Utilisation du système de Teton pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du poisson zèbre

L’objectif global de cette procédure est de mettre en place un système TED fonctionnel chez le poisson-zèbre afin d’obtenir une expression génique conditionnelle spécifique aux tissus, comme démontré dans la nageoire caudale en régénération dans cette vidéo. Ceci est accompli en générant d’abord des lignées transgéniques activatrices de Tet qui expriment un activateur transcriptionnel inductible à la tétracycline marqué avec am cyan dans le tissu d’intérêt et des lignées de réponse Tet qui contiennent un gène d’intérêt de marquage ype sous le contrôle des éléments sensibles à Tet. Ensuite, des combinaisons spécifiques de poissons transgéniques doubles répondeurs Tet sont établies.

Ensuite, l’expression du transgène du répondeur Tet spécifique au tissu est induite par l’administration de doxycycline. Enfin, l’expression du transgène répondeur Tet est vérifiée en préparant ici des coupes de tissus de nageoires régénérées. En fin de compte, l’immunofluorescence est utilisée pour visualiser l’expression du transgène du répondeur Tet spécifique au tissu.

Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes telles que l’expression génique induite par le choc thermique, est que le système permet une expression génique inductible et réversible d’une manière spécifique au tissu. Cette méthode peut aider à mieux comprendre les réseaux de signalisation moléculaire guidant la régénération des nageoires de poisson S, car elle permet d’analyser la voie de signalisation et la fonction des gènes dans les tissus individuels. Bien que nous utilisions cette technologie pour étudier la régénération des nageoires de poisson-zèbre, elle peut également être instrumentale dans de nombreux autres contextes nécessitant une manipulation spécifique des tissus de la fonction des gènes.

Après avoir généré des lignées de poissons répondeurs au Tet selon le protocole de texte, évaluez l’intégration germinale et l’inductibilité du transgène en accouplant des poissons G zéro individuels avec une lignée activatrice du Tet préalablement établie. Ensuite, récoltez les embryons et élevez-les jusqu’à un stade auquel l’induction du répondeur Tet peut être évaluée. Préparez une solution mère de 2000 x doxycycline en utilisant de l’éthanol à 50 % pour dissoudre les docks afin d’arriver à une concentration de 50 milligrammes par millilitre.

Stocker les aliquotes des quais à l’abri de la lumière à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, préparez un milieu embryonnaire E trois contenant des docks à une concentration finale de 25 microgrammes par millilitre. Ensuite, décantez la majorité du milieu E 3 des embryons.

Remplacez-le par du dos contenant E trois milieu et ramenez les embryons à 28,5 degrés Celsius pendant au moins six heures. Après l’incubation, utilisez un stéréomicroscope à fluorescence pour dépister la fluorescence Y des embryons. Établir plusieurs lignées stables de répondeurs transgéniques du Tet à partir des fondateurs que nous venons d’identifier.

Choisissez des lignes qui induisent fortement et présentent peu de mosaïcisme dans le domaine d’expression attendu ainsi que peu de variation entre les embryons individuels. Une fois que les lignées de poissons activateurs TED et Tet répondeurs ont été établies, fabriquez des porteurs activateurs Tet avec des porteurs répondeurs Tet pour générer un double transgénique. Les poissons sélectionnent les embryons porteurs du transgène activateur de Tet en dépistant la fluorescence am cyan au microscope stéréoscopique et élèvent des embryons positifs am cyan jusqu’à l’âge adulte.

Identifier les poissons adultes transgéniques doubles qui portent le répondeur Tet en plus de l’activateur Tet par génotypage basé sur la PCR ou par leur capacité à induire l’expression du répondeur Tet dans le tissu d’intérêt pour effectuer l’anesthésie de la nageoire caudale du poisson zèbre adulte dans un bécher rempli d’eau de poisson contenant 160 microgrammes par millilitre de trica. Lorsque le poisson cesse de bouger, utilisez une pince à épiler pour le transférer soigneusement sur une boîte de Pétri inversée et utilisez un scalpel pour effectuer une amputation partielle de la nageoire caudale à traiter avec des docs. Préparez des boîtes d’élevage avec un litre d’eau du système de poisson contenant 25 microgrammes par millilitre de doxycycline.

En tant que contrôle négatif, ajoutez 250 microlitres d’éthanol au lieu de doxycycline dans les boîtes d’élevage avec un litre d’eau du système de poisson, transférez jusqu’à 10 poissons transgéniques doubles dans chaque boîte d’élevage et placez les boîtes dans l’obscurité pour réduire le stress. Après un minimum de six heures, anesthésiez et transférez le poisson traité dans un plat humide enduit d’aros et utilisez une pince à épiler pour étendre la queue. Ensuite, sous un microscope à fluorescence, examinez le poisson pour détecter l’apparition de Y PET dans le tissu en régénération.

Ensuite, les poissons peuvent être utilisés pour d’autres traitements ou retourner dans le système d’hébergement des poissons pour mettre fin à l’induction du transgène répondeur après une amputation partielle de la nageoire et un traitement docs re amputer la nageoire se régénère à environ quatre à cinq segments osseux proximaux du plan d’amputation initial et à un point temporel, en fonction de votre configuration expérimentale comme décrit précédemment dans cette vidéo avec une pince à épiler et en ne manipulant que la partie du moignon du tissu, Posez soigneusement le tissu régénéré à plat dans une petite boîte de Pétri contenant 4 % de poids par volume de PFA dans PBS et fixez-le pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain. Utilisez le PBS pour laver les régénérés deux fois avant de les transférer dans 0,5 molaire E-D-T-A-P-B-S pour décalcifier la matrice osseuse à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, incubez les régénérés dans une série de PBS de saccharose à température ambiante pendant 30 minutes chacun et enfin à parts égales de 30 % de PBS de saccharose et de milieu de congélation des tissus pendant 30 minutes supplémentaires.

Transférez les nageoires dans un milieu de congélation des tissus et incubez à quatre degrés Celsius pendant au moins deux heures. Placez ensuite des moules cryogéniques sur une lame de microscope et remplissez-les de produit de congélation de tissus. Transférez les régénérés dans les moules cryogéniques et orientez le tissu pour obtenir des coupes longitudinales ou transversales.

Assurez-vous que la régénération est droite pour faciliter la section. Avec la lame de microscope, transférez les moules cryogéniques sur un support métallique positionné sur un lit de glace carbonique pour démarrer le processus de congélation. Lorsque le milieu est solide, transférez les moules cryogéniques à température ambiante pour permettre au milieu de décongeler à l’interface du milieu plastique.

Ensuite, à l’aide d’un instrument tel qu’un stylo, poussez le bloc congelé hors du moule cryogénique et stockez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit sectionné avec un cryomicrotome. Prélevez des sections de 10 à 14 micromètres sur des lames de microscope à adhérence et stockez les lames à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Pour caractériser l’expression du répondeur Tet sur les sections d’ailerons, traitez les sections avec 100 % de MEOH refroidies à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Retirez délicatement le liquide à l’aide d’une serviette en papier. Ensuite, lavez les sections deux fois avec du PBT et une fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune. Incuber les sections pendant 10 minutes dans dappy avant d’utiliser PBS pour laver deux fois pendant 10 minutes chacune.

Ensuite, utilisez l’agent de montage Antifa et une lamelle pour monter les échantillons avant d’utiliser la microscopie à fluorescence confocale ou à champ large pour imager les échantillons après avoir établi un système TET fonctionnel chez le poisson zèbre. Ce système peut être utilisé pour tester la fonction des gènes ou des voies de signalisation dans des tissus individuels. Comme le montre ici, l’activateur de tet piloté par le promoteur HER 4.3 induit l’expression du répondeur TED uniquement dans un sous-ensemble de tissus de la fluorescence YFP régénérée est détectée dans le blase proximal prolifératif tandis que le blase distal et l’épiderme sont dépourvus d’expression.

L’expression de l’antagoniste bêta-caténine WINT agit dans le domaine HER 4.3 contenant les cellules prolifératives de la blase, n’a étonnamment aucun effet sur la prolifération cellulaire régénérative. Cela suggère que le vent, la bétaïne et la signalisation dans le blastème proximal prolifératif n’ont pas de rôle essentiel dans la régulation de la prolifération des cellules ML des blastes. En revanche, l’utilisation de la lignée activatrice Tet pilotée par le promoteur de l’ubiquitine pour induire l’expression de l’axine un dans tous les tissus de la régénération de la nageoire interfère fortement avec la prolifération cellulaire régénérative.

De plus, l’expression de l’axone un dans le domaine HER 4.3, qui n’inclut pas les ostéoblastes, interfère fortement avec la formation osseuse chez les régénérés. Ainsi, l’interférence tissulaire spécifique avec la signalisation du vent à l’aide du système TE on révèle des fonctions indirectes inattendues de la signalisation éolienne dans la régulation de la prolifération cellulaire et la régénération osseuse. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour l’expression génique ciblée inductible dans n’importe quel tissu d’intérêt.

Nous avons appliqué avec succès cette méthode pour sonder les fonctions tissulaires spécifiques de la signalisation de la nicotine dans la nageoire en queue de poisson S en régénération. L’utilisation de cette méthode aidera à acquérir une compréhension plus complète des déterminants moléculaires régulant la régénération des tissus.