Détection de α-synucléine maladie associée par ELISA renforcée dans le cerveau de souris transgéniques surexprimant A53T humaine mutée α-synucléine
30 mai 2015
Un ELISA offrant une nouvelle approche quantitative est décrit. Il détecte spécifiquement l'α-synucléine associée à la maladie (αSD) dans un modèle de souris transgénique (M83) de synucléinopathie en utilisant plusieurs anticorps contre la forme αS phosphorylée sur la Ser129 ou la partie C-terminale de la protéine.
L'objectif global de l'expérience suivante est de surveiller l'accumulation de l'alpha-synucléine associée à la maladie dans un modèle de souris transgénique de la maladie de Parkinson en utilisant une approche Eliza quantitative. Cela est réalisé en laissant d'abord vieillir normalement des souris non inoculées ou en inoculant des souris par voie intra-cérébrale avec un extrait de cerveau de M 83 malade. Après que les souris développent une maladie clinique et soient sacrifiées, les régions cérébrales des souris sont disséquées.
Ensuite, des homogènes sont préparés à partir de chaque région cérébrale dans un tampon à haute teneur en sel, et Eliza est réalisée sur les homogènes afin de quantifier l'alpha-synucléine associée à la maladie dans chaque région cérébrale. Les résultats Eliza montrent que la forme associée à la maladie de la protéine alpha-synucléine s'accumule principalement dans les régions cérébrales codale, y compris le mésencéphale et le tronc cérébral, ainsi que dans la moelle épinière des souris. Le principal avantage de cette technique Eliza par rapport aux méthodes précédemment disponibles telles que le sang occidental ou l'immunohistochimie, est qu'elle fournit une quantification rapide et fiable de l'alpha sclère associée à la maladie.
Dans ce modèle expérimental, Cette méthode peut aider à surveiller l'accumulation et la propagation de cette protéine dans le système nerveux central de ces trois souris MA. Cela suggère l'implication d'un mécanisme cérébral jusqu'au développement de la science clinique. Des développements ultérieurs de cette méthode pourraient être envisagés à l'avenir pour l'étude de divers échantillons biologiques tels que le liquide céphalo-rachidien ou le sang qui contiennent éventuellement des formes alpha altérées démontrant que cette procédure sera un technicien de notre laboratoire.
Toutes les procédures et protocoles impliquant des animaux étaient conformes à la directive CE 86 6 0 9 CEE, et ratifiés par comm ETH, le Comité national français. Pour la prise en compte de l'éthique et de l'expérimentation animale, les animaux étaient hébergés et pris en charge dans des installations expérimentales approuvées par A et S à Leon Young après l'euthanasie des souris et le prélèvement des cerveaux et de la moelle épinière. Selon le protocole de texte, placez un cerveau entier dans une boîte de Pétri sur de la glace sous une faible puissance de grossissement.
Commencez par séparer l'un des deux bulbes olfactifs en plaçant une pince juste derrière le bulbe. En utilisant un mouvement vers le bas, détachez-le du cerveau, puis retirez le deuxième bulbe de manière similaire. Maintenant, tout en utilisant une pince pour maintenir le cerveau en place, insérez délicatement une deuxième paire de pinces entre les cortex gauche et droit et déplacez-les vers l'avant pour dissocier les deux moitiés.
Maintenant, continuez à tenir le cerveau en place. Positionnez la deuxième pince, deux millimètres derrière le cortex, et maintenez la pression vers le haut pour soulever le cortex de l'hippocampe. Ensuite, retirez la première partie du cortex en commençant à l'hippocampe et en vous déplaçant vers l'avant du cerveau.
Répétez avec la deuxième moitié. Ensuite, positionnez les pinces ouvertes autour d'un des hippocampes. Fermez ensuite doucement les pinces au fond de l'organe et retirez-le délicatement.
Répétez avec le deuxième hippocampe. Positionnez les pinces derrière l'un des striata et séparez-le délicatement du cerveau. Utilisez les pinces pour retirer tout cortex restant du striatum avant de retirer le second satu pour séparer le cervelet du reste du cerveau avec les pinces, appuyez doucement sur le contour du cervelet.
Placez ensuite les pinces derrière le cervelet et déplacez les pinces vers l'avant pour le retirer en utilisant la large portion des pinces soulevées comme céphalon, qui est composé de quatre structures rondes pour voir clairement où il rejoint le tronc cérébral. Faites ensuite une incision verticale à la jonction avant de retirer le tronc cérébral, positionnez les pinces derrière le mésencéphale et en taille verticale pour le séparer complètement du cerveau restant. Pour préparer un homogène cérébral, ajoutez un volume adéquat de tampon HS aux régions cérébrales disséquées pour atteindre un pourcentage d'homogénéisat attendu comme indiqué dans le tableau ci-dessous.
Utilisez un broyeur de tissus composé d'un tube en verre borosilicate et de pilons de tube A et B, versez une région cérébrale à écraser dans le tube. Ensuite, avec le pilon A, homogénéisez le tissu 10 fois pour le dissocier. Passez ensuite au pilon B et homogénéisez 20 fois supplémentaires.
Avec une pipette de transfert, transférez l'homogène dans un tube de 1,5 millilitre, en répétant l'homogénéisation avec les échantillons cérébraux restants. Centrifugez les échantillons à 1000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, puis collectez le snat et divisez-les en 200 microlitres Ali Watts. Conservez à moins 80 degrés Celsius pour l'analyse Eliza ultérieure afin d'effectuer Eliza sur l'homogène cérébral.
Commencez par utiliser un tampon de carbonate de 50 micromolaires pour diluer l'anti-alpha-synucléine de revêtement, l'anticorps polyclonal de lapin ou monoclonal clone 42 à 0,01 nanogramme par millilitre avec 100 microlitres de la solution d'anticorps de revêtement, enduisez les puits d'une microplaque de 96 puits et incubez à quatre degrés Celsius toute la nuit le lendemain. Ajoutez 300 microlitres de PBST dans les puits et utilisez un laveur de plaques pour laver les plaques cinq fois tout en travaillant à température ambiante.
Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon de blocage T 20 PBS à chaque puits et agitez les plaques à 150 tr/min pendant une heure avant d'utiliser PBST pour laver les plaques cinq fois en utilisant PBST 1% BSA diluez l'homogène cérébral en suivant les directives énumérées ici et ajoutez 100 microlitres à chacun. Puits, puis incubez à température ambiante et à 150 tr/min pendant deux heures avant d'utiliser PBST pour laver les plaques. Cinq fois après le dernier lavage, ajoutez les anticorps de détection de l'alpha-synucléine nécessaires dilués dans PBS BST et 1% BSA comme indiqué dans le tableau deux du protocole de texte, incubez à température ambiante et à 150 tr/min pendant une heure avant de laver les plaques cinq fois comme précédemment.
Ensuite, ajoutez soit des conjugués HRP anti-souris ou anti-lapin IgG dilués à un pour 8 000 dans PBST 1% BSA et incubez à 150 tr/min pendant une heure avant de laver les plaques cinq fois. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution TMB dans chaque puits et incubez à 150 tr/min pendant 15 minutes dans l'obscurité. Arrêtez la réaction en ajoutant 100 microlitres d'un acide chlorhydrique normal par puits.
Ensuite, utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer l'absorbance à 450 nanomètre
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Aperçu
Cette étude présente une nouvelle méthode quantitative ELISA pour la détection de l'α-synucléine associée à la maladie dans un modèle murin transgénique de synucléinopathie. La technique permet de surveiller l'accumulation de l'α-synucléine dans différentes régions cérébrales au cours de la progression de la maladie.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biochimie
- Modèles transgéniques
Contexte
- La protéine α-synucléine est impliquée dans les synucléinopathies telles que la maladie de Parkinson.
- Les méthodes traditionnelles comme le western blot et l'immunohistochimie présentent des limites en matière de quantification.
- Le dosage immunoenzymatique (ELISA) offre une alternative rapide et fiable pour la quantification des protéines.
- Le modèle murin transgénique M83 est utilisé pour étudier la progression de la maladie.
Objectif de l'étude
- Quantifier l'accumulation de l'α-synucléine associée à la maladie dans des régions cérébrales spécifiques.
- Comparer l'efficacité de l'ELISA aux méthodes traditionnelles.
- Approfondir la compréhension de la distribution de l'α-synucléine dans les synucléinopathies.
Méthodes utilisées
- Les souris transgéniques ont été soit laissées non inoculées, soit inoculées avec des extraits cérébraux.
- Les souris ont été laissées vieillir ou développer une maladie clinique avant d'être sacrifiées.
- Des régions cérébrales ont été disséquées et homogénéisées dans un tampon à haute teneur en sel.
- Un ELISA a été réalisé pour quantifier les niveaux d'α-synucléine dans les échantillons.
Résultats principaux
- Une accumulation importante d'α-synucléine associée à la maladie a été observée dans les régions caudales du cerveau.
- Des concentrations élevées ont été détectées dans le mésencéphale, le tronc cérébral et la moelle épinière.
- L'ELISA a permis une quantification rapide et fiable par rapport aux méthodes traditionnelles.
- Les résultats soutiennent l'utilisation de l'ELISA pour l'étude de l'α-synucléine dans les synucléinopathies.
Conclusions
- La nouvelle méthode ELISA est efficace pour quantifier l'α-synucléine dans les modèles transgéniques.
- Cette approche peut faciliter des recherches supplémentaires sur les synucléinopathies.
- De futures études pourraient explorer des interventions thérapeutiques ciblant l'accumulation de l'α-synucléine.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La détection quantitative de l'α-synucléine associée aux maladies est essentielle pour réduire les risques liés à la validation des cibles dans la découverte de médicaments contre les synucléinopathies. Une approche basée sur le dosage immunoenzymatique (ELISA) permet une quantification rapide et fiable dans différentes régions cérébrales, soutenant les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin dans les programmes précliniques. Cette méthode renforce la confiance prédictive en fournissant des lectures évolutives et reproductibles pour les études mécanistiques et le suivi des interventions thérapeutiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'étudier la pathologie de l'α-synucléine comme cible thérapeutique dans les modèles de la maladie de Parkinson.
- Valeur opérationnelle : Fournit des lectures quantitatives spécifiques aux anticorps afin de clarifier l'engagement de la cible et la modulation des voies.
- Valeur prédictive : Contribue à l'atténuation des risques biologiques en corrélant l'accumulation moléculaire à la progression phénotypique de la maladie.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit une quantification normalisée et compatible avec le haut débit de l'α-synucléine associée à la maladie.
- Valeur opérationnelle : Nécessite seulement 10 μg d'équivalents cérébraux pour la détection, améliorant ainsi l'efficacité du test par rapport au Western blot.
- Valeur de reproductibilité : Présente des résultats cohérents dans différentes conditions d'inoculation et de vieillissement, permettant un suivi longitudinal fiable.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Facilite la surveillance de la propagation de type prion dans le système nerveux central, éclairant ainsi les modèles mécanistiques de la dissémination de la maladie.
- Valeur opérationnelle : Détecte l'accumulation dans les régions cérébrales caudales et la moelle épinière, en accord avec la pathologie clinique.
- Valeur translationnelle : Soutient les efforts de qualification de biomarqueurs en fournissant des signaux quantifiables de protéines liés à la maladie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode ELISA s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible jusqu'aux tests d'efficacité préclinique, permettant une évaluation itérative de composés modulant l'α-synucléine.
- Biologie de la découverte : Soutient les tests d'hypothèses sur l'agrégation de l'α-synucléine et la neurotoxicité dans des modèles transgéniques.
- Criblage : Permet de mettre en place des systèmes biologiques prêts à l'emploi avec des sorties quantitatives pour l'évaluation de bibliothèques de composés.
- Analytique : Fournit des lectures par absorbance à 450 nm, permettant des comparaisons statistiques des effets des traitements entre différentes régions cérébrales.
- Recherche translationnelle : Relie la détection moléculaire aux résultats phénotypiques, soutenant les décisions d'avancement ajustées au risque.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme standardisée de quantification de l'α-synucléine applicable à plusieurs modèles de maladies et modalités thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation de la cible grâce à une détection spécifique et quantitative de l'α-synucléine associée à la maladie.
- Valeur opérationnelle : Fournit des résultats rapides (en quelques heures) comparé à plusieurs jours pour le Western blot, accélérant ainsi les délais des projets.
- Valeur stratégique : Réduit le risque d'échec en phase avancée en permettant des décisions précoces de poursuite ou d'abandon fondées sur des mécanismes.
- Impact sur le portefeuille : Améliore l'efficacité du capital en priorisant les composés présentant une interaction mesurable avec la cible in vivo.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en optimisation du ELISA, en validation des anticorps et en homogénéisation de tissu cérébral.
- Dépend de la préparation d'un tampon à haute force ionique et de l'accès à un lecteur de microplaques pour la mesure de l'absorbance.
- Exige une standardisation entre les équipes pour un traitement des échantillons et des protocoles d'incubation cohérents.
- L'adaptation à d'autres systèmes modèles peut nécessiter la validation de la spécificité des anticorps et de l'accessibilité de l'épitope.
- Limite pratique : la détection du signal dépend d'un niveau suffisant d'accumulation de l'α-synucléine associée à la maladie, qui peut varier selon le modèle et l'âge.
