Name: Utilisation du système de Teton pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Découvrez comment utiliser le système TetON pour obtenir une expression génique tissu-spécifique inducible chez le poisson zèbre adulte. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes moléculaires de la régénération de la nageoire caudale.

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Les auteurs remercient Christa Haase, Doris Weber et Brigitte Korte pour l&#39;assistance technique. Le travail dans le laboratoire Weidinger est financé par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 et par la Deutsche Gesellschaft für Kardiologie via un Oskar-Lapp-Stipendium et Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.

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</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Le poisson zèbre adulte a une étonnante capacité à se régénérer avec succès de nombreux organes internes et des appendices. Une compréhension approfondie des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués requiert une analyse spécifique du tissu des fonctions des gènes et voies de signalisation. Dans ce sens, le système de Teton fournit un outil efficace pour l&#39;expression du gène spatiotemporellement contrôlée chez le poisson zèbre embryonnaire et adulte. Les constructions du système de Teton et de la méthodologie...

Le poisson zèbre est un modèle vertébré organisme bien établi pour étudier de nombreux aspects du développement, de la physiologie, de la maladie, et la régénération. Avec l&#39;adoption croissante de poisson zèbre comme un modèle pour les processus biologiques post-embryonnaires, des outils expérimentaux pour la manipulation inductible, tissu-spécifique de l&#39;expression des gènes ou des voies de signalisation sont devenus de plus en plus importante. En particulier, des études sur l&#39;orgue et la régénération appendice chez le poisson zèbre adultes ont souffert d&#39;un manque d&#39;outils pour la dissection des exigences spatio-temporelles de voies de signalisation au cours de ces processus de régénération. Actuellement, trois systèmes différents ont été utilisés pour atteindre conditionnelle, expression tissu-spécifique gène dans la régénération des organes de poisson zèbre adulte: le système Cre-lox, expression mosaïque de choc thermique transgènes inductibles utilisant transposon médiée par transgenèse somatique, et le système de Teton 1 -3. Teton se réfère à une variante d&#39;un tétracycline suiteSystème d&#39;activation de la transcription roulé, où l&#39;expression est activée en présence de l&#39;antibiotique tétracycline ou un de ses dérivés, par exemple la doxycycline. Le système Cre-lox, comme il a jusqu&#39;à présent été utilisé chez les poissons adultes, repose sur une recombinase Cre tamoxifène contrôlée (CreERT2), dont l&#39;expression est restreinte spatialement par des éléments régulateurs spécifiques d&#39;un tissu. Enlèvement mécanique de Cre une cassette d&#39;arrêt facilite l&#39;expression du gène d&#39;intérêt entraîné par un promoteur qui devraient être actifs dans tous les types cellulaires 1. création de transposon à médiation par des transgènes exprimés somatiques mosaically fournit un système pour l&#39;expression inductible du transgène dans des lignées cellulaires individuelles. L&#39;injection d&#39;embryons de poisson zèbre avec un transposon Tol2 portant un gène d&#39;intérêt sous contrôle transcriptionnel d&#39;un choc thermique résultats de promoteurs chimériques chez les individus portant généralement le transgène seulement dans les lignées de cellules discrètes d&#39;un organe 2 de régénération. Bien que les deux systèmes permettent conditionnelle tissu spel&#39;expression du gène cifique, le système Cre-lox est pas réversible, et de la stratégie en utilisant l&#39;étiquetage clonale à base de transposons souffre de sa nature stochastique. Ainsi, nous et d&#39;autres avons récemment adapté systèmes de Teton transgéniques pour une utilisation chez le poisson zèbre, qui facilitent le temps et dans l&#39;expression des gènes dans l&#39;espace contrôlé qui est en plus réglable et réversible 3-5. Le système de Teton utilisé ici comprend une ligne de pilote transgénique (TetActivator) dans lequel un doxycycline (DOX) activateur transcriptionnel inductible par (amélioré transactivateur tetracycline inverse, irtTA, court TetA) est sous le contrôle de séquences régulatrices génomiques spécifiques de tissus. Deuxièmement, il faut une ligne de répondeur transgénique (TetResponder) qui abrite un gène d&#39;intérêt sous le contrôle transcriptionnel de l&#39;opérateur de la tétracycline (élément de réponse Tet; Tetre) (figure 1A). Ainsi, l&#39;utilisation de combinaisons spécifiques de lignes TetActivator et TetResponder permet conditionnelle tissu-spécifiquemanipulation de fic de l&#39;expression génique. Nous avons récemment utilisé le système de Teton pour sonder pour des fonctions spécifiques de tissus de signalisation Wnt / beta-caténine dans l&#39;adulte régénération queue de poisson zèbre ailette 3. Dans le protocole décrit ici, nous décrivons un flux de travail pour les set-up et l&#39;utilisation du système Teton chez le poisson zèbre, en particulier pour les études de la régénération des nageoires. Cela inclut des instructions détaillées sur la façon de générer TetActivator et TetResponder lignées transgéniques stables et un protocole pour l&#39;induction du transgène dans les embryons de poisson zèbre et adulte. En outre, nous décrivons les techniques de vérification de l&#39;expression du gène tissu-spécifique dans le régénérer fin, y compris un protocole pour la préparation de cryosections d&#39;ailerons de poisson zèbre adultes. En outre, nous discutons de considérations pour la conception du transgène TetActivator, le choix d&#39;une méthode de transgénèse, et la détection de l&#39;expression TetResponder. Par conséquent, l&#39;objectif global de ce protocole est de servir de modèlepour la mise en place d&#39;un système de Teton fonctionnelle chez le poisson zèbre pour obtenir l&#39;expression du gène tissu-spécifique conditionnelle, qui peut être appliquée à tout tissu d&#39;intérêt. Nous avons créé un vecteur permettant TetActivator pour I-Scel ou génération Tol2 à médiation par des lignes de TetActivator stables utilisant des séquences régulatrices courtes (fragments génomiques d&#39;amplificateur; Weidinger base de plasmide d&#39;aucun laboratoire 1247;. La Figure 1B). Ce produit d&#39;assemblage contient une cassette constituée du TetActivator variante mutant M2 du domaine répresseur Tet inverse condensé avec le virus de l&#39;herpès simplex VP16 domaine de transactivation dérivé 3F [irtTAM2 (3F)]. L&#39;expression de la TetActivator (TETA) peut être facilement surveillée car il est co-exprimé avec l&#39;AmCyan de fluorophore dans le même cadre de lecture ouvert; un peptide p2a médiateur ribosomique à sauter, qui devrait aboutir à la production de TetA et AmCyan que les protéines séparées à un ratio de 1: 5,6 1. Le produit d&#39;assemblage contient également un poylinker 5 &#39;du TCassette etActivator pour faciliter l&#39;insertion de séquences régulatrices du génome d&#39;intérêt en utilisant des procédés de clonage classiques. En outre, nous avons créé un produit d&#39;assemblage constitué de la cassette décrite ci-dessus TetActivator plus une cassette de sélection à la kanamycine (Weidinger laboratoire base de données de plasmide non 1180;. La figure 1C), qui peut être recombiné dans un chromosome artificiel bactérien (BAC) contenant une grande région génomique ( habituellement dans le codon d&#39;initiation d&#39;un gène dont l&#39;expression motif doit être imité par le transgène). Les deux constructions sont disponibles auprès du laboratoire Weidinger sur demande.

<table><tbody><tr><td>Boîtes d’élevage</td><td>Aqua Schwarz</td><td>AquaBox 1</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence composé</td><td>, par exemple Leica, Zeiss</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Microscope confocal</td><td>par exemple Leica, Zeiss</td><td>varie selon le fabricant</td><td>pour imager des coupes de tissus fluorescents</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>par exemple Leica, Thermo-Scientific</td><td>varie avec le fabricant</td><td>pour la cryosection</td></tr><tr><td>4', 6- diamidino-2-phénylinodole (Dapi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>utiliser 1/5 000 en PBS pour la visualisation des noyaux</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>préparer des stocks en 50 % EtOH à 50 mg/ml (97 mM) pour l’induction de TetResponder</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>4 % (p/v) de paraformaldéhyde dans du PBS, pH 7,5 pour fixation</td></tr><tr><td>1x solution saline tampon phosphaté (PBS)</td><td></td><td></td><td>1,7 mM KH2PO4, 5,2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7,5</td></tr><tr><td>1x Phosphat-buffer salin + Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td>1x PBS avec 0,1 % Tween 20</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus lames de microscope à adhérence</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>1014356190</td><td>pour le prélèvement de coupes de tissus</td></tr><tr><td>Microscope stéréo-fluorescent</td>, <td>par exemple Leica, Zeiss</td>, <td>varie selon le fabricant pour le</td><td>génotypage basé sur la fluorescence</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>(par exemple, Biorad, Applied Biosystems)</td><td>varie selon le fabricant pour le</td><td>génotypage basé sur la PCR</td></tr><tr><td>Milieu de congélation des tissus (TFM)</td><td>Triangel Biomedical Sciences</td><td>TFM-C</td><td>pour l’enrobage de tissus échantillons</td></tr><tr><td>de tricaïne (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>pour l’anesthésie utilisation à 1 mg/ml dans un milieu embryonnaire E3</td></tr></tbody></table>

utilisation du système de teton pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du poisson zèbre

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Le poisson-zèbre est devenu un organisme modèle très important pour l’étude du développement des vertébrés, de la physiologie, des maladies et de la régénération des tissus. Une compréhension approfondie des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués nécessite des outils expérimentaux qui permettent une manipulation inductible et spécifique aux tissus de l’expression des gènes ou des voies de signalisation. Par conséquent, nous et d’autres avons récemment adapté le système TetON pour une utilisation chez le poisson zèbre. Le système TetON facilite l’expression des gènes contrôlée dans le temps et l’espace, et nous avons récemment utilisé cet outil pour sonder les fonctions spécifiques aux tissus de la signalisation Wnt/bêta-caténine pendant la régénération de la nageoire caudale du poisson-zèbre. Nous décrivons ici le flux de travail d’utilisation du système TetON pour obtenir une expression génique inductible et spécifique aux tissus dans la nageoire caudale du poisson-zèbre adulte en régénération. Cela comprend la génération de lignées transgéniques stables TetActivator et TetResponder, l’induction de transgènes et des techniques de vérification de l’expression génique spécifique aux tissus dans la nageoire régénérée. Ainsi, ce protocole sert de modèle pour la mise en place d’un système TetON fonctionnel chez le poisson-zèbre et son utilisation ultérieure, en particulier pour l’étude de la régénération des nageoires.

Pour établir un système de Teton fonctionnel pour l&#39;expression du gène inductible tissu-spécifique, TetActivator lignées transgéniques et TetResponder besoin d&#39;être généré (figure 1A). Ceci est réalisé par micro-injection TetActivator (figure 1B - C) ou TetResponder (figure 1E) construit en début des embryons de poisson zèbre et l&#39;intégration de la lignée germinale ultérieure. Constructions de TetActivator fonctionnels peuvent soit être géné...

Nous décrivons ici le flux de travail pour l’utilisation du système TetON afin d’obtenir une expression génique spécifique au tissu dans la nageoire caudale du poisson-zèbre adulte en régénération.

Utilisation du système de Teton pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du poisson zèbre

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

L'objectif général de cette procédure est de mettre en place un système TED fonctionnel chez le poisson zèbre afin d'obtenir une expression génique conditionnelle et spécifique à un tissu, comme illustré dans cette vidéo avec la régénération de la nageoire caudale. Cela est réalisé en premier lieu en générant des lignées transgéniques exprimant un activateur transcriptionnel induisible par la tétracycline, marqué par une protéine fluorescente amCyan, dans le tissu d'intérêt, ainsi que des lignées réceptrices contenant un gène d'intérêt portant une étiquette YPE sous le contrôle d'éléments de réponse à la tétracycline. Ensuite, des combinaisons spécifiques de poissons doublement transgéniques, porteurs à la fois de l'activateur Tet et du répondeur Tet, sont établies.Ensuite, l'expression du transgène rapporteur Tet spécifique aux tissus est induite par l'administration de doxycycline. Enfin, l'expression du transgène rapporteur Tet est vérifiée par la préparation de coupes histologiques de régénérats de nageoire. En définitive, l'immunofluorescence est utilisée pour visualiser l'expression tissulaire spécifique du transgène rapporteur Tet.L'avantage principal de cette technique par rapport à d'autres méthodes, telles que l'expression génique induite par choc thermique, est que le système deed on permet une expression génique induite et réversible de manière spécifique à un tissu. Cette méthode peut aider à mieux comprendre les réseaux moléculaires de signalisation qui contrôlent la régénération de la nageoire chez les poissons S, car elle permet d'analyser la voie de signalisation et la fonction des gènes dans des tissus individuels. Bien que nous utilisions cette technologie pour étudier la régénération de la nageoire chez le poisson zèbre, elle peut également s'avérer essentielle dans de nombreux autres contextes nécessitant une manipulation spécifique aux tissus de la fonction génique.Après avoir généré des lignées de poissons répondeurs à la tétracycline selon le protocole décrit, évaluer l'intégration germinale et l'inductibilité du transgène en croisant individuellement des poissons G0 avec une lignée préétablie exprimant l'activateur Tet. Ensuite, récolter les embryons et les élever jusqu'à un stade permettant d'évaluer l'induction du répondeur Tet. Préparer une solution mère de doxycycline à 2000 x en utilisant de l'éthanol à 50 % pour dissoudre le doxycycline afin d'obtenir une concentration de 50 milligrammes par millilitre.Conserver des aliquotes de docks protégées de la lumière à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, préparer un milieu embryonnaire E trois contenant des docks à une concentration finale de 25 microgrammes par millilitre. Puis, verser délicatement la majeure partie du milieu E trois à partir des embryons.Remplacez-le par des flacons contenant le milieu E3 et remettez les embryons à 28,5 degrés Celsius pendant au moins six heures. Après l'incubation, utilisez un microscope stéréo fluorescent pour dépister les embryons présentant une fluorescence Y pet. Établissez plusieurs lignées transgéniques stables de répondeurs Tet à partir des fondateurs récemment identifiés.Choisissez des lignées qui induisent fortement et présentent peu de mosaique dans le domaine d'expression attendu, ainsi que peu de variation entre les embryons individuels. Une fois les lignées de poissons porteurs de l'activateur Tet et du répondeur Tet établies, croisez les porteurs de l'activateur Tet avec les porteurs du répondeur Tet afin de générer des doubles transgéniques. Sélectionnez les embryons portant le transgène activateur Tet en recherchant la fluorescence cyan am sous un microscope stéréo, puis élevez les embryons positifs pour la fluorescence cyan am jusqu'à l'âge adulte.Identifier les poissons adultes doublement transgéniques portant le répondeur Tet en plus de l'activateur Tet par génotypage basé sur la PCR ou par leur capacité à induire l'expression du répondeur Tet dans le tissu d'intérêt afin de réaliser une amputation de la nageoire caudale. Anesthésier les poissons zèbres adultes dans un bécher rempli d'eau pour poissons contenant 160 microgrammes par millilitre de trica. Lorsque le poisson cesse de bouger, utiliser une pince pour le transférer délicatement sur une boîte de Pétri inversée et pratiquer une amputation partielle de la nageoire caudale à l'aide d'un scalpel pour traitement avec docs. Préparer des boîtes de reproduction contenant un litre d'eau du système pour poissons avec 25 microgrammes par millilitre de doxycycline.En tant que témoin négatif, ajoutez 250 microlitres d'éthanol au lieu de doxycycline dans des boîtes de reproduction contenant un litre d'eau de système pour poissons, transférez jusqu'à 10 poissons doublement transgéniques dans chaque boîte de reproduction et placez les boîtes à l'obscurité pour réduire le stress. Après un minimum de six heures, anesthésiez et transférez les poissons traités vers une boîte humide recouverte d'aros, puis utilisez une pince pour étaler la nageoire caudale. Ensuite, observez les poissons au microscope à fluorescence afin de détecter l'apparition de Y PET dans le tissu en cours de régénération.Ensuite, les poissons peuvent être utilisés pour des traitements supplémentaires ou retournés dans le système d'hébergement des poissons afin de mettre fin à l'induction du transgène rapporteur après l'amputation partielle de la nageoire et le traitement par docs. Réamputer les régénérats de nageoire à environ quatre à cinq segments osseux proximaux par rapport au plan d'amputation initial et à un moment donné, selon votre dispositif expérimental, comme décrit précédemment dans cette vidéo. À l’aide de pinces et en manipulant uniquement le moignon tissulaire, déposer délicatement les régénérats tissulaires à plat dans une petite boîte de Pétri contenant 4 % poids par volume de PFA dans du PBS, puis fixer toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, rincer les régénérats deux fois au PBS avant de les transférer dans du PBS contenant 0,5 molaire d’E-D-T-A-P-B-S afin de décalcifier la matrice osseuse à quatre degrés Celsius pendant toute la nuit. Incuber ensuite les régénérats dans une série de solutions de saccharose en PBS, à température ambiante, pendant 30 minutes chacune, puis finalement dans un mélange équivalent de saccharose 30 % en PBS et de milieu de congélation tissulaire pendant 30 minutes supplémentaires.Transférez les nageoires dans du milieu de congélation tissulaire et incubez-les à quatre degrés Celsius pendant au moins deux heures. Ensuite, placez les moules cryogéniques sur une lame de microscope et remplissez-les de milieu de congélation tissulaire. Transférez les régénérats dans les moules cryogéniques et orientez le tissu de manière à obtenir des sections longitudinales ou transversales.Veillez à ce que le régénérat soit bien droit pour faciliter la coupe en sections. Placez conjointement la lame de microscope et les moules à cryo-inclusion sur une grille métallique positionnée sur un lit de glace sèche afin d'initier le processus de congélation. Lorsque le milieu est solidifié, transférez les moules à cryo-inclusion à nouveau à température ambiante pour permettre au milieu de dégeler au niveau de l'interface entre le plastique et le milieu.Ensuite, à l’aide d’un instrument tel qu’un stylet, faire sortir le bloc congelé du moule cryogénique et le conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’à sa sectionnement au microtome cryogénique. Réaliser des sections de 10 à 14 micromètres sur des lames de microscope adhésives et conserver les lames à moins 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour caractériser l’expression du répondeur Tet sur des sections de nageoire, traiter les sections avec du MEOH à 100 % refroidi à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes.Retirer soigneusement le liquide à l’aide d’un papier absorbant. Laver ensuite les sections deux fois avec du PBT et une fois avec du PBS pendant cinq minutes chacun. Incuber les sections pendant 10 minutes dans du dappy, puis les laver deux fois avec du PBS pendant 10 minutes chacun.Ensuite, utilisez un milieu de montage Antifa et une lame couvre-objet pour monter les échantillons avant d'utiliser une microscopie à fluorescence confocale ou en champ large afin d'observer les échantillons, après avoir établi un système TET fonctionnel chez le poisson zèbre. Ce système peut être utilisé pour tester la fonction d'un gène ou d'une voie de signalisation dans des tissus individuels. Comme illustré ici, l'activateur tet sous contrôle du promoteur HER 4.3 induit l'expression du répondeur TED uniquement dans un sous-ensemble de tissus : la fluorescence YFP est détectée dans la blastula proximale proliférative, tandis que la blastula distale et l'épiderme sont dépourvus d'expression.L'expression de l'antagoniste WINT de la bêta-caténine agissant dans l'un des domaines HER 4.3 contenant les cellules prolifératives de la blaste n'a, de façon surprenante, aucun effet sur la prolifération cellulaire régénérative. Cela suggère que la signalisation de la wind bétaïne dans la blastème proximale proliférative n'a aucun rôle essentiel dans la régulation de la prolifération des cellules ML blastiques. En revanche, l'utilisation d'une lignée exprimant l'activateur Tet sous le contrôle du promoteur d'ubiquitine pour induire l'expression d'axin 1 dans tous les tissus du régénérateur de nageoire perturbe fortement la prolifération cellulaire régénérative.En outre, l'expression de l'axone un dans le domaine HER 4.3, qui n'inclut pas les ostéoblastes, interfère fortement avec la formation osseuse dans le tissu régénéré. Ainsi, l'interférence tissu-spécifique avec la signalisation wind à l'aide du système TE on révèle des fonctions indirectes inattendues de la signalisation wind dans la régulation de la prolifération cellulaire et de la régénération osseuse. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour une expression génique ciblée et inductible dans tout tissu d'intérêt.Nous avons appliqué avec succès cette méthode pour étudier les fonctions spécifiques aux tissus du signalisation de la nicotine dans la nageoire caudale régénérante du poisson S. L'utilisation de cette méthode permettra d'acquérir une compréhension plus complète des déterminants moléculaires régulant la régénération tissulaire.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous décrivons une méthode pour conditionnellement knockdown l'expression d'une protéine cible lors de la régénération du poisson zèbre nageoire adulte. Cette technique consiste à micro-injection et électroporation morpholinos oligonucléotide antisens dans le tissu fin, ce qui permet de tester le rôle de la protéine à différents stades de la régénération des nageoires, y compris la cicatrisation des plaies, de la formation blastème, et l'excroissance de régénération.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la régénération des adultes Zebrafish Tail Fin

La méthode présentée ici comprend la blessure précise des embryons de poisson zèbre en direct avec des impulsions laser de haute énergie et l'analyse subséquente de ces blessures et leur récupération avec le temps. Nous montrons aussi comment génétiquement étiquetés simple ou groupes de cellules musculaires squelettiques peuvent être suivis pendant et après la lumière laser dommages induits.

Laser-infligé des blessures de poisson zèbre muscle squelettique embryonnaire

Après sectionnement de la moelle, le poisson zèbre adulte a la récupération fonctionnelle de six semaines après la lésion. Pour profiter de la transparence des larves et une récupération plus rapide, nous présentons une méthode pour sectionnant la moelle épinière larvaire. Après résection, nous observons la récupération sensorielle à partir de 2 jours après la lésion, et le mouvement C-coude de 3 jours après la lésion.

Spinal Cord Transection dans le poisson zèbre larvaire

Un procédé de génétique inverse adapté pour un poisson zèbre pour déterminer la fonction des gènes au cours des stades ultérieurs de développement et de l'homéostasie physiologique tel que la régénération des tissus en utilisant des injections intraventriculaires de morpholinos spécifiques d'un gène.

Inverser approche Morpholino génétique utilisant cardiaque ventriculaire injection à Transfecter tissus difficiles à cibles multiples dans le poisson zèbre Larve

Pour faire la lumière sur les mécanismes cellulaires et moléculaires de la neurogenèse et de la régénération du poisson zèbre adulte, nous avons développé un protocole de chirurgie invasive provoquant des lésions mécaniques chez le télencéphale adulte du poisson zèbre et le suivi ultérieur des changements dans l’hémisphère poignardé par immunohistochimie ou hybridation in situ.

Stab blessures plaies du poisson zèbre adulte Télencéphale: Une méthode pour étudier le cerveau des vertébrés neurogenèse et régénération

Nous présentons ici une méthode fiable pour étudier la régénération rénale adulte en induisant une lésion rénale aiguë par injection de gentamicine. Nous montrons que les dommages dépendent de la dose de gentamicine et de la température ambiante en utilisant l’hybridation in situ pour marquer lhx1a+ en développant de nouveaux néphrons.

Régénération rénale à l&#39;âge adulte poisson zèbre par gentamicine blessures induites

Nous présentons un protocole pour capturer la dynamique de la régénération de la nageoire caudale des larves de poisson-zèbre à l’échelle de l’ensemble du tissu à l’aide de la stéréomicroscopie basée sur le fond clair. Cette technique permet de capturer la dynamique de régénération avec une résolution de cellule unique. Cette méthodologie peut être adaptée à tout stéréomicroscope équipé d’une caméra CCD et d’un logiciel de time-lapse.

Capture réparation des tissus chez le poisson zèbre larves avec Time-lapse Brightfield stéréomicroscopie

La régénération des muscles squelettiques est entraînée par les cellules souches musculaires résidentes des tissus, qui sont altérées dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Ici, nous décrivons un protocole qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire.

Examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson-zèbre de maladie musculaire

Un modèle de lésion cérébrale mécanique chez le poisson-zèbre adulte est décrit pour étudier les mécanismes moléculaires régulant leur capacité de régénération élevée. La méthode explique de créer une blessure par arme blanche dans le tectum optique de plusieurs espèces de petits poissons afin d’évaluer les réponses régénératives à l’aide d’immunomarquage fluorescent.

Modèle de blessure par arme blanche du tectum optique adulte à l’aide de poisson-zèbre et de Medaka pour l’analyse comparative de la capacité de régénération

Le présent protocole décrit une méthode pour induire des lésions tissulaires spécifiques et hautement reproductibles chez les larves de poisson zèbre à l’aide d’un système de lésion laser combiné à une plate-forme microfluidique automatisée pour la manipulation des larves.

Lésions semi-automatisées contrôlées induites par laser pour étudier la régénération de la moelle épinière chez les larves de poisson zèbre

Nous présentons ici un protocole de transplantation de cellules à haute résolution spatiale et temporelle chez des embryons et des larves de poisson-zèbre à n’importe quel stade entre au moins 1 et 7 jours après la fécondation.

Transplantation cellulaire à haute résolution chez le poisson-zèbre embryonnaire et larvaire

Découvrez comment utiliser le système TetON pour obtenir une expression génique tissu-spécifique inducible chez le poisson zèbre adulte. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes moléculaires de la régénération de la nageoire caudale.

Utilisation du système de Teton pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du poisson zèbre

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