Name: Utilisation du système de Teton pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Découvrez comment utiliser le système TetON pour obtenir une expression génique tissu-spécifique inducible chez le poisson zèbre adulte. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes moléculaires de la régénération de la nageoire caudale.

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Les auteurs remercient Christa Haase, Doris Weber et Brigitte Korte pour l&#39;assistance technique. Le travail dans le laboratoire Weidinger est financé par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 et par la Deutsche Gesellschaft für Kardiologie via un Oskar-Lapp-Stipendium et Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.

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<li>Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).</li>
<li>Grabher, C., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meganuclease+and+transposon+mediated+transgenesis+in+medaka%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).</li>
</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Le poisson zèbre adulte a une étonnante capacité à se régénérer avec succès de nombreux organes internes et des appendices. Une compréhension approfondie des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués requiert une analyse spécifique du tissu des fonctions des gènes et voies de signalisation. Dans ce sens, le système de Teton fournit un outil efficace pour l&#39;expression du gène spatiotemporellement contrôlée chez le poisson zèbre embryonnaire et adulte. Les constructions du système de Teton et de la méthodologie...

Le poisson zèbre est un modèle vertébré organisme bien établi pour étudier de nombreux aspects du développement, de la physiologie, de la maladie, et la régénération. Avec l&#39;adoption croissante de poisson zèbre comme un modèle pour les processus biologiques post-embryonnaires, des outils expérimentaux pour la manipulation inductible, tissu-spécifique de l&#39;expression des gènes ou des voies de signalisation sont devenus de plus en plus importante. En particulier, des études sur l&#39;orgue et la régénération appendice chez le poisson zèbre adultes ont souffert d&#39;un manque d&#39;outils pour la dissection des exigences spatio-temporelles de voies de signalisation au cours de ces processus de régénération. Actuellement, trois systèmes différents ont été utilisés pour atteindre conditionnelle, expression tissu-spécifique gène dans la régénération des organes de poisson zèbre adulte: le système Cre-lox, expression mosaïque de choc thermique transgènes inductibles utilisant transposon médiée par transgenèse somatique, et le système de Teton 1 -3. Teton se réfère à une variante d&#39;un tétracycline suiteSystème d&#39;activation de la transcription roulé, où l&#39;expression est activée en présence de l&#39;antibiotique tétracycline ou un de ses dérivés, par exemple la doxycycline. Le système Cre-lox, comme il a jusqu&#39;à présent été utilisé chez les poissons adultes, repose sur une recombinase Cre tamoxifène contrôlée (CreERT2), dont l&#39;expression est restreinte spatialement par des éléments régulateurs spécifiques d&#39;un tissu. Enlèvement mécanique de Cre une cassette d&#39;arrêt facilite l&#39;expression du gène d&#39;intérêt entraîné par un promoteur qui devraient être actifs dans tous les types cellulaires 1. création de transposon à médiation par des transgènes exprimés somatiques mosaically fournit un système pour l&#39;expression inductible du transgène dans des lignées cellulaires individuelles. L&#39;injection d&#39;embryons de poisson zèbre avec un transposon Tol2 portant un gène d&#39;intérêt sous contrôle transcriptionnel d&#39;un choc thermique résultats de promoteurs chimériques chez les individus portant généralement le transgène seulement dans les lignées de cellules discrètes d&#39;un organe 2 de régénération. Bien que les deux systèmes permettent conditionnelle tissu spel&#39;expression du gène cifique, le système Cre-lox est pas réversible, et de la stratégie en utilisant l&#39;étiquetage clonale à base de transposons souffre de sa nature stochastique. Ainsi, nous et d&#39;autres avons récemment adapté systèmes de Teton transgéniques pour une utilisation chez le poisson zèbre, qui facilitent le temps et dans l&#39;expression des gènes dans l&#39;espace contrôlé qui est en plus réglable et réversible 3-5. Le système de Teton utilisé ici comprend une ligne de pilote transgénique (TetActivator) dans lequel un doxycycline (DOX) activateur transcriptionnel inductible par (amélioré transactivateur tetracycline inverse, irtTA, court TetA) est sous le contrôle de séquences régulatrices génomiques spécifiques de tissus. Deuxièmement, il faut une ligne de répondeur transgénique (TetResponder) qui abrite un gène d&#39;intérêt sous le contrôle transcriptionnel de l&#39;opérateur de la tétracycline (élément de réponse Tet; Tetre) (figure 1A). Ainsi, l&#39;utilisation de combinaisons spécifiques de lignes TetActivator et TetResponder permet conditionnelle tissu-spécifiquemanipulation de fic de l&#39;expression génique. Nous avons récemment utilisé le système de Teton pour sonder pour des fonctions spécifiques de tissus de signalisation Wnt / beta-caténine dans l&#39;adulte régénération queue de poisson zèbre ailette 3. Dans le protocole décrit ici, nous décrivons un flux de travail pour les set-up et l&#39;utilisation du système Teton chez le poisson zèbre, en particulier pour les études de la régénération des nageoires. Cela inclut des instructions détaillées sur la façon de générer TetActivator et TetResponder lignées transgéniques stables et un protocole pour l&#39;induction du transgène dans les embryons de poisson zèbre et adulte. En outre, nous décrivons les techniques de vérification de l&#39;expression du gène tissu-spécifique dans le régénérer fin, y compris un protocole pour la préparation de cryosections d&#39;ailerons de poisson zèbre adultes. En outre, nous discutons de considérations pour la conception du transgène TetActivator, le choix d&#39;une méthode de transgénèse, et la détection de l&#39;expression TetResponder. Par conséquent, l&#39;objectif global de ce protocole est de servir de modèlepour la mise en place d&#39;un système de Teton fonctionnelle chez le poisson zèbre pour obtenir l&#39;expression du gène tissu-spécifique conditionnelle, qui peut être appliquée à tout tissu d&#39;intérêt. Nous avons créé un vecteur permettant TetActivator pour I-Scel ou génération Tol2 à médiation par des lignes de TetActivator stables utilisant des séquences régulatrices courtes (fragments génomiques d&#39;amplificateur; Weidinger base de plasmide d&#39;aucun laboratoire 1247;. La Figure 1B). Ce produit d&#39;assemblage contient une cassette constituée du TetActivator variante mutant M2 du domaine répresseur Tet inverse condensé avec le virus de l&#39;herpès simplex VP16 domaine de transactivation dérivé 3F [irtTAM2 (3F)]. L&#39;expression de la TetActivator (TETA) peut être facilement surveillée car il est co-exprimé avec l&#39;AmCyan de fluorophore dans le même cadre de lecture ouvert; un peptide p2a médiateur ribosomique à sauter, qui devrait aboutir à la production de TetA et AmCyan que les protéines séparées à un ratio de 1: 5,6 1. Le produit d&#39;assemblage contient également un poylinker 5 &#39;du TCassette etActivator pour faciliter l&#39;insertion de séquences régulatrices du génome d&#39;intérêt en utilisant des procédés de clonage classiques. En outre, nous avons créé un produit d&#39;assemblage constitué de la cassette décrite ci-dessus TetActivator plus une cassette de sélection à la kanamycine (Weidinger laboratoire base de données de plasmide non 1180;. La figure 1C), qui peut être recombiné dans un chromosome artificiel bactérien (BAC) contenant une grande région génomique ( habituellement dans le codon d&#39;initiation d&#39;un gène dont l&#39;expression motif doit être imité par le transgène). Les deux constructions sont disponibles auprès du laboratoire Weidinger sur demande.

<table><tbody><tr><td>Boîtes d’élevage</td><td>Aqua Schwarz</td><td>AquaBox 1</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence composé</td><td>, par exemple Leica, Zeiss</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Microscope confocal</td><td>par exemple Leica, Zeiss</td><td>varie selon le fabricant</td><td>pour imager des coupes de tissus fluorescents</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>par exemple Leica, Thermo-Scientific</td><td>varie avec le fabricant</td><td>pour la cryosection</td></tr><tr><td>4', 6- diamidino-2-phénylinodole (Dapi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>utiliser 1/5 000 en PBS pour la visualisation des noyaux</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>préparer des stocks en 50 % EtOH à 50 mg/ml (97 mM) pour l’induction de TetResponder</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>4 % (p/v) de paraformaldéhyde dans du PBS, pH 7,5 pour fixation</td></tr><tr><td>1x solution saline tampon phosphaté (PBS)</td><td></td><td></td><td>1,7 mM KH2PO4, 5,2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7,5</td></tr><tr><td>1x Phosphat-buffer salin + Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td>1x PBS avec 0,1 % Tween 20</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus lames de microscope à adhérence</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>1014356190</td><td>pour le prélèvement de coupes de tissus</td></tr><tr><td>Microscope stéréo-fluorescent</td>, <td>par exemple Leica, Zeiss</td>, <td>varie selon le fabricant pour le</td><td>génotypage basé sur la fluorescence</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>(par exemple, Biorad, Applied Biosystems)</td><td>varie selon le fabricant pour le</td><td>génotypage basé sur la PCR</td></tr><tr><td>Milieu de congélation des tissus (TFM)</td><td>Triangel Biomedical Sciences</td><td>TFM-C</td><td>pour l’enrobage de tissus échantillons</td></tr><tr><td>de tricaïne (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>pour l’anesthésie utilisation à 1 mg/ml dans un milieu embryonnaire E3</td></tr></tbody></table>

utilisation du système de teton pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du poisson zèbre

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Le poisson-zèbre est devenu un organisme modèle très important pour l’étude du développement des vertébrés, de la physiologie, des maladies et de la régénération des tissus. Une compréhension approfondie des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués nécessite des outils expérimentaux qui permettent une manipulation inductible et spécifique aux tissus de l’expression des gènes ou des voies de signalisation. Par conséquent, nous et d’autres avons récemment adapté le système TetON pour une utilisation chez le poisson zèbre. Le système TetON facilite l’expression des gènes contrôlée dans le temps et l’espace, et nous avons récemment utilisé cet outil pour sonder les fonctions spécifiques aux tissus de la signalisation Wnt/bêta-caténine pendant la régénération de la nageoire caudale du poisson-zèbre. Nous décrivons ici le flux de travail d’utilisation du système TetON pour obtenir une expression génique inductible et spécifique aux tissus dans la nageoire caudale du poisson-zèbre adulte en régénération. Cela comprend la génération de lignées transgéniques stables TetActivator et TetResponder, l’induction de transgènes et des techniques de vérification de l’expression génique spécifique aux tissus dans la nageoire régénérée. Ainsi, ce protocole sert de modèle pour la mise en place d’un système TetON fonctionnel chez le poisson-zèbre et son utilisation ultérieure, en particulier pour l’étude de la régénération des nageoires.

Pour établir un système de Teton fonctionnel pour l&#39;expression du gène inductible tissu-spécifique, TetActivator lignées transgéniques et TetResponder besoin d&#39;être généré (figure 1A). Ceci est réalisé par micro-injection TetActivator (figure 1B - C) ou TetResponder (figure 1E) construit en début des embryons de poisson zèbre et l&#39;intégration de la lignée germinale ultérieure. Constructions de TetActivator fonctionnels peuvent soit être géné...

Nous décrivons ici le flux de travail pour l’utilisation du système TetON afin d’obtenir une expression génique spécifique au tissu dans la nageoire caudale du poisson-zèbre adulte en régénération.

Utilisation du système de Teton pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du poisson zèbre

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

L'objectif général de cette procédure est de mettre en place un système TED fonctionnel chez le poisson zèbre afin d'obtenir une expression génique conditionnelle et spécifique à un tissu, comme illustré dans cette vidéo avec la régénération de la nageoire caudale. Cela est réalisé en premier lieu en générant des lignées transgéniques exprimant un activateur transcriptionnel induisible par la tétracycline, marqué par une protéine fluorescente amCyan, dans le tissu d'intérêt, ainsi que des lignées réceptrices contenant un gène d'intérêt portant une étiquette YPE sous le contrôle d'éléments de réponse à la tétracycline. Ensuite, des combinaisons spécifiques de poissons doublement transgéniques, porteurs à la fois de l'activateur Tet et du répondeur Tet, sont établies.Ensuite, l'expression du transgène rapporteur Tet spécifique aux tissus est induite par l'administration de doxycycline. Enfin, l'expression du transgène rapporteur Tet est vérifiée par la préparation de coupes histologiques de régénérats de nageoire. En définitive, l'immunofluorescence est utilisée pour visualiser l'expression tissulaire spécifique du transgène rapporteur Tet.L'avantage principal de cette technique par

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