle osseuse Cellules souches mésenchymateuses dans Tendinopathie Hippique

L'objectif général de ce protocole est de suivre de manière non invasive la distribution et le devenir de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse marquées après leur injection par scintigraphie gamma. Le devenir des cellules souches après injection est mal compris. Les principaux avantages de cette technique sont qu'elle permet de suivre de manière non invasive les cellules souches vers plusieurs organes après administration, et que la courte demi-vie de l'ostéo A assure son élimination dans les 48 heures.

Bien que cela ait permis de mieux comprendre l'utilisation des cellules souches dans le traitement des tendinopathies spontanées, cette méthode pourrait également être utilisée pour étudier les thérapies des maladies osseuses et cardiaques. En général, les difficultés auxquelles sont confrontés les débutants dans cette méthode concernent la coordination des cellules, le choix de l'agent de marquage et la préparation du patient. Pour une application immédiate des cellules, commencez par appliquer un gel de couplage acoustique sur le membre rasé et utilisez un transducteur linéaire pour examiner systématiquement toute la région métacarpienne palmaire afin d'obtenir des séries d'images transversales et longitudinales en incidence normale, permettant d'identifier la zone lésionnelle maximale.

Après l'administration de l'anesthésique local, nettoyer le site d'implantation avec une solution chirurgicale de chlorhexidine pendant au moins cinq minutes, puis essuyer avec un tampon de gaze imbibé d'éthanol. Ensuite, porter une paire de gants lorsque l'animal est préparé, puis centrifuger un aliquot de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse correspondant à une fois dix puissance sept cellules dans un millilitre de surnageant de moelle osseuse. Aspirer ensuite le surnageant à l’aide d’une seringue de deux millilitres munie d’une aiguille de 18 ou 19 gauge, en laissant environ 100 microlitres de solution dans le tube.

Transférez le surnageant dans un tube de microcentrifugeuse placé sur de la glace, puis resuspendez délicatement les cellules dans les 100 microlitres résiduels de surnageant en tapotant légèrement le tube. Veillez à ce que les cellules soient complètement resuspendues et qu’il n’y ait aucun agrégat tissulaire visible. Incubez ensuite les cellules à température ambiante.

Mélangez maintenant un millilitre du Protec technétium agité dans un flacon d'H-M-P-A-O. Après cinq minutes, utilisez une seringue et une aiguille d'un millilitre pour traiter les cellules souches mésenchymateuses avec l'aliquot entier de TECHNETIUM 99 M-H-M-P-A-O. Ensuite, fermez le tube, mélangez les cellules en le secouant doucement et placez le tube à température ambiante derrière un écran de plomb.

Après 30 minutes, ouvrez le tube à l’aide d’une pince et utilisez une seringue graduée d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 21 pour ajouter un millilitre de PBS aux cellules. Rebouchez le tube et mélangez les cellules. Ensuite, centrifugez les cellules et utilisez la seringue de deux millilitres pour transférer soigneusement le surnageant dans un tube étiqueté « lavage 1 » présumé blindé.

Ensuite, lavez le culot dans un autre millilitre de PBS comme vient de l'être démontré. Transférez le deuxième lavage dans un tube étiqueté W2 après le deuxième lavage. Resuspendez soigneusement les cellules dans le PBS résiduel et dans l'aliquote de surnageant de moelle osseuse glacé, en maintenant le transducteur parallèlement à l'aiguille.

Introduisez lentement une aiguille de calibre 20 de 1,5 ou deux pouces dans la zone de lésion maximale au centre de la lésion, en orientation longitudinale. Ensuite, à l’aide du blindage approprié, aspirez les cellules dans une seringue de deux millilitres à système Luer-lock équipée d’une aiguille de calibre 20, puis jetez l’aiguille en prenant soin de ne perdre aucun liquide. Après avoir fixé la seringue à l’aiguille préalablement placée dans le tendon, positionnez la sonde échographique sous l’aiguille de manière à ce que le trajet de l’aiguille dans le tissu soit clairement visible, puis injectez les cellules à un rythme lent mais régulier dans la lésion.

Une fois que toutes les cellules ont été administrées, vérifiez que le liquide éjecté dans la lésion est visible sur l'image échographique comme un liquide kystique contenant des bulles d'air hyperéchogènes, puis retirez l'aiguille. Utilisez les options de sélection d'étude et d'acquisition statique osseuse dans le logiciel de traitement pour acquérir des images fixes pendant 60 secondes chacune. Ensuite, obtenez des images latérales de la zone lésionnelle, depuis le carpe jusqu'à l'extrémité distale, de la région équivalente du membre controlatéral, du champ pulmonaire gauche et de la thyroïde gauche aux moments indiqués.

Ensuite, sélectionnez la région d'intérêt et les outils d'ellipse, puis redéfinissez le masque de sélection sur la zone lésionnelle selon les besoins. Enfin, choisissez l'option d'ajout de deux statistiques pour obtenir les décomptes dans la région d'intérêt. Veillez à ce que des régions d'intérêt de taille identique soient enregistrées pour chaque animal aux différents points temporels.

Après une administration intra-lésionnelle, les cellules apparaissent comme une zone localisée de signal avec une diffusion limitée des cellules vers les tissus tendineux environnants au fil du temps. En revanche, lorsque les cellules sont administrées par perfusion régionale via la veine palmaire digitale, une réduction progressive du signal est observée au site d'injection. Au fil du temps, les champs pulmonaires sont généralement négatifs après injection intra-lésionnelle, mais occasionnellement, un signal très focal qui devient plus généralisé au fil du temps peut être détecté lors des premiers temps d'observation.

La thyroïde reste négative par cette voie d'administration également. La perfusion régionale montre aussi un signal focalisé dans les poumons, qui devient plus diffus au fil du temps, bien que l'intensité du signal soit nettement plus élevée par rapport à celle observée avec la voie intralésionnelle. Étant donné qu'une thyroïde présente souvent un signal focalisé, le nombre total initial d'isotopes radioactifs des cellules aux temps zéro avant l'injection, ainsi que les comptages du premier scintigramme gamma dans la région d'intérêt.

Le temps zéro post-injection peut être utilisé pour calculer le pourcentage de diminution des décomptes à chaque point temporel après l'injection, afin de déterminer la décroissance prédite du TC 99 M à partir des décomptes initiaux. La persistance des cellules restantes sur le site d'injection peut alors également être calculée à chaque moment après l'injection. En suivant cette procédure, d'autres voies d'administration cellulaire peuvent être appliquées pour répondre à des questions supplémentaires concernant la capacité d'homing des cellules souches mésenchymateuses après leur développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la médecine régionale pour explorer des méthodes visant à améliorer la rétention cellulaire au sein des lésions tendineuses. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de marquer les cellules et d'enregistrer leur distribution et leur concentration dans différents systèmes organiques. N'oubliez pas que le travail avec des rayonnements ionisants peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l'équipement de protection individuelle, les détecteurs de rayonnement, les écrans en plomb et l'élimination appropriée des déchets contaminés sont essentielles lors de la réalisation de cette procédure.