Name: Imagerie in vivo et le suivi de technétium 99m Étiqueté moelle osseuse Cellules souches mésenchymateuses dans Tendinopathie Hippique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Découvrez le suivi non invasif de cellules souches mésenchymateuses marquées au technétium 99m par scintigraphie gamma dans les tendinopathies équines. Cette méthode permet d'évaluer la survie et la distribution cellulaire.

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Les auteurs tiennent à remercier le Horserace Betting Levy Board U.K. (numéro de subvention 721) et VetCell BioScience Ltd, Royaume-Uni, ainsi que le financement de Consejerìa de Innovaciòn, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucìa, Espagne.

Les cas décrits ici ont été effectuées après la permission éthique accordée par le Comité de l&#39;éthique animale et du bien-être du Colegio de Veterinarios de Malaga, en Espagne, et la Royal Veterinary College, North Mymms, Royaume-Uni Les procédures utilisées sur les chevaux sont basées sur les protocoles approuvés qui sont utilisé dans la clinique sur des chevaux recevant des thérapies à base de cellules souches, qui comprend la sédation, l&#39;aspiration de la moelle osseuse, l&#39;injection intra-tendineux, perfusion régionale, l&#39;injection intraveineuse, la gestion du traitement et de la douleur post-opératoire et le suivi après l&#39;implantation. 1. Des dispositions clés à fait à l&#39;avance <ol><li> Cherchez l&#39;éthique institutionnels et l&#39;approbation de bien-être animal et de respecter les exigences légales locales avant de commencer à travailler. </li><li> Obtenir l&#39;approbation institutionnelle de travailler avec les rayonnements ionisants comme dicté par les réglementations locales et juridiques, y compris le niveau approprié de protection du personnel et de l&#39;environnement et l&#39;élimination des CONTAMdéchets inés. </li><li> Utiliser les critères d&#39;inclusion suivants: les chevaux présents avec une blessure de surmenage non-traumatique (tendinopathie ou Desmopathie) au tendon du fléchisseur superficiel du membre antérieur et des lésions résultant en un défaut dans le tendon et le défaut est entouré de tendon et / ou paratendon intacte . Note: L&#39;examen et le diagnostic de ces blessures et la préparation clinique des chevaux pour l&#39;implantation des cellules a été détaillée ailleurs 6,15. Remarque: L&#39;isolement et l&#39;expansion de la culture de BMMSC dérivé de la moelle osseuse des chevaux a été détaillé précédemment 6,16. Le protocole actuel pour injecter BMMSC pour blessures SDFT chez le cheval utilise 10 millions de cellules par ml de surnageant 4 de la moelle osseuse autologue (BMS) 16. </li><li> Utilisation des cellules qui ont subi pas plus de 4 passages pour l&#39;implantation in vivo afin d&#39;éviter phénotype cellulaire potentiel ou des altérations génétiques associées à nombre élevé passage caunes. </li><li> Remettre le nombre requis de cellules dans le BMS (dans les 24 heures dans une boîte de refroidissement à 4-8 ° C) à la clinique vétérinaire où l&#39;implantation des cellules doit être effectuée. Note: L&#39;utilisation clinique des cellules souches mésenchymateuses dans le surnageant de moelle osseuse est une procédure brevetée détenue par ReCellerate Inc (USA) et son utilisation peuvent nécessiter une autorisation. Remarque: Tc-99m est un émetteur gamma (140 keV) avec une demi-vie relativement courte (6,0058 h, donc près de 94% de celui-ci se désintègre à sa forme stable de 99 Tc en 24 h). L&#39;énergie gamma rend approprié pour la détection par des caméras gamma (scintigraphie) et les résultats courte demi-vie dans le temps très limité à la fois le cheval et le personnel de manutention des animaux exposition aux rayonnements. Ce protocole décrit le marquage in situ des cellules en utilisant le Tc-99m-HMPAO [HMPAO marqué avec Tc-99m (sous forme de pertechnétate de sodium)]. </li><li> Commandez le Tc-99m frais du fournisseur tel qu&#39;il est livré et utilisé pour étiqueter les cellules d&#39;esprithin 2 h d&#39;élution du générateur de Tc-99m. Assurez-vous que le Tc-99m est fourni en 1 GBq dans (tampon standard du fournisseur) 1 ml de solution. </li><li> Utilisez tous les tampons à la température ambiante. Effectuez la procédure d&#39;étiquetage, l&#39;implantation des cellules et de l&#39;imagerie (scintigraphie gamma) dans une chambre de confinement d&#39;isotopes avec tout l&#39;équipement nettoyé avec de l&#39;alcool lingettes avant le début des travaux. </li></ol> 2. Préparation du Cheval et de l&#39;échographie forelimb Tendon <ol><li> Échographies d&#39;enregistrement à la première admission pour blessures (lorsque la moelle osseuse est aspiré) puis au point de temps lorsque les cellules sont injectées radiomarqués. </li><li> Effectuer l&#39;échographie et l&#39;implantation des cellules avec le cheval portant le poids uniformément dans une stalle et sous sédation debout (plutôt que l&#39;anesthésie générale). Administrer une sédation à l&#39;aide d&#39;un mélange de chlorhydrate de détomidine et le tartrate de butorphanol, chacun à raison de 0,01 à 0,02 mg / kg IV. Remarque: La récupération est rapide et post-traitement chirurgical ne nécessite pasconsidérations spéciales. </li><li> Après anesthésie périneurale est appliquée (étape 2.6) dans le membre affecté, garder le cheval à la station sous sédation pour réduire le mouvement du cheval pendant le traitement. Contrôler visuellement le niveau approprié de sédation jugé à partir de la position de la tête baissée et le comportement du cheval et que le cheval est à l&#39;aise lors de l&#39;injection des cellules et les mouvements de la caméra gamma lors de l&#39;acquisition des images scintigraphiques. Remarque: Il est pas nécessaire d&#39;appliquer vétérinaire pommade sur les yeux (pour prévenir la sécheresse), car sous sédation clignotant est pas affectée et le cheval est capable de maintenir l&#39;hydratation des yeux. Le suivi après l&#39;implantation des cellules est non-invasive (échographie et scintigraphie gamma). </li><li> Clip de près les cheveux recouvrant le tendon (avec une tondeuse de crin de cheval) puis nettoyer la zone rasée en utilisant une combinaison d&#39;un lavage chirurgical de chlorhexidine et enfin l&#39;alcool. </li><li> Appliquer le gel de couplage acoustique dans la région etbalayer méthodiquement pour enregistrer les scans de la région complète métacarpien palmaire, des niveaux marqués successivement 1 - 7 17, avec un transducteur linéaire (12 MHz ou similaire) pour obtenir série transversale sur-incidence et images longitudinales. Stocker les images numériques de sorte que la surface de section transversale et la zone de lésion maximale 4 peuvent être obtenus à l&#39;aide du logiciel d&#39;analyse d&#39;image. </li><li> Préparer la zone recouvrant les nerfs palmaire immédiatement en aval de la carpe aseptique pour injection d&#39;un anesthésique local pour assurer une désensibilisation complète de la peau recouvrant le tendon et le tendon fléchisseur digital superficiel du. Injecter 2 ml de mepivicaine voie sous-cutanée à la fois et de façon adjacente aux nerfs palmaire (dans leur emplacement de sous-aponévrotique) entre les tendons fléchisseurs et le ligament suspenseur immédiatement en aval de la carpe des deux côtés de la branche. </li><li> Une fois l&#39;analyse préliminaire a été effectuée préparer le site d&#39;implantation en frottant la surface avec un chlorhexidine s chirurgicalesCRUB solution pendant au moins 5 min, et enfin avec de la gaze imbibée d&#39;alcool. Effectuez toutes les étapes ultérieures de façon aseptique. </li></ol> 3. Tc-99m-étiquetage des mésenchymateuses Hippique cellules souches Remarque: Les étapes d&#39;étiquetage de cellules peuvent être effectuées pendant l&#39;échographie de la patte antérieure, ce qui réduira la désintégration des isotopes entre l&#39;étiquetage de la cellule et l&#39;implantation de cellules marquées dans le tendon. <ol><li> Retirer le BMS à partir des cellules car elle interfère avec l&#39;absorption de l&#39;isotope. Pour ce faire, récupérer le flacon de BMMSC (10 millions de cellules dans 1 ml de BMS) dans la zone de refroidissement et de sédimenter les cellules dans une microcentrifugeuse à 350 g pendant 5 min à température ambiante. Retirer délicatement le surnageant avec une aiguille 18G ou 19G (attachée à une seringue de 2 ml), laissant une petite goutte (≤ 0,1 ml) dans le tube pour faciliter la remise en suspension de cellules. Enregistrez le surnageant (BMS) dans un tube à centrifuger stérile et garder sur la glace pour une réutilisation ultérieure. </li><li> Resuspendre les cellules dans le surnageant résiduel de gouttelette par flIcking doucement le tube avec les doigts (plutôt que vortex) et de laisser le tube dans un rack à température ambiante. Assurer que les cellules sont remises en suspension complètement et qu&#39;il n&#39;y a pas visibles amas cellulaires. </li><li> Préparer le Tc-99m comme suit. Transférer 1 ml de pertechnétate de technétium dans un flacon de HMPAO aide d&#39;une seringue de 1 ml et une aiguille. Mélanger doucement mais soigneusement et laisser reposer 5 min derrière le blindage de plomb. Remarque: Cette étape peut être fait alors que les cellules tournent à l&#39;étape 2.1. </li><li> Ajouter la totalité du mélange Tc-99m-HMPAO aide d&#39;une seringue de 1 ml et une aiguille pour les cellules et mélanger doucement. Incuber pendant 30 min à température ambiante derrière le blindage de plomb. </li><li> Pour les prochaines étapes, utilisez une pince (ou un morceau de papier de soie) pour ouvrir le couvercle du tube à centrifuger pour minimiser la contamination des isotopes de l&#39;(gantée) pouce et ultérieurement d&#39;autres équipements. Utiliser une seringue de 2 ml et 21 aiguille G pour ajouter ou supprimer un tampon de lavage. Note: L&#39;utilisation d&#39;un moniteur domaine des isotopes est encouragé à surveiller la contamination des surfaces et des équipements. </li&gt; <li> Ajouter 1 ml de PBS au mélange Tc-99m-HMPAO-cellulaire, fermer le couvercle, mélanger délicatement et de spin pour sédimenter les cellules comme dans l&#39;étape 3.1. </li><li> Retirez délicatement la PBS pour un nouveau tube (enregistrer cette derrière le blindage de plomb et l&#39;étiquette que W1). Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de PBS frais. Centrifuger le tube et retirer le surnageant comme ci-dessus (enregistrer cette étiquette et W2). </li><li> Calculer le rendement de marquage par la mesure des chiffres dans des tubes W1 et W2 et dans le culot cellulaire. Pour ce faire, en plaçant chaque tubes dans une dose d&#39;isotope instrument de calibrateur de puits et l&#39;enregistrement de la radioactivité en coups par minute (CPM). Calculer l&#39;efficacité d&#39;étiquetage (radioactivité des cellules CPM) / (radioactivité des cellules + surnageant) x 100. </li><li> Remettre les cellules à fond dans le PBS résiduelle, puis ajouter le BMS sauvé de l&#39;étape 3.1. Les cellules sont prêtes pour l&#39;implantation intralésionnel. </li></ol> 4. implantation de cellules Tc-99m-HMPAO marquées <ol><li> Implantation intralésionneldans le tendon sous guidage échographique <ol><li> Introduire lentement un pouce 1,5 ou 2 (50 mm) 20 d&#39;aiguille G dans la zone de lésion maximale de la lésion dans une orientation longitudinale avec le transducteur à ultrasons, recouverte d&#39;un drap stérile, en ligne avec l&#39;aiguille de sorte que la longueur de l&#39;aiguille peut être identifiés à l&#39;échographie et la pointe si l&#39;aiguille se trouve précisément dans le centre de la lésion. </li><li> Utilisation de blindage approprié, recueillir les cellules dans une seringue de 2 ml (Luer-lock, afin de minimiser le risque de contamination externe et dans une couverture de la seringue plomb-blindé) à l&#39;aide d&#39;une aiguille 20 G. Jetez l&#39;aiguille en faisant attention de ne pas perdre de fluide. Maintenant, fixer la seringue avec les cellules marquées sur l&#39;aiguille pré-situé dans le tendon. </li><li> Placer la sonde à ultrasons sous l&#39;aiguille de sorte que le tube d&#39;aiguille dans le tissu est clairement visible. Injecter les cellules à un rythme lent mais régulier dans la lésion. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de résistance à l&#39;injection. Si cela est rencontréerepositionner soigneusement l&#39;aiguille sous guidage échographique. Vérifiez que le éjection de fluide dans la lésion est visible sur l&#39;image ultrasonore en tant que fluide anéchoïque contenant des bulles d&#39;air hyperéchogènes. </li><li> Retirer l&#39;aiguille et placer immédiatement la pression sur le trou d&#39;aiguille pour éviter la perte des cellules injectées et pour minimiser la propagation de l&#39;isotope sur la surface externe de la branche. Habiller immédiatement le membre d&#39;une couche de pansement auto-adhésif. Le cheval est maintenant prêt pour la scintigraphie gamma. Effectuez cette immédiatement. Remarque: Après l&#39;injection des cellules dans le tendon, d&#39;acquérir un nombre de la seringue vide et l&#39;aiguille pour évaluer une éventuelle perte directe de cellules qui peuvent rester dans la seringue. </li></ol></li><li> Perfusion régionale des cellules Tc-99m-HMPAO marquées <ol><li> Suivez l&#39;étape 2.4. </li><li> Appliquer un 100 mm garrot en caoutchouc bandage sur le métacarpe proximal avec deux 100 mm rouleau de coton gaze positionné dedans et en dehors. </li><li> Préparer de façon aseptique ee peau sur la veine numérique palmaire latérale au niveau de l&#39;os sésamoïde latéral proximal en frottant la surface avec une solution de lavage chirurgical de chlorhexidine pendant au moins 5 min, et enfin avec de la gaze imbibé d&#39;alcool. Effectuez toutes les étapes ultérieures de façon aseptique. </li><li> Préparer une extension de 100 mm fixé avec un 21 G x ¾ &quot;(0,8 x 19 mm) de l&#39;aiguille de papillon pour ponction veineuse en complétant avec une solution saline stérile héparine, puis d&#39;introduire l&#39;aiguille dans la veine numérique palmaire latérale. Une fois que le sang de la veine est entré remplira partiellement le kit d&#39;extension. Au connecteur luer lock attacher un loquet capuchon en caoutchouc Luer pour faciliter l&#39;injection ultérieure de cellules marquées. </li><li> Diluer les cellules souches mésenchymateuses dans 19 ml de PBS en recueillant les cellules dans une seringue de 20 ml avec du PBS préchargé. Appliquer les cellules par l&#39;intermédiaire de la coupe de caoutchouc à l&#39;aide de 18 g (1,2 x 40 mm) d&#39;aiguille hypodermique à un rythme lent mais régulier (30 - 40 sec). Rincer le cathéter avec 1 ml de PBS dans une seringue préchargéee. </li><li> Retirer l&#39;aiguille et appliquer immédiatement pression à la peau sur le trou de l&#39;aiguille d&#39;une couche de cinq 4 x 4 toiles de coton. Ensuite, placez un bandage léger avec colle élastique sur la zone de sésamoïde proximale et laisser le garrot en place pendant 30 minutes après l&#39;injection. </li><li> Relâchez le garrot après 30 min. Le cheval est maintenant prêt pour la scintigraphie gamma. Remarque: Après l&#39;injection des cellules, d&#39;acquérir un nombre de la seringue vide et l&#39;aiguille pour évaluer une éventuelle perte directe de cellules qui peuvent rester dans la seringue. </li></ol></li></ol> 5. scintigraphie gamma <ol><li> Images scintigraphiques <ol><li> Acquérir les images de scintigraphie planaire avec une caméra gamma (fixé à 140 keV pic photoélectrique utilisant une fenêtre symétrique de 20%) équipé d&#39;une faible énergie, parallèlement trou collimateur. <ol><li> Obtenir toutes les images après l&#39;heure 0 sur des chevaux sous sédation comme dans l&#39;étape 2.2 debout. Après le temps 0 scintigraphie, remplacer le bandage lumière sur le SI d&#39;implantationTE avec un bandage rembourré. Retirer ce bandage avant chaque examen de scintigraphie. </li><li> Acquérir des images statiques pendant 60 secondes chacun (256 256 par matrice) en utilisant le logiciel de traitement avec le «acquérir» - «sélection de l&#39;étude&quot; - &quot;os&quot; statiques options. Il est essentiel que le cheval ne se déplace pas au cours de la période d&#39;acquisition d&#39;image parce que l&#39;option de mode statique ne possède pas un module de correction de mouvement. </li><li> Pour l&#39;injection intralésionnelle, obtenir des images latérales de la zone de lésion de la carpe à l&#39;extrémité distale, la surface équivalente de la branche controlatérale, le champ de poumon gauche et de la gauche de la thyroïde. Lors de l&#39;acquisition des images des membres antérieurs, positionner un écran de plomb entre les jambes pour éviter l&#39;imagerie de la controlatéral du membre. Acquérir les images à 5 min après l&#39;injection (temps 0), puis à 1, 3, 6, 12, 24, 36 et 48 h. </li><li> Pour perfusion régionale, obtenir des images latérales et dorsales gamma que pour les 5.1.1.3. Obtenir des images 5 min after garrot libération. Ce sera le temps 0. Il peut être utile à l&#39;image de la branche immédiatement après l&#39;injection des cellules d&#39;évaluer les chiffres antérieurs à tourniquet de presse. Obtenir des images gamma à 1, 3, 6, 12, 24, 36 et 48 h après l&#39;administration des cellules. </li></ol></li><li> Après les images ont été acquises, traiter les images manuellement en utilisant l&#39;option &quot;traitement&quot; du logiciel avec les options choisies pour la couleur &quot;Sokoloff&quot; et la couleur &quot;Inverser&quot;. Sélectionnez ensuite la &quot;zone d&#39;intérêt&quot; (ROI) et «ellipse» car cela permet refonte du masque de sélection et de mouvement sur la zone de la lésion. Procurez-vous les chiffres plus le retour sur investissement en choisissant l&#39;option &quot;ajouter les statistiques&quot;. Veiller à ce que les régions de taille identique d&#39;intérêt (ROI) sont enregistrés pour chaque animal dans les différents points de temps. </li><li> Ensuite, corriger les chiffres correspondant à la décroissance prévue du technétium à chaque point de temps. Utilisez l&#39;équation suivante pour corriger la décroissance:A = A o e - (0.693t / T 1/2), où A o représente l&#39;activité initiale de l&#39;isotope, A est la désintégration corrigé radioactivité au temps zéro, t est le temps écoulé et T 1/2 est la demi -life de l&#39;isotope. Puis exprimer les chiffres corrigés à chaque point de temps comme un pourcentage de la ROI au temps 0 à travailler sur le pourcentage de cellules restantes, en utilisant la formule suivante: </li></ol></li></ol> % de cellules restant (t) = 100 - {[(décroissance estimée (t) - décroissance (t)) / décroissance prédit (t)]} x 100 décroissance (t) = ROI (t) / ROI (0) x 100.

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<li>de Vries, E. F., Roca, M., Jamar, F., Israel, O., Signore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+labelling+of+leucocytes+with+%2899m%29Tc-HMPAO.+Inflammation%2FInfection+Taskgroup+of+the+European+Association+of+Nuclear+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the labelling of leucocytes with (99m)Tc-HMPAO. Inflammation/Infection Taskgroup of the European Association of Nuclear Medicine.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 37, 842-848 (2010).</li>
<li>Trela, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scintigraphic+comparison+of+intra-arterial+injection+and+distal+intravenous+regional+limb+perfusion+for+administration+of+mesenchymal+stem+cells+to+the+equine+foot%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Scintigraphic comparison of intra-arterial injection and distal intravenous regional limb perfusion for administration of mesenchymal stem cells to the equine foot.</a> Equine Veterinary Journal. 46, 479-483 (2014).</li>
<li>Barbash, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+to+the+infarcted+myocardium%3A+feasibility%2C+cell+migration%2C+and+body+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution.</a> Circulation. 108, 863-868 (2003).</li>
<li>Heckl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+contrast+agents+for+molecular+imaging+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Future contrast agents for molecular imaging in stroke.</a> Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).</li>
</ol>

JD et RKS sont membres du conseil consultatif scientifique de ReCellerate Inc.

En plus de la moelle osseuse, les cellules souches isolées à partir de sources telles que le tissu adipeux sont adaptés pour le marquage avec ce protocole. En outre, les cellules de l&#39;état congelé peuvent être repris et développés en culture pour les chiffres désirés pour les études de marquage 12. Un facteur critique qui détermine l&#39;efficacité de marquage de l&#39;BMMSC est le temps entre l&#39;élution de la Tc-99m provenant du générateur de molybdène à la radiopharmacie,...

Stratégies de régénération pour la réparation des tissus malades ou endommagés sont basées sur des cellules souches multipotentes dérivées d&#39;une variété de tissus et implantés dans la zone touchée. Les récents progrès dans l&#39;application des autologue BMMSC pour le traitement de tendon et les lésions ligamentaires chez le cheval ont montré l&#39;amélioration des mesures de résultats à la fois expérimentale 1-5 et 6 études cliniques. Le cheval est un modèle particulièrement intéressant pour évaluer l&#39;efficacité des cellules souches traitements liés, car il souffre d&#39;âge et surmenage des blessures liées à des tendons de la patte antérieure distale, il est un animal athlétique, et il est un grand faciliter la récupération, de la moelle osseuse et implantation précise. Tendon blessures guérissent naturellement avec la fibrose, mais le tendon guéri est fonctionnellement inférieure 7 et présente un risque élevé d&#39;une nouvelle blessure 8. Le tendon fléchisseur superficiel du doigt (SDFT) est le plus souvent affecté tel qu&#39;il a évolué à agir comme une énergie élastiquemagasin et expériences chargement élevé souligne pour atteindre l&#39;efficacité énergétique et de la locomotion à grande vitesse. Fonction Restauration après une blessure est donc essentiel. Ces blessures sont similaires à ceux touchant le tendon d&#39;Achille chez l&#39;homme qui remplit une fonction similaire 9. Il n&#39;y a pas de bonnes options de traitement pour traiter ou atteindre bon état pour de telles blessures, les stratégies de régénération à base de cellules offrent donc une opportunité intéressante pour améliorer les résultats et de réduire une nouvelle blessure. Dans la plupart des études 5-20000000 BMMSC autologue sont injectés directement dans la lésion qui se produit habituellement dans le noyau du corps de tendon qui agit donc comme un réceptacle pour les cellules. Le sort des cellules une fois injectées ne sont pas des méthodes de marquage des cellules claires et différents pour suivre les cellules ont été récemment décrites. Les cellules marquées avec une étiquette de fluorescence ont été montrés à survivre que dans un nombre relativement faible (&lt;10%) 10,11. Des marqueurs de fluorescence nécessitentextraction de tissu et la coupe pour l&#39;analyse histologique qui prend du temps et ne facilitent aisément analyse temporelle dans un grand modèle animal ou dans des cas cliniques. Dans des travaux plus récents, nous avons utilisé le radio-isotope 99m Tc pour marquer les cellules et suivez leur sort par scintigraphie gamma 1. Cette méthode permet des comparaisons rapides à faire entre les différentes voies d&#39;administration de cellules, y compris intralésionnelle, par voie intraveineuse par la veine jugulaire 1 ou perfusion régionale via intra-artérielle ou intraveineuse 1,12 12 injections. La persistance et la distribution des cellules peuvent ensuite être visualisés par scintigraphie gamma de divers organes. Cela a démontré que seulement 24% des cellules injectées intralesionally resté dans la lésion de 24 h 1, ce qui est pris en charge par une autre étude utilisant des lésions expérimentalement créés et en utilisant le même radioactif 5. En outre, les cellules présentent une capacité limitée à l&#39;accueil dans les lésions tendineuses lors delivereD par perfusion intraveineuse, mais régional ou sont dispersés dans les poumons par les derniers itinéraires 4. BMMSC étiquetés avec nanoparticules de fer est une méthode alternative pour suivre les cellules implantées dans les tendons des membres antérieurs 13. Bien que les cellules marquées de nanoparticules de fer permettent le suivi des cellules in vivo par IRM, des études temporelles dans un animal de grande taille sont limitées par le nombre de fois où l&#39;anesthésie peuvent être administrés à chaque point de temps pour effectuer les IRM. En outre, les nanoparticules de fer sont hypo-intense sur l&#39;IRM qui limite les informations sur la migration des cellules marquées dans le corps du tendon. D&#39;autres radio-isotopes qui peuvent être utilisés comprennent l&#39;indium-111, mais ce souffre de l&#39;inconvénient d&#39;une demi-vie plus longue que Tc-99m (2,8 jours vs 6,0 h) et supérieur énergie d&#39;émission de rayons gamma. En outre, la viabilité des cellules a été rapportée pour être réduite lorsque marqué à l&#39;indium-111 14. Tc-99m, d&#39;autre part, est couramment utilisée dans les deux équine et humaine nucléairemédicament pour marquer les cellules mononucléaires de sang périphérique et de suivre leur distribution in vivo par scintigraphie. Elle peut être relativement facilement absorbé par les cellules à l&#39;aide de HMPAO comme une molécule de liaison pour lier le technétium, comme Tc-99m-HMPAO, à des cellules. Tc-99m-HMPAO étiqueté BMMSC montrer une bonne viabilité et peut proliférer in vitro 4. Ce protocole détaille l&#39;étiquetage et le suivi des BMMSC autologue équine implanté dans les lésions d&#39;origine naturelle dans le SDFT des membres antérieurs. Il est important de noter que le protocole est destiné à être utilisé seulement comme outil de recherche. Son utilisation comme une modalité thérapeutique clinique est déconseillée car l&#39;effet de la radioactivité sur le phénotype cellulaire n&#39;a pas été complètement élucidé.

<table><tbody><tr><td>Technétium99m&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Veuillez vous renseigner auprès du fournisseur local de rayonnements d’ionisation conformément aux exigences légales. L’isotope doit être utilisé dans les 2 heures suivant l’élution du générateur de molybdène-99</td></tr><tr><td>Ceretec - Hexaméthylpropylèneamine oxime (HMPAO)&nbsp ;</td><td>GE HealthCare</td><td></td><td>Veuillez vous renseigner directement auprès de GE HealthCare</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfuge, Minispin/Minispin Plus</td><td>Ependorf</td><td>22620100</td><td></td></tr><tr><td>18 G et 19 G Aiguilles</td><td>Terumo Medical</td><td>NN-1838R (18 G) ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; NN1938R (19 g)</td><td></td></tr><tr><td>Seringues 1 ml et 2 ml</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>SYR6200 (1 ml) ; SYR6003 (2 ml)</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation 1,5 ml</td><td>Greiner Bio-One Ltd</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Saline tamponnée au phosphate</td><td>LifeTechnologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Écouvillons de gaze stériles</td><td>Shermond Ltd</td><td>UNG602</td><td></td></tr><tr><td>Bandage auto-adhésif CoflexVet</td><td>Andover Healthcare, Inc.</td><td>3540RB-018</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie à ultrasons</td><td>Scion Image, Scion Corporation, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de traitement de scintigrammes MicasXplus</td><td>Bartec Technologies Ltd</td><td></td><td>http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html</td></tr><tr><td>Compteur d’isotopes de champ pour la surveillance des isotopes</td><td>John Caunt Royaume-Uni</td><td>GMS1800a</td><td>http://www.johncaunt.com/ Compteur de</td></tr> <tr><td>puits pour les mesures isotopiques, calibrateur de dose</td><td>Capintec Southern Scientific</td><td>CRC-25R</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie in vivo et le suivi de technétium 99m Étiqueté moelle osseuse cellules souches mésenchymateuses dans tendinopathie hippique

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Les récents progrès dans l&#39;application des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMMSC) pour le traitement des tendons et des ligaments blessures chez le cheval suggèrent une amélioration des mesures de résultats dans les deux études expérimentales et cliniques. Bien que le BMMSC sont implantés dans la lésion du tendon en grand nombre (généralement 10 - 20 millions de cellules), seul un nombre relativement faible de survivre (&lt;10%), bien que ceux-ci peuvent persister jusqu&#39;à 5 mois après l&#39;implantation. Cela semble être une observation commune dans d&#39;autres espèces où BMMSC ont été implantés dans d&#39;autres tissus et il est important de comprendre quand cette perte se produit, combien survivre au processus d&#39;implantation initiale et si les cellules sont effacés dans d&#39;autres organes. Le suivi le devenir des cellules peut être réalisée par marquage radioactif de la BMMSC avant l&#39;implantation qui permet non invasive de l&#39;imagerie in vivo d&#39;emplacement de cellule et quantification du nombre de cellules. Ce protocole décrit une labeli cellulaireng procédure qui utilise le technétium 99m (Tc-99m), et le suivi de ces cellules après implantation dans tendons fléchisseurs blessés chez les chevaux. Tc-99m est un (t 1/2 de 6,01 hr) isotope de courte durée qui émet des rayons gamma et peut être internalisé par les cellules en présence du composé d&#39;oxime hexamethylpropyleneamine lipophile (HMPAO). Ces propriétés, il est idéal pour une utilisation dans les cliniques de médecine nucléaire pour le diagnostic de nombreuses maladies différentes. Le sort des cellules marquées peut être suivi à court terme (jusqu&#39;à 36 h) par scintigraphie gamma de quantifier à la fois le nombre de cellules retenues dans la lésion et la distribution des cellules dans les poumons, la thyroïde et d&#39;autres organes. Cette technique est adaptée de l&#39;étiquetage des leucocytes du sang et pourrait être utilisé pour l&#39;image implanté BMMSC dans d&#39;autres organes.

Tc-99m-HMPAO incorporation dans BMMSs ne nuisent pas à leur capacité à adhérer à la culture de tissus en plastique et tandis qu&#39;ils montrent la capacité de prolifération pour former des monocouches (Figure 1), nous avons pas entièrement déterminé si les taux de prolifération ou d&#39;autres phénotypes cellulaires sont affectées. Leur morphologie est similaire à cellules non marquées avec une forme typique de la broche. L&#39;efficacité du marquage cellulaire (par exemple., L&#39;absorption ...

Ce protocole décrit le radiomarquage des cellules souches mésenchymateuses équines et leur implantation dans les lésions tendineuses chez le cheval afin de déterminer la survie cellulaire et la distribution tissulaire à l’aide de la scintigraphie gamma.

Imagerie in vivo et le suivi de technétium 99m Étiqueté moelle osseuse Cellules souches mésenchymateuses dans Tendinopathie Hippique

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

L'objectif général de ce protocole est de suivre de manière non invasive la distribution et le devenir de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse marquées après leur injection par scintigraphie gamma. Le devenir des cellules souches après injection est mal compris. Les principaux avantages de cette technique sont qu'elle permet de suivre de manière non invasive les cellules souches vers plusieurs organes après administration, et que la courte demi-vie de l'ostéo A assure son élimination dans les 48 heures.Bien que cela ait permis de mieux comprendre l'utilisation des cellules souches dans le traitement des tendinopathies spontanées, cette méthode pourrait également être utilisée pour étudier les thérapies des maladies osseuses et cardiaques. En général, les difficultés auxquelles sont confrontés les débutants dans cette méthode concernent la coordination des cellules, le choix de l'agent de marquage et la préparation du patient. Pour une application immédiate des cellules, commencez par appliquer un gel de couplage acoustique sur le membre rasé et utilisez un transducteur linéaire pour examiner systématiquement toute la région métacarpienne palmaire afin d'obtenir des séries d'images transversales et longitudinales en incidence normale, permettant d'identifier la zone lésionnelle maximale.Après l'administration de l'anesthésique local, nettoyer le site d'implantation avec une solution chirurgicale de chlorhexidine pendant au moins cinq minutes, puis essuyer avec un tampon de gaze imbibé d'éthanol. Ensuite, porter une paire de gants lorsque l'animal est préparé, puis centrifuger un aliquot de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse correspondant à une fois dix puissance sept cellules dans un millilitre de surnageant de moelle osseuse. Aspirer ensuite le surnageant à l’aide d’une seringue de deux millilitres munie d’une aiguille de 18 ou 19 gauge, en laissant environ 100 microlitres de solution dans le tube.Transférez le surnageant dans un tube de microcentrifugeuse placé sur de la glace, puis resuspendez délicatement les cellules dans les 100 microlitres résiduels de surnageant en tapotant légèrement le tube. Veillez à ce que les cellules soient complètement resuspendues et qu’il n’y ait aucun agrégat tissulaire visible. Incubez ensuite les cellules à température ambiante.Mélangez maintenant un millilitre du Protec technétium agité dans un flacon d'H-M-P-A-O. Après cinq minutes, utilisez une seringue et une aiguille d'un millilitre pour traiter les cellules souches mésenchymateuses avec l'aliquot entier de TECHNETIUM 99 M-H-M-P-A-O. Ensuite, fermez le tube, mélangez les cellules en le secouant doucement et placez le tube à température ambiante derrière un écran de plomb.Après 30 minutes, ouvrez le tube à l’aide d’une pince et utilisez une seringue graduée d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 21 pour ajouter un millilitre de PBS aux cellules. Rebouchez le tube et mélangez les cellules. Ensuite, centrifugez les cellules et utilisez la seringue de deux millilitres pour transférer soigneusement le surnageant dans un tube étiqueté « lavage 1 » présumé blindé.Ensuite, lavez le culot dans un autre millilitre de PBS comme vient de l'être démontré. Transférez le deuxième lavage dans un tube étiqueté W2 après le deuxième lavage. Resuspendez soigneusement les cellules dans le PBS résiduel et dans l'aliquote de surnageant de moelle osseuse glacé, en maintenant le transducteur parallèlement à l'aiguille.Introduisez lentement une aiguille de calibre 20 de 1,5 ou deux pouces dans la zone de lésion maximale au centre de la lésion, en orientation longitudinale. Ensuite, à l’aide du blindage approprié, aspirez les cellules dans une seringue de deux millilitres à système Luer-lock équipée d’une aiguille de calibre 20, puis jetez l’aiguille en prenant soin de ne perdre aucun liquide. Après avoir fixé la seringue à l’aiguille préalablement placée dans le tendon, positionnez la sonde échographique sous l’aiguille de manière à ce que le trajet de l’aiguille dans le tissu soit clairement visible, puis injectez les cellules à un rythme lent mais régulier dans la lésion.Une fois que toutes les cellules ont été administrées, vérifiez que le liquide éjecté dans la lésion est visible sur l'image échographique comme un liquide kystique contenant des bulles d'air hyperéchogènes, puis retirez l'aiguille. Utilisez les options de sélection d'étude et d'acquisition statique osseuse dans le logiciel de traitement pour acquérir des images fixes pendant 60 secondes chacune. Ensuite, obtenez des images latérales de la zone lésionnelle, depuis le carpe jusqu'à l'extrémité distale, de la région équivalente du membre controlatéral, du champ pulmonaire gauche et de la thyroïde gauche aux moments indiqués.Ensuite, sélectionnez la région d'intérêt et les outils d'ellipse, puis redéfinissez le masque de sélection sur la zone lésionnelle selon les besoins. Enfin, choisissez l'option d'ajout de deux statistiques pour obtenir les décomptes dans la région d'intérêt. Veillez à ce que des régions d'intérêt de taille identique soient enregistrées pour chaque animal aux différents points temporels.Après une administration intra-lésionnelle, les cellules apparaissent comme une zone localisée de signal avec une diffusion limitée des cellules vers les tissus tendineux environnants au fil du temps. En revanche, lorsque les cellules sont administrées par perfusion régionale via la veine palmaire digitale, une réduction progressive du signal est observée au site d'injection. Au fil du temps, les champs pulmonaires sont généralement négatifs après injection intra-lésionnelle, mais occasionnellement, un signal très focal qui devient plus généralisé au fil du temps peut être détecté lors des premiers temps d'observation.La thyroïde reste négative par cette voie d'administration également. La perfusion régionale montre aussi un signal focalisé dans les poumons, qui devient plus diffus au fil du temps, bien que l'intensité du signal soit nettement plus élevée par rapport à celle observée avec la voie intralésionnelle. Étant donné qu'une thyroïde présente souvent un signal focalisé, le nombre total initial d'isotopes radioactifs des cellules aux temps zéro avant l'injection, ainsi que les comptages du premier scintigramme gamma dans la région d'intérêt.Le temps zéro post-injection peut être utilisé pour calculer le pourcentage de diminution des décomptes à chaque point temporel après l'injection, afin de déterminer la décroissance prédite du TC 99 M à partir des décomptes initiaux. La persistance des cellules restantes sur le site d'injection peut alors également être calculée à chaque moment après l'injection. En suivant cette procédure, d'autres voies d'administration cellulaire peuvent être appliquées pour répondre à des questions supplémentaires concernant la capacité d'homing des cellules souches mésenchymateuses après leur développement.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la médecine régionale pour explorer des méthodes visant à améliorer la rétention cellulaire au sein des lésions tendineuses. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de marquer les cellules et d'enregistrer leur distribution et leur concentration dans différents systèmes organiques. N'oubliez pas que le travail avec des rayonnements ionisants peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l'équipement de protection individuelle, les détecteurs de rayonnement, les écrans en plomb et l'élimination appropriée des déchets contaminés sont essentielles lors de la réalisation de cette procédure.

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Imagerie in vivo et le suivi de technétium 99m Étiqueté moelle osseuse Cellules souches mésenchymateuses dans Tendinopathie Hippique (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie in vivo et le suivi de technétium 99m Étiqueté moelle osseuse Cellules souches mésenchymateuses dans Tendinopathie Hippique

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