Utilisation du système de Teton pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du poisson zèbre

L'objectif général de cette procédure est de mettre en place un système TED fonctionnel chez le poisson zèbre afin d'obtenir une expression génique conditionnelle et spécifique à un tissu, comme illustré dans cette vidéo avec la régénération de la nageoire caudale. Cela est réalisé en premier lieu en générant des lignées transgéniques exprimant un activateur transcriptionnel induisible par la tétracycline, marqué par une protéine fluorescente amCyan, dans le tissu d'intérêt, ainsi que des lignées réceptrices contenant un gène d'intérêt portant une étiquette YPE sous le contrôle d'éléments de réponse à la tétracycline. Ensuite, des combinaisons spécifiques de poissons doublement transgéniques, porteurs à la fois de l'activateur Tet et du répondeur Tet, sont établies.

Ensuite, l'expression du transgène rapporteur Tet spécifique aux tissus est induite par l'administration de doxycycline. Enfin, l'expression du transgène rapporteur Tet est vérifiée par la préparation de coupes histologiques de régénérats de nageoire. En définitive, l'immunofluorescence est utilisée pour visualiser l'expression tissulaire spécifique du transgène rapporteur Tet.

L'avantage principal de cette technique par rapport à d'autres méthodes, telles que l'expression génique induite par choc thermique, est que le système deed on permet une expression génique induite et réversible de manière spécifique à un tissu. Cette méthode peut aider à mieux comprendre les réseaux moléculaires de signalisation qui contrôlent la régénération de la nageoire chez les poissons S, car elle permet d'analyser la voie de signalisation et la fonction des gènes dans des tissus individuels. Bien que nous utilisions cette technologie pour étudier la régénération de la nageoire chez le poisson zèbre, elle peut également s'avérer essentielle dans de nombreux autres contextes nécessitant une manipulation spécifique aux tissus de la fonction génique.

Après avoir généré des lignées de poissons répondeurs à la tétracycline selon le protocole décrit, évaluer l'intégration germinale et l'inductibilité du transgène en croisant individuellement des poissons G0 avec une lignée préétablie exprimant l'activateur Tet. Ensuite, récolter les embryons et les élever jusqu'à un stade permettant d'évaluer l'induction du répondeur Tet. Préparer une solution mère de doxycycline à 2000 x en utilisant de l'éthanol à 50 % pour dissoudre le doxycycline afin d'obtenir une concentration de 50 milligrammes par millilitre.

Conserver des aliquotes de docks protégées de la lumière à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, préparer un milieu embryonnaire E trois contenant des docks à une concentration finale de 25 microgrammes par millilitre. Puis, verser délicatement la majeure partie du milieu E trois à partir des embryons.

Remplacez-le par des flacons contenant le milieu E3 et remettez les embryons à 28,5 degrés Celsius pendant au moins six heures. Après l'incubation, utilisez un microscope stéréo fluorescent pour dépister les embryons présentant une fluorescence Y pet. Établissez plusieurs lignées transgéniques stables de répondeurs Tet à partir des fondateurs récemment identifiés.

Choisissez des lignées qui induisent fortement et présentent peu de mosaique dans le domaine d'expression attendu, ainsi que peu de variation entre les embryons individuels. Une fois les lignées de poissons porteurs de l'activateur Tet et du répondeur Tet établies, croisez les porteurs de l'activateur Tet avec les porteurs du répondeur Tet afin de générer des doubles transgéniques. Sélectionnez les embryons portant le transgène activateur Tet en recherchant la fluorescence cyan am sous un microscope stéréo, puis élevez les embryons positifs pour la fluorescence cyan am jusqu'à l'âge adulte.

Identifier les poissons adultes doublement transgéniques portant le répondeur Tet en plus de l'activateur Tet par génotypage basé sur la PCR ou par leur capacité à induire l'expression du répondeur Tet dans le tissu d'intérêt afin de réaliser une amputation de la nageoire caudale. Anesthésier les poissons zèbres adultes dans un bécher rempli d'eau pour poissons contenant 160 microgrammes par millilitre de trica. Lorsque le poisson cesse de bouger, utiliser une pince pour le transférer délicatement sur une boîte de Pétri inversée et pratiquer une amputation partielle de la nageoire caudale à l'aide d'un scalpel pour traitement avec docs. Préparer des boîtes de reproduction contenant un litre d'eau du système pour poissons avec 25 microgrammes par millilitre de doxycycline.

En tant que témoin négatif, ajoutez 250 microlitres d'éthanol au lieu de doxycycline dans des boîtes de reproduction contenant un litre d'eau de système pour poissons, transférez jusqu'à 10 poissons doublement transgéniques dans chaque boîte de reproduction et placez les boîtes à l'obscurité pour réduire le stress. Après un minimum de six heures, anesthésiez et transférez les poissons traités vers une boîte humide recouverte d'aros, puis utilisez une pince pour étaler la nageoire caudale. Ensuite, observez les poissons au microscope à fluorescence afin de détecter l'apparition de Y PET dans le tissu en cours de régénération.

Ensuite, les poissons peuvent être utilisés pour des traitements supplémentaires ou retournés dans le système d'hébergement des poissons afin de mettre fin à l'induction du transgène rapporteur après l'amputation partielle de la nageoire et le traitement par docs. Réamputer les régénérats de nageoire à environ quatre à cinq segments osseux proximaux par rapport au plan d'amputation initial et à un moment donné, selon votre dispositif expérimental, comme décrit précédemment dans cette vidéo. À l’aide de pinces et en manipulant uniquement le moignon tissulaire, déposer délicatement les régénérats tissulaires à plat dans une petite boîte de Pétri contenant 4 % poids par volume de PFA dans du PBS, puis fixer toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, rincer les régénérats deux fois au PBS avant de les transférer dans du PBS contenant 0,5 molaire d’E-D-T-A-P-B-S afin de décalcifier la matrice osseuse à quatre degrés Celsius pendant toute la nuit. Incuber ensuite les régénérats dans une série de solutions de saccharose en PBS, à température ambiante, pendant 30 minutes chacune, puis finalement dans un mélange équivalent de saccharose 30 % en PBS et de milieu de congélation tissulaire pendant 30 minutes supplémentaires.

Transférez les nageoires dans du milieu de congélation tissulaire et incubez-les à quatre degrés Celsius pendant au moins deux heures. Ensuite, placez les moules cryogéniques sur une lame de microscope et remplissez-les de milieu de congélation tissulaire. Transférez les régénérats dans les moules cryogéniques et orientez le tissu de manière à obtenir des sections longitudinales ou transversales.

Veillez à ce que le régénérat soit bien droit pour faciliter la coupe en sections. Placez conjointement la lame de microscope et les moules à cryo-inclusion sur une grille métallique positionnée sur un lit de glace sèche afin d'initier le processus de congélation. Lorsque le milieu est solidifié, transférez les moules à cryo-inclusion à nouveau à température ambiante pour permettre au milieu de dégeler au niveau de l'interface entre le plastique et le milieu.

Ensuite, à l’aide d’un instrument tel qu’un stylet, faire sortir le bloc congelé du moule cryogénique et le conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’à sa sectionnement au microtome cryogénique. Réaliser des sections de 10 à 14 micromètres sur des lames de microscope adhésives et conserver les lames à moins 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour caractériser l’expression du répondeur Tet sur des sections de nageoire, traiter les sections avec du MEOH à 100 % refroidi à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Retirer soigneusement le liquide à l’aide d’un papier absorbant. Laver ensuite les sections deux fois avec du PBT et une fois avec du PBS pendant cinq minutes chacun. Incuber les sections pendant 10 minutes dans du dappy, puis les laver deux fois avec du PBS pendant 10 minutes chacun.

Ensuite, utilisez un milieu de montage Antifa et une lame couvre-objet pour monter les échantillons avant d'utiliser une microscopie à fluorescence confocale ou en champ large afin d'observer les échantillons, après avoir établi un système TET fonctionnel chez le poisson zèbre. Ce système peut être utilisé pour tester la fonction d'un gène ou d'une voie de signalisation dans des tissus individuels. Comme illustré ici, l'activateur tet sous contrôle du promoteur HER 4.3 induit l'expression du répondeur TED uniquement dans un sous-ensemble de tissus : la fluorescence YFP est détectée dans la blastula proximale proliférative, tandis que la blastula distale et l'épiderme sont dépourvus d'expression.

L'expression de l'antagoniste WINT de la bêta-caténine agissant dans l'un des domaines HER 4.3 contenant les cellules prolifératives de la blaste n'a, de façon surprenante, aucun effet sur la prolifération cellulaire régénérative. Cela suggère que la signalisation de la wind bétaïne dans la blastème proximale proliférative n'a aucun rôle essentiel dans la régulation de la prolifération des cellules ML blastiques. En revanche, l'utilisation d'une lignée exprimant l'activateur Tet sous le contrôle du promoteur d'ubiquitine pour induire l'expression d'axin 1 dans tous les tissus du régénérateur de nageoire perturbe fortement la prolifération cellulaire régénérative.

En outre, l'expression de l'axone un dans le domaine HER 4.3, qui n'inclut pas les ostéoblastes, interfère fortement avec la formation osseuse dans le tissu régénéré. Ainsi, l'interférence tissu-spécifique avec la signalisation wind à l'aide du système TE on révèle des fonctions indirectes inattendues de la signalisation wind dans la régulation de la prolifération cellulaire et de la régénération osseuse. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour une expression génique ciblée et inductible dans tout tissu d'intérêt.

Nous avons appliqué avec succès cette méthode pour étudier les fonctions spécifiques aux tissus du signalisation de la nicotine dans la nageoire caudale régénérante du poisson S. L'utilisation de cette méthode permettra d'acquérir une compréhension plus complète des déterminants moléculaires régulant la régénération tissulaire.