Le séquençage de prochaine génération pour la détection des Actionable mutations dans les tumeurs solides et liquides

L’objectif global de ce test Amplicon ciblé de séquençage de nouvelle génération est de détecter les mutations pathogènes dans les tumeurs des patients à des fins thérapeutiques, y compris le diagnostic, le pronostic et la réponse à la thérapie ciblée. Cette méthode répond à des questions clés, telles que celle de savoir si un patient présente une mutation dans un gène qui peut bénéficier d’une thérapie ciblée ou alternative. Le principal avantage de cette technique est que des mutations exploitables, à la fois courantes et rares, sur de nombreux gènes peuvent être détectées dans n’importe quel tissu tumoral à l’aide d’un seul test.

Parce que les techniques et la technologie sont si complexes et que les étapes sont si difficiles à apprendre, il est essentiel de démontrer visuellement cette méthode. Il s’agit d’un moment décisif dans l’avancement de l’oncologie médicale. Avec l’adoption du séquençage de nouvelle génération en clinique, nous aurons plus de traitements anticancéreux de meilleure qualité pour nos patients.

Nos technologues CPD, Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy et Joe Grubb, feront la démonstration de cette procédure. Je vais également aider dans ce processus pour montrer les parties les plus complexes du test. Après avoir extrait l’ADN génomique selon le protocole textuel, en suivant le protocole du fabricant, exécutez deux microlitres de l’ADN extrait sur un fluorimètre pour obtenir la concentration de travail de l’échantillon.

Pour créer une bibliothèque d’amplicons, dans une plaque semi-jupe de 96 puits appelée Hyb Plate, ajoutez le volume nécessaire de TE à faible EDTA, cinq mircolitres de l’Oligo Tube du panneau, ajoutez 100 à 250 nanogrammes d’ADN génomique à chaque puits correspondant. C’est l’étape la plus vitale, car toute confusion ici aura de graves conséquences. Après l’ajout de l’oligohybridation pour le réactif de séquençage 1, et en filant selon le protocole de texte, incubez la Hyb Plate dans l’incubateur d’hybridation préchauffé à 95 degrés Celsius pendant une minute.

Après avoir refroidi lentement l’incubateur à 40 degrés Celsius, retirez la plaque de l’incubateur et transférez tout le volume de chaque échantillon de la plaque Hyb au centre de l’unité de plaque filtrante prélavée correspondante préalablement préparée, ou FPU. Couvrez le FPU et centrifugez-le à 2, 250 fois G et 20 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, ajoutez 45 microlitres de SW1 et centrifugez à nouveau.

Après un deuxième lavage avec SW1 et un lavage avec UB1, ajoutez 45 microlitres de Extension Ligation Mix 3 dans chaque puits d’échantillon, et versez-le de haut en bas trois fois pour mélanger. Utilisez du papier d’aluminium adhésif pour sceller la plaque et incubez l’ensemble de l’ensemble FPU dans un incubateur préchauffé à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Pour indexer l’amplification PCR, disposez les amorces dans la plaque d’amplification d’index, ou appareil IAP, et aliquotez les indices utilisés dans les puits correspondants de la plaque, puis ajoutez 22 microlitres du PCR Master Mix, 2E12, et faites-le monter et descendre trois fois.

Ensuite, après avoir réduit la réaction de ligature d’extension de 45 minutes conformément au protocole de texte, ajoutez 25 microlitres d’hydroxyde de sodium de 50 millimolaires à chaque puits d’échantillon du FPU, et faites-le monter et descendre au moins six fois, en vous assurant que la pointe de la pipette entre en contact avec la membrane. Ensuite, avec la plaque légèrement inclinée et une pipette multicanaux réglée à 20 microlitres, pipetez l’hydroxyde de sodium dans la plaque FPU de haut en bas au moins six fois. Transférez l’élution du FPU vers la colonne correspondante de l’IAP.

Pipetez doucement de haut en bas pour bien combiner l’ADN avec le Master Mix PCR avant d’exécuter le programme PCR décrit dans le protocole texte. Après avoir vérifié le rendement de la bibliothèque et incubé les échantillons avec des billes de purification magnétique conformément au protocole de texte, ajoutez 30 microlitres d’EBT dans chaque puits de billes lavées. Pipetez de haut en bas plusieurs fois pour vous assurer que les billes se détachent du côté du tube.

Une fois que la plaque a été incubée avec puis sans secouer, placez la plaque sur le support magnétique et transférez 20 microlitres du surnageant sur une toute nouvelle plaque appelée plaque de normalisation de la bibliothèque, ou LNP. Après la préparation du mélange de normalisation, avec inversion intermittente et vortex de la solution, ajouter 45 microlitres à chaque échantillon de LNP. Ensuite, utilisez un film adhésif transparent pour sceller la plaque et secouez à 1 800 tr/min pendant 30 minutes.

Après avoir lavé les billes, retirez le LNP du support magnétique et, pour éluer l’échantillon, ajoutez 30 microlitres d’hydroxyde de sodium frais 0,1 normal dans chaque puits. Ensuite, secouez la TNL à 1 800 RMP pendant cinq minutes. Replacez le LNP sur le support magnétique et, une fois que le surnageant s’est effacé, transférez 30 microlitres de l’élution dans le tampon de stockage de normalisation de bibliothèque 1 préalablement préparé dans la plaque de stockage.

Pliez la plaque, puis ajoutez cinq microlitres de chaque échantillon à séquencer dans un tube de 1,5 millilitre étiqueté Pooled Amplicon Library, ou PAL. Selon la chimie de séquençage utilisée, ajoutez quatre à 10 microlitres du PAL à 590 à 596 microlitres de tampon HT1. Nettoyez et chargez la cellule d’écoulement.

Chargez les réactifs. De plus, suivez les invites à l’écran pour démarrer l’exécution du séquençage. Une fois l’exécution du séquençage terminée, exécutez le pipeline Bioinfomatics.

Analysez les statistiques d’exécution pour vous assurer que la bibliothèque séquencée a réussi les mesures de contrôle qualité déterminées par le laboratoire. Enfin, dans un visualiseur de données génomiques, examinez manuellement chaque variante en affichant les fichiers BAM. Il s’agit d’un résumé des statistiques d’exécution les plus importantes, sans compter la couverture moyenne, utilisées pour déterminer si un échantillon de préparation de banque a réussi QC.As comme on le voit ici pour le premier cas, la bioinformatique a détecté quatre mutations associées à la LAM à déclaration obligatoire.

Une mustation faux-sens dans FLT3, une mutation faux-sens dans IDH2 et une mutation par décalage de cadre de lecture dans NPM1. Des mutations de FLT3 sont observées chez environ 25 % des patients adultes atteints de LAM. La signification pronostique des mutations ponctuelles du domaine kinase FLT3, telle qu’observée chez ce patient atteint de LAM, a un impact incertain sur le pronostic.

L’isocitrate déshydrogénase 2, ou IDH2, code pour un modificateur épigénétique qui est généralement muté dans la LAM. Les mutations du gène de la nucléophosmine, ou NPM1, sont l’une des mutations les plus fréquemment acquises dans la LAM. Ce tableau répertorie toutes les variantes exoniques du deuxième cas.

Deux mutations associées à la maladie ont été détectées. Une insertion dans le cadre dans l’exon 20 d’ERBB2 et une mutation faux-sens dans TP53. HER2/neu, ou ERBB2, code pour un récepteur de tyrosine kinase.

Des insertions activatrices de l’exon 20 HER2/neu sont observées dans deux à 4 % des adénocarcinomes pulmonaires et représentent la majorité des mutations HER2/neu observées dans le cancer du poumon. Les modifications de TP53 sont également fréquentes dans le cancer. Il est nécessaire de porter une attention particulière à la qualité et à la quantité d’ADN extrait.

Ceci est particulièrement important pour les échantillons FFPE. Nous essayons souvent fortement dégradé avec une variable le rendement de l’ADN. Au cours du processus de validation de l’essai clinique, des paramètres de qualité et de quantité d’ADN doivent être établis pour chaque échantillon avant de faire passer l’ADN à la préparation de la banque.

En plus de la préparation de la bibliothèque, il est essentiel de valider un plan d’espionnage bioinfomatique, en déterminant les valeurs limites pour le séquençage, les statistiques de contrôle de la qualité, les statistiques de préparation de la bibliothèque, la profondeur de courage d’un amplicon et la fréquence minimale des allèles à signaler. Une fois maîtrisée, la préparation de la bibliothèque peut être effectuée en une journée de travail. Cependant, le flux de travail global des tests nécessite plus de temps pour l’extraction de l’ADN, le séquençage, le traitement des données et l’examen des variants.

Cette procédure est conçue pour examiner uniquement les mutations de l’ADN génomique dans certains points chauds clés. D’autres masses qui utilisent l’ARN peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles qu’une expression différentielle des gènes, associer les tumeurs à risque et les réarrangements structurels. Des avancées majeures se profilent à l’horizon.

L’adoption de l’automatisation et l’incorporation d’un code-barres moléculaire unique permettront aux laboratoires de réduire les délais d’exécution, d’utiliser moins d’échantillons et de détecter les variants à une très faible fréquence d’allèles. La détection de mutations associées à la maladie dans les échantillons de cancer est la norme depuis des décennies. Le NGS est une approche moins biaisée du séquençage de plusieurs gènes associés à de nombreux cancers en parallèle, conduisant à l’identification de multiples mutations et à de meilleurs traitements pour les patients.

Merci d’avoir regardé, et bonne chance dans vos expériences.