Name: Scalable plaque de 96 puits Basé iPSC Culture et production en utilisant un système robotique Liquid Handling (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Apprenez une culture iPSC scalable en plaques 96 puits utilisant un robot de pipetage liquide programmable. Cette méthode maintient la pluripotence et permet la différenciation en cardiomyocytes après plus de 20 passages.

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Ce travail a été soutenu en partie par des subventions des NIH, R44 et R01 GM087784 HL109505. Auteurs remercient l&#39;équipe technique et OEM à Gilson, INC pour le support technique étendu.

Les auteurs MKC, MJG, BEE, NJD et RO sont ou étaient à l&#39;époque des employés de développement de InvivoSciences, INC qui a conçu et développé des protocoles robotiques décrites ici. TW est le SSP pour InvivoSciences INC. SH est un employé de Gilson INC.

Dans la présente étude, nous avons développé une méthode de culture robotique pour la production iPSC que miniaturise et automatise l&#39;alimentation et le passage dans un format de plaque à 96 puits, tout en permettant une échelle efficace jusqu&#39;à. Un robot de manipulation liquide a été utilisé pour nourrir régulièrement colonies iPSC et leur passage à intervalles réguliers par dissociation enzymatique. Le robot est également programmé pour produire des plaques revêtues de gel de la matrice extracellulaire et effectuer un gradient de densité d&#39;ensemencement. Lorsque fibroblastes et adipeux dérivé iPSCs ont été cultivées dans ce système pendant plus de 20 passages, environ 3 mois, la pluripotence a été maintenue, tout comme les caryotypes stables. Les deux lignées cellulaires sont capables de différenciation en cardiomyocytes. Ensemble, la collecte des protocoles décrits ici permet aux utilisateurs avec très peu d&#39;expérience de la culture de cellules souches, ou l&#39;accès limité à l&#39;équipement de culture spécialisée, à la culture de cellules souches et d&#39;atteindre la production de cellules de haute ou de la manipulation avec un minimum de travail et le coût multi-ligne. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Les protocoles robotiques détaillées ici fournissent une méthode pour l&#39;échelle économique de la production et de la manutention iPSC. Un avantage est la culture de cellules souches évolutive dans un format basé sur plaque établie démontré ici et précédemment 44,47 - 49 pour maintenir la pluripotence. Alors que d&#39;autres formats de cellules pluripotentes de rendement de la culture de cellules souches évolutive 20,23,29 méthode basée sur cette plaque nécessite pratiquement pas de changement de format de la culture, comme l&#39;adaptation à la suspension, l&#39;utilisation de produits chimiques anti-mousse ou l&#39;utilisation prolongée de la Rho-kinase inhibiteur 20. Cette méthode de la plaque base peut donc rapidement, et de façon prévisible, accueillir de nouvelles lignes parce que les conditions de culture sont similaires. Comme l&#39;utilisation des CSPi pour la modélisation de la maladie augmente 4,6,19,50, de nouvelles lignes iPSC sont générées en continu. Les techniques décrites ici sont les mieux adaptés à la culture nouvelle lignes dans un milieu à haut volume et le débit parce que la barrière à la transition sur le format est low. Cela est également vrai pour le travail et l&#39;équipement nécessaire pour maintenir les colonies. Enfin, parce que le format et la manipulation sont similaires à l&#39;environnement utilisé pour calculer et valider les lignes iPSC, le rendement de la culture, tels que la différenciation dirigée, est susceptible d&#39;être plus prévisible. La figure 8 illustre une stratégie de mise à l&#39;échelle de la production de cellules souches dans des plaques à 96 puits. Une plaque (Cycle 0) est utilisée pour ensemencer robotisée 12 nouvelles plaques, une augmentation de 12 fois (cycle 0 à 1). Après plusieurs jours d&#39;alimentation, l&#39;un des douze plaques est à des passages pour ensemencer une autre série de douze plaques (cycle 1 au cycle 2). Les plaques onze autres sont maintenant disponibles pour d&#39;autres usages et représentent la composante de la production du système. À ce rythme, le passage d&#39;une plaque fournira 11 plaques chaque cycle, ou tous les 3-4 jours. Cette méthodologie peut être mise à l&#39;échelle plus lorsque plusieurs plaques sont soumises à des passages comme représenté sur la transition de cycle 2 au cycle 3. Au cycle 3, deux plaques sonttoujours utilisé pour maintenir la colonie et des graines 24 de nouvelles plaques. Les 22 plaques restantes sont alors disponibles pour une utilisation après chaque cycle de passage. À tout moment dans le cycle de maintenance, l&#39;utilisateur peut semer plusieurs plaques pour augmenter la production. Un exemple consisterait à chaque passage sur la colonne pour deux cycles de croissance. Le premier passage convertit une plaque en douze plaques, et chacun des douze plaques est utilisée pour ensemencer 144 plaques. Dans ce cas, un utilisateur commence par une plaque et après deux passages, ou environ 1,5-2 semaines de culture, compte 144 plaques. Par exemple, les fibroblastes et adipeux lignes iPSC rendement d&#39;environ 25 à 75.000.000 cellules par plaque de 96 puits lorsqu&#39;il est prêt au passage. 144 plaques pourraient donc représenter environ 4-7 x 10 9 cellules. Quelle est la charge de travail pour la réalisation de 144 plaques à 96 puits robotisée? L&#39;un des objectifs de ce travail était évolutive production de cellules souches qui a réduit la main-d&#39;œuvre par rapport à (plaque-à-dire, 6 puits) traditionnelle culture de cellules souches. L&#39;acc robotomplishes ce en allégeant la nécessité de manipuler physiquement chaque plaque lors de l&#39;alimentation et de passages. Bien que les échelles de production de plaques à 96 puits comme il serait linéairement dans des plaques à 6 puits traditionnels, le temps de travail d&#39;un technicien passe avec les plaques est sensiblement inférieure à l&#39;aide de la culture robotique. L&#39;efficacité de la culture de production robotisé est dérivée de cette différence (Figure 9). Il a été constaté techniciens pourraient retirer une plaque de 6 puits de l&#39;incubateur, vérifier sur le microscope, puis aspirer et nourrir la plaque dans environ 3,5 minutes. En comparaison, les techniciens passent environ 30 sec enlever une plaque de 96 puits de l&#39;incubateur et l&#39;inspection sur le microscope de la densité et de la contamination avant de le placer sur le robot. Avec un protocole élargi d&#39;alimentation similaire à celle décrite ci-dessus, six plaques à 96 puits peuvent être chargés et alimentés, ce qui prend environ 21 minutes, ou 3,5 minutes par plaque. Le temps total écoulé pour nourrir une plaque est comparable entre les robotsic et des méthodes manuelles, mais à alimentation manuelle 6 assiettes un technicien est nécessaire pour toutes les 21 min alors que le technicien ne consacre que 3 manipulation des six plaques pour le robot (une inspection de 30 secondes par assiette) min. Comme la figure 9 montre, le temps d&#39;un technicien passe manipulation 144 plaques à l&#39;aide du robot est d&#39;environ 1,2 heures par opposition à 8 h à la main et le robot ne pourra jamais faire une erreur de manipulation des plaques ou le transfert de liquides. Les 96 puits iPSC méthodes de culture décrites ici fournissent une plate-forme traitable pour les tâches de contrôle complexes. Parce que chaque puits est génétiquement identique et ensemencé à la même densité dans le même bassin initial, les variables peuvent être distribués à travers la plaque et entretenus par le robot avec des réservoirs disponibles dans le commerce pour séparer les conditions. Cela serait utile pour des expériences telles que la croissance sur les cellules souches de support 34,35,47 développement, le test de substrat ou de l&#39;état de la culture et des études de toxicité en utilisant des cellules souches51. Étant donné que chaque ligne de cellules souches est unique en termes d&#39;exigences optimales de taille de la colonie et de passage, on peut utiliser ce système pour moduler la densité ensemencement, la fréquence d&#39;alimentation et la manipulation de passage en manipulant les colonnes récoltés, l&#39;agitation mécanique pendant le passage et la fréquence d&#39;alimentation. En parcourant ces variables permettra à l&#39;utilisateur de trouver rapidement un ensemble de conditions appropriées pour la culture d&#39;une nouvelle ligne ou de développer de nouvelles techniques de culture. Le robot est aussi capable de maintenir 96 colonies de cellules souches parallèles mais indépendants. Lorsque iPSC sont dérivées de cellules somatiques ou clone après manipulation génétique, de nombreux clones sont criblés en parallèle pour donner des lignes iPSC potentiels. Une fois que des cellules individuelles sont ensemencées dans des plaques à 96 puits, ce système peut se nourrir et de passage des plaques à 96 puits en gardant chaque colonie distincts. Cela permet un débit très élevé lors de la sélection des clones potentiels et élimine la difficulté de la culture physique 96 lignes parallèles. Cette méthode aussi unP ermet à plus grande échelle la production de chaque clone sorte que le matériau est facilement disponible pour une analyse parallèle. Enfin, nous envisageons l&#39;intégration de ces techniques de culture avec un système de traite robotisé de la plaque qui délivre plaques et de l&#39;incubateur permettant la culture entièrement automatisé. Cela pourrait être accompli avec la robotique plus complexes qui permettent une plus grande expansion depuis les protocoles de base décrites ici sont transférables à d&#39;autres systèmes basés sur des plaques. Les premières étapes essentielles à aborder dans les protocoles sont ceux qui préviennent et vérifier la contamination telle que les étapes 1,5 et 4,2. Contamination, comme discuté ci-dessus, peut être évitée avec succès si bonne technique stérile et le bon sens sont utilisés. Il est impératif, indépendamment du format de la culture de cellules souches, que le contrôle de l&#39;opérateur de la contamination et de le faire dans ce protocole dans les étapes indiquées permettra de réduire considérablement le risque de contamination. L&#39;application du gel de la matrice extracellulaire adéquate est une seconde essétape tielle à la réussite globale de ce protocole. Sans bien enrober les plaques à 96 puits, les cellules souches ne se développent pas. Un problème commun est le revêtement de puits incomplètes. L&#39;expérience a montré que les bulles d&#39;air, l&#39;attraction électrostatique et capillarité entravent revêtement de complet bien. L&#39;étape de pré-mouillage (1.6) a été développé pour améliorer de manière significative revêtement de fond de puits et ne doit pas être ignorée. Cette étape de pré-mouillage semble réduire l&#39;hydrophobie apparente de la plaque de 96 puits en plastique de telle sorte que lorsque le revêtement de gel de la matrice extracellulaire est appliqué, il est réparti uniformément à travers le fond du puits et sur les côtés. Il est également recommandé de taper doucement les plaques à 96 puits contre une main propre une fois revêtu pour assurer la distribution de solution de gel de la matrice extracellulaire même. Les paramètres de dissociation sont également importantes pour optimiser. Incubation prolongée avec une enzyme ou un réactif de dissociation de l&#39;EDTA sur la base se traduira par des cellules individuelles qui peuvent ou peuvent ne pas être l&#39;objectif au cours du passage. Par conséquent, l&#39;opérateurdevraient accorder une attention particulière à la façon dont le temps de dissociation, la force de trituration, et les répétitions de lavage affectent la morphologie des colonies et de la santé et d&#39;ajuster en conséquence. Comprendre les limites des techniques décrites ici sont primordiale pour le bon fonctionnement. Comme dans n&#39;importe quel autre paramètre de culture cellulaire, l&#39;utilisation de plaques à 96 puits présente un risque de contamination relativement élevé. Comme décrit ci-dessus, un technicien est le traitement de chaque plaque lors de l&#39;alimentation et des passages; par exemple, lors de l&#39;ouverture du couvercle, en mettant la plaque sur le lit de robot, et la vérification de la plaque sur le microscope. Par conséquent, comme l&#39;a noté après l&#39;étape 1.5, il est impératif de ne pas toucher l&#39;intérieur d&#39;un couvercle de plaque ou exposer cette partie à toute surface potentiellement contaminés tels que les blocs de chauffage en pente ou des broches verticales sur le lit. Au cours de l&#39;élaboration du protocole de cette limitation a été découvert et a donné l&#39;impulsion pour développer un rack de tenir les couvercles de la plaque pour maintenir la stérilité. De même, les réservoirs de dépression, embouts de pipette et outres fournitures sur le liquide lit robot de manutention sont des sources potentielles de contamination, car ils sont ouverts à l&#39;environnement et géré par le technicien. Par conséquent, une bonne technique stérile doit être appliquée comme la réduction des mouvements sur les matières de culture exposées ou liquides ouverts. Une autre limitation est que lorsque le protocole est entartré, vérifier visuellement tous les puits de&gt; 100 plaques à 96 puits est lourd. Cela peut être traitée par une inspection visuelle de l&#39;ensemble de la plaque des signes de contamination, tels que les médias trouble, pour identifier les puits suspectes. Pour l&#39;avenir jusqu&#39;à l&#39;échelle, l&#39;utilisation d&#39;un microscope automatisé et l&#39;indicateur de la croissance cellulaire et la contamination potentielle sera incorporé. En résumé, le 96 puits plate-forme haut débit décrit ici propose une méthode reproductible, haute fidélité pour la culture et la production de cellules souches dans un format de plaque. Cette méthode réduit l&#39;expérience requise, l&#39;équipement et la main-d&#39;œuvre temps nécessaire dédiée à la culture de cellules souches touten conservant les avantages de la culture traditionnelle adhérente.

L&#39;utilisation de cellules souches pluripotentes humaines induites (CISP) a considérablement augmenté depuis leur dérivation en 2007 1 pour les essais en enclos, la médecine régénérative et de la modélisation de la maladie 2-6. Cette demande vient de la capacité de iPSC pour obtenir un grand nombre de cellules pluripotentes qui peuvent être différenciées en cellules somatiques à une quantité inégalée. Comme les techniques de différenciation dirigés améliorer 7-10 et le développement de cellules humaines ou la modélisation de thérapie tissulaire et cellulaire augmente: 11 - 14, le fait de l&#39;exigence de production de masse de CSPi de haute qualité. Il est largement cité qui, entre autres maladies, infarctus du myocarde ou remplacement fonctionnel des cellules B, il faudra des centaines de millions à des milliards de iPSC dérivée de cellules somatiques 15-18. La modélisation 3D des tissus En outre, de plus en plus complexe pour la découverte de médicaments et de therapy exigeront un grand nombre de cellules 9,13,19. Dans tous ces exemples, définis, uniforme et CSPi reproductibles doivent être disponibles et simples à produire. Afin de produire des souches biopharmaceutique et des cellules dérivées de cellules pour l&#39;ingénierie tissulaire et la transplantation, une technologie cellulaire de fabrication rentable est essentiel. La production à l&#39;échelle des CSPi a mis l&#39;accent sur ​​la culture de la suspension de 20 à 25 ou de la suspension de l&#39;utilisation de substrats microporteuses 26 - 28 en partie parce que ces techniques sont déployés avec succès à grande échelle, non-iPSC, la production à base de eucaryote. Plusieurs groupes ont mis en évidence des systèmes de culture en suspension qui produisent des cellules souches pluripotentes 20,21,23,24,29. Cependant, ces approches utilisent des systèmes complexes et coûteux ne sont pas facilement disponibles pour les chercheurs en développement de nouveaux programmes de différenciation, de conduire l&#39;ingénierie tissulaire et de faire laboratla recherche à l&#39;échelle ory. En outre, la suspension et microporteuses cultures iPSC nécessitent une adaptation et des techniques ou des produits chimiques ne figurent pas dans la culture traditionnelle adhérente iPSC telles que l&#39;utilisation continue de l&#39;inhibiteur de la Rho-kinase, les agents anti-mousse et de filtration pour réguler l&#39;agrégation. Le stress physique aux cellules est plus répandu en culture en suspension, introduit par agitation mécanique ainsi que lors de la collision microporteur. Ces problèmes limitent la prévisibilité et la vitesse à laquelle nouvellement généré lignées de cellules souches peuvent être cultivées en suspension. D&#39;autres ont développé des systèmes de manutention de plaques robotiques qui imitent plaque techniques de culture 30,31 mais ces plates-formes exiger d&#39;importants investissements pour l&#39;équipement et l&#39;expertise pour exploiter en plus des défis fondamentaux associés à la culture de cellules souches. Le travail suivant décrit le développement et la pratique d&#39;un système évolutif de la culture iPSC qui utilise un liquide robotique 8-canal standard autonomegestionnaire et des plaques à 96 puits. Cette méthode a été conçu pour combler l&#39;échelle du laboratoire iPSC culture et à haut volume de production iPSC (par exemple, 10 de 7 à 1,5 x 10 9 cellules par semaine et par technicien) permettant ceux qui développent de nouvelles technologies iPSC faire évoluer facilement jusqu&#39;à la production sans investissements importants de matériel ou de main-d&#39;œuvre. Cette méthode est relativement peu coûteux à mettre en place, nécessite peu ou pas d&#39;expérience de la culture de cellules souches, de la programmation ou de l&#39;ingénierie, a une petite empreinte équipement sans la nécessité d&#39;une hotte de culture cellulaire dédié, et utilise l&#39;équipement de culture cellulaire standard pour permettre à moyen et à haut débit automatisé la production de cellules. L&#39;objectif était de développer un système capable de la culture de cellules souches évolutive qui peut être utilisé par les laboratoires de nouvelles pour enrayer la culture de cellules, ceux qui trouvent culture manuelle un obstacle au développement de leurs idées ou de ceux qui veulent un moyen économique de produire de grandes quantités de cellules souches. La plate-forme présentée ici supprime influence technicienla culture de cellules souches et normalise les procédures d&#39;alimentation et de passage pour permettre la production de cellules souches cohérente.

<table><tbody><tr><td>plaques à 96 puits</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>96 puits ; Volume du puits : 360 &#956 ; l; Surface de croissance cellulaire : 0,32 cm2 ; Emballage individuel</td></tr><tr><td>Auge</td><td>Seahorse SeahorseBio</td><td>201308-100</td><td>Réservoir 4 Partie transparente Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td></tr><tr><td>Gilson Tips</td><td>Gilson</td><td>F167023</td><td>10 racks gilson 96 tips D200 tips</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12500062</td><td>DMEM/F12 powder.&nbsp ; Remettre en suspension dans 1 L d’eau purifiée de qualité culture cellulaire et un filtre stérile.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Appelé « gel de matrice extracellulaire » dans le texte. Matrigel GFR, 10&nbsp ; ml</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5857</td><td>mTeSR1 Kit complet pour la maintenance hES.</td></tr><tr><td>E8 Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td>TeSR-E8 Kit pour l’entretien hESC/hiPSC</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>AdooQ BioScience</td><td>A11001-50</td><td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>ACCUTASE</td><td>Appelé « réactif de dissociation protéolytique et collagénolytique » dans le texte. Accutase 500° ml solution cellulaire stérile</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>SH30256FS</td><td>PBS w/o Ca Mg 500&nbsp ; ml, 6/pqt</td></tr><tr><td>Gilson PIPETMAX</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAX</td><td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td></tr></tbody></table>

scalable plaque de 96 puits basé ipsc culture et production en utilisant un système robotique liquid handling

Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

Progression continue dans la culture de cellules souches pluripotentes est de combler l&#39;écart entre banc et chevet pour l&#39;utilisation de ces cellules en médecine régénérative, la découverte de médicaments et de tests de sécurité. Afin de produire des souches biopharmaceutique et des cellules dérivées de cellules pour l&#39;ingénierie tissulaire et la transplantation, une technologie cellulaire de fabrication rentable est essentiel. Le maintien de la pluripotence et une performance stable de cellules dans les applications en aval (par exemple, la différenciation cellulaire) dans le temps est primordial pour une production à grande échelle de la cellule. Pourtant, qui peut être difficile à atteindre, surtout si les cellules sont cultivées manuellement où l&#39;opérateur peut introduire une variabilité importante ainsi que être prohibitif à l&#39;échelle supérieure. Pour permettre à haut débit, la production de cellules souches à grande échelle et supprimer des protocoles de culture de cellules souches roman d&#39;influence de l&#39;opérateur à l&#39;aide d&#39;une paillasse multi-canal robot de manipulation de liquide ont été développés qui nécessitent une participation minimale de technicien ou d&#39;expérience. Avecces induites cellules souches pluripotentes humaines protocoles (CISP) ont été cultivées dans des conditions sans alimentation directement à partir d&#39;un stock congelé et maintenus dans des plaques à 96 puits. En fonction de la lignée cellulaire et le taux de mise à l&#39;échelle désirée, l&#39;opérateur peut facilement déterminer le moment de passage basée sur une série d&#39;images montrant les densités de colonies optimales pour le fractionnement. Ensuite, les réactifs nécessaires sont prêts à effectuer une répartition de la colonie de nouvelles plaques sans étape de centrifugation. Après 20 passages (~ 3 mois), deux lignes iPSC maintenus caryotypes stables, ont exprimé des marqueurs de cellules souches, et différenciées en cardiomyocytes avec une grande efficacité. Le système peut effectuer ultérieur criblage à haut débit de nouveaux protocoles de différenciation ou manipulation génétique conçus pour plaques à 96 puits. Cette technologie permettra de réduire la charge de travail et technique pour produire un grand nombre de cellules souches identiques pour une myriade d&#39;applications.

Les protocoles décrits permettent aux laboratoires d’effectuer une culture de cellules souches évolutives et adhérentes à haut débit avec un minimum de main-d’œuvre, d’expérience et de coût d’investissement en équipement à l’aide d’un robot de manipulation de liquides programmable et de plaques à 96 puits. Les iPSC passées plus de 20 fois sur ce système ont maintenu la pluripotence, les caryotypes normaux et se sont différenciées en cardiomyocytes.

Scalable plaque de 96 puits Basé iPSC Culture et production en utilisant un système robotique Liquid Handling

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mettre en place de manière reproductible une culture cellulaire pluripotente évolutive. Pour ce faire, on utilise d'abord un robot automatisé de manipulation de liquides préprogrammé afin de semer des cellules souches pluripotentes humaines à différentes densités. Dans une plaque de 96 puits, lors d'une deuxième étape, les puits présentant des densités de colonies optimales sont identifiés visuellement pour l'emballage.Les cellules souches pluripotentes induites sont ensuite semées dans de nouvelles plaques pour l'alimentation automatique et un emballage supplémentaire. En fin de compte, cette procédure permet de sélectionner les densités de semis optimales pour multiplier les cellules souches pluripotentes induites humaines afin de les différencier éventuellement en cardiomyocytes. Les implications de cette technique s'étendent vers le développement de thérapies personnalisées et régénératives à l'échelle intermédiaire.Le robot de culture URI puissant est adapté à la production de plusieurs centaines de millions de cellules souches URI puissantes en quelques jours, lesquelles peuvent ensuite être différenciées en divers types cellulaires pour des tests pharmaceutiques personnalisés ou des thérapies par implantation cellulaire et tissulaire. Bien que cette méthode ait déjà été appliquée au criblage des densités d'ensemencement pour une expansion optimale des cellules souches pluripotentes, elle peut également servir à optimiser et à identifier de nouveaux protocoles de différenciation pour d'autres types cellulaires. Le scientifique pharmaceuticien Neil Daily, de mon laboratoire, démontrera la procédure. Avant de commencer la procédure d'alimentation, vérifiez la plaque de 96 puits contenant les colonies de cellules souches afin de détecter toute contamination et confirmer que la densité de la colonie cellulaire est inférieure à la densité idéale pour le passage.Si les cellules sont en bon état, placer la plaque sur le plateau. Positionner trois sur la rampe inclinée à 37 degrés Celsius du robot de manipulation des liquides et charger le support de pointes sur le plateau. Positionner un avec des pointes de pipette à 200 microlitres à température ambiante.Placez une cuvette à quatre puits en position deux du plateau et remplissez le puits trois de la cuvette avec huit millilitres de milieu de croissance pour cellules souches frais à température ambiante, sans inhibiteur de la kinase RO. Ensuite, transférez la plaque de plaquettes vers le support de maintien des plaquettes et, à l’aide du pavé tactile de commande robotique, sélectionnez successivement Exécuter le protocole alimentation des colonies une plaque, puis suivant, puis appuyez sur exécution de test pour utiliser l’assistant pas à pas afin de prétester le programme sélectionné. Une fois le protocole approuvé, sélectionnez exécuter le protocole. Après l’alimentation, récupérez la plaque de 96 puits contenant les colonies de cellules souches.Ensuite, enregistrez les détails de l'alimentation sur le couvercle de la plaque et replacez-la dans l'incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures, jusqu'au prochain repiquage ou alimentation. Le choix du puits à diviser dépend de la densité des colonies. Plusieurs jours après l'établissement d'un gradient de densité d'ensemencement sur cette plaque, on observe un puits trop dense pour être divisé, une densité idéale pour le fractionnement, et un puits trop clair pour un passage après plusieurs cycles d'alimentation.Vérifiez que l'espace entre la majorité des colonies dans la plaque à 96 puits représente 25 % du diamètre de la colonie adjacente, faute de quoi un repas ultérieur entraînerait la fusion des colonies. Ensuite, si la colonie n'est pas contaminée, placez la plaque dans le lit. Positionnez-la sur la rampe à 37 degrés et chargez le support de pointes dans le lit.Positionnez un avec des embouts de pipette de 200 microlitres à température ambiante. Placez un plateau à quatre puits en position deux, puis, en laissant le puits quatre vide, distribuez 8,5 millilitres de milieu de croissance des cellules souches. Complétez avec l'inhibiteur de la kinase de la ligne Y 2 7 6 3 2 dans le puits trois, 3,5 millilitres de réactif de dissociation protéolytique et collagénolytique à 30 % dans le puits deux, et 4,5 millilitres de PBS dans le puits un.Placez ensuite une nouvelle plaque de 96 puits, préchauffée à 37 degrés Celsius et revêtue de gel de matrice extracellulaire, dans le lit, à la position cinq, puis transférez les couvercles de l'ancienne et de la nouvelle plaque dans le support de rangement des couvercles. Utilisez maintenant le pavé tactile de contrôle robotique pour sélectionner successivement l'exécution du protocole « division de colonies un sur douze, colonne un », suivi de « suivant ». Ensuite, sélectionnez « exécution de test » pour utiliser l'assistant pas à pas afin de prétester le programme sélectionné, puis « exécuter le protocole ».Lorsque le protocole de passage est terminé, récupérez les deux plaques. Étiquetez la nouvelle plaque avec les informations pertinentes et remettez les plaques dans l'incubateur. Pendant 24 heures, les cellules et les colonies doivent s'attacher à la plaque dans les deux à trois heures suivant le fractionnement, en apparaissant très étalées en raison de la présence de l'inhibiteur de la kinase RO.Après le premier repas sans inhibiteur de kinase RO, les cellules se condenseront et présenteront la morphologie caractéristique des cellules souches en forme de pavés. Des anomalies chromosomiques sont couramment observées lors de la culture de cellules souches, mais peuvent ne pas affecter la distribution des marqueurs de pluripotence comme ceux illustrés sur ces images ; en effet, l'analyse du caryotype de cellules cultivées selon le protocole vient de démontrer que les deux lignées de cellules souches pluripotentes induites passagées par robot possédaient 46 chromosomes normaux, suggérant que la méthode de culture robotisée n'a pas introduit d'instabilité chromosomique au-delà de ce qui pourrait survenir normalement. Afin d'analyser les marqueurs d'expression génique établis des cellules souches dans des lignées de cellules souches pluripotentes induites cultivées par robot, l'ARN total a également été recueilli.Les deux lign&#233;es de cellules souches pluripotentes induites utilis&#233;es dans cette exp&#233;rience ont pr&#233;sent&#233; une expression similaire des marqueurs de pluripotence, alors que les cardiomyocytes diff&#233;renci&#233;s &#224; partir de chaque lign&#233;e ne l'ont pas fait, tout comme une lign&#233;e distincte de fibroblastes dermiques humains. De plus, lorsque les deux lign&#233;es de cellules souches pluripotentes induites ont &#233;t&#233; diff&#233;renci&#233;es en cardiomyocytes, elles ont pr&#233;sent&#233; une formation nette de sarcom&#232;res. Dans leur ensemble, ces donn&#233;es sugg&#232;rent que trois mois et plus de 20 passages en culture robotis&#233;e ont abouti &#224; des cellules chromosomiquement normales pr&#233;sentant un programme de transcription compatible avec la pluripotence et capables &#233;galement de se diff&#233;rencier en cardiomyocytes.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser ce robot de manipulation de liquides ou un robot similaire pour cultiver des cellules pluripotentes de manière évolutive.

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Systèmes automatisés et protocoles pour l’établissement systématique d’un grand nombre d’écrans et des gouttelettes de cristallisation nanolitres pour expériences de diffusion de vapeur sont décrites et discutées.

Automatisée des protocoles de cristallisation macromoléculaire au laboratoire de biologie moléculaire MRC

Un protocole détaillé pour l’opération concurrente 48 parallèle des cultures de cellules dans des conditions variées dans un système de MICROBIOREACTEUR est présenté. Processus de culture cellulaire, la récolte et l’analyse subséquente anticorps titre sont décrites.

Utilisation du haut débit MICROBIOREACTEUR système automatisé pour la Production d’IgG1 de modèle dans les cellules CHO

Ce protocole sert de didacticiel complet pour le mélange standardisé et reproductible de matériaux visqueux avec une nouvelle technologie d’automatisation open source. Des instructions détaillées sont fournies sur le fonctionnement d’un poste de travail open source nouvellement développé, l’utilisation d’un concepteur de protocole open source et la validation et la vérification pour identifier les mélanges reproductibles.

Une plate-forme technologique open source pour fabriquer des modèles de culture 3D basés sur l’hydrogel de manière automatisée et standardisée

Nous montrons l’automatisation des cultures de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (HIPSC) et des différenciations neuronales compatibles avec l’imagerie et l’analyse automatisées.

Production automatisée de neurones corticals et dopaminergiques pluripotents induits par l’homme avec surveillance intégrée des cellules vivantes

Nous présentons ici un protocole pour un système automatisé de culture cellulaire. Ce système de culture automatisé réduit la main-d’œuvre et profite aux utilisateurs, y compris les chercheurs qui ne sont pas familiers avec la manipulation des cellules souches pluripotentes induites (iPS), de l’entretien des cellules iPS à la différenciation en différents types de cellules.

Système de culture automatisé pour le maintien et la différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Ce protocole documente la fabrication et l’assemblage de SPOT, une plate-forme de culture à haut débit basée sur un échafaudage, dans des formats à 96 et 384 puits. Il détaille également le processus d’ensemencement de SPOT, à la fois manuel et à l’aide d’un manipulateur de liquide disponible dans le commerce.

Fabrication reproductible de SPOT en tant que plate-forme de culture à haut débit basée sur un échafaudage

Apprenez une culture iPSC scalable en plaques 96 puits utilisant un robot de pipetage liquide programmable. Cette méthode maintient la pluripotence et permet la différenciation en cardiomyocytes après plus de 20 passages.

Scalable plaque de 96 puits Basé iPSC Culture et production en utilisant un système robotique Liquid Handling

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