Name: Application de la tache verte de méthyle DNA-spécifique dans le Marquage fluorescent dembryons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Découvrez le marquage nucléaire par le vert de méthyle pour la microscopie confocale d'embryons entiers. Cette méthode simple et économique permet une imagerie profonde grâce à l'émission dans le rouge lointain et à la résistance au photoblanchiment.

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Les auteurs tiennent à remercier Patxi Jaso pour la production de la vidéo, PEDECIBA et l’Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII) pour le financement partiel.

1. La purification du colorant <ol><li> Préparer une solution aqueuse à 4% de vert de méthyle par dissolution de 0,4 g de poudre de colorant dans 10 ml d&#39;eau distillée. Mélanger soigneusement jusqu&#39;à obtention d&#39;dissoudre. </li><li> Sous un hottes, mélanger avec au moins 2 parties de chloroforme. Il est important de vérifier au préalable si les tubes sont résistants chloroforme. </li><li> Mélanger soigneusement et centrifuger pendant 1 min à 2000 xg pour accélérer la séparation de phase. </li><li> Après centrifugation, une phase supérieure aqueuse avec du vert de méthyle et une phase organique inférieure avec du chloroforme et du cristal violet de contaminant sont obtenus d&#39;habitude. </li><li> Récupérer la phase supérieure et répétez cette étape jusqu&#39;à la phase inférieure apparaît totalement dépourvu de cristal violet. </li><li> A la fin, la phase supérieure est récupérée et diluée dans de l&#39;eau à une concentration finale de 2% de vert de méthyle. Cette solution stock est stable sur le plan de travail pour les mois et n&#39;a pas besoin d&#39;être protégé de la lumière. </li></ol><ol><li> Fixer les embryons pendant une nuit à 4% de formaldehyde (à partir de paraformaldehyde) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). NOTE: Cela peut prendre de quelques heures à la nuit en fonction de l&#39;épaisseur des embryons. Dans l&#39;exemple, nous avons fixé 48 h après la fécondation (HPF) embryons de poisson zèbre nuit. </li><li> Laver les embryons trois fois dans du PBS-T (1% de Triton X-100 dans du PBS) pendant 5 min. La concentration élevée de détergent perméabilise la cuticule. </li><li> Préparer une solution à 1: 10.000 de vert de méthyle (à partir de 2% de solution de stock) dans du PBS-T: 5,000-1. La présence d&#39;un détergent au cours de l&#39;incubation est utile pour les échantillons épais, tels que des embryons de poisson zèbre et les larves. </li><li> Incuber les embryons dans la solution pendant au moins 6 heures à 4 ° C, avec des doux balancement. Encore une fois, l&#39;épaisseur de l&#39;embryon est le paramètre d&#39;étalonnage de la longueur de l&#39;incubation. </li><li> Laver les embryons 3 times avec du PBS pendant 30 min pour éliminer l&#39;excès de détergent. Méthyl fluorescence verte est seulement évidente quand il est lié à l&#39;ADN, donc fond à partir de la molécule non liée est négligeable. </li><li> Monter sur une lame de fouilles ou d&#39;une chambre maison avec une solution de montage (75% de glycérol, 0,1 M Tris.HCl pH 8). NOTE: Si la coloration nucléaire doit être effectué après immunomarquage, vert de méthyle peut être incorporé à la solution de montage à la concentration de travail, sans avoir besoin de le laver. </li><li> Conserver au réfrigérateur ou démarrer imagerie immédiatement. Effectuer imagerie avec un confocal à balayage laser (ou autre fluorescence) microscope avec une excitation à 633 nm et de filtres d&#39;émission fixés à inscrire à 650-750 nm en tenant compte que le méthyl émission verte atteint son maximum à 677 nm. NOTE: Nous fournissons les données mesurées du profil de méthyle d&#39;émission verte, à être chargées dans le logiciel d&#39;acquisition, comme matériel supplémentaire. </li></ol> 3. Fluorescent nucléaire StAining plénier embryons de poulet en utilisant vert de méthyle <ol><li> Incuber les œufs de poule fécondés au stade de l&#39;intérêt. Fixer les embryons nuit à 4% de formaldéhyde (de paraformaldéhyde) dans du PBS à 4 ° C. Laver les embryons trois fois dans du PBS-T pendant 2 heures. </li><li> Préparer une solution à 1: 10.000 de vert de méthyle (à partir de 2% de solution de stock) dans du PBS-T: 5,000-1. Incuber les embryons dans la solution de coloration nuit à 4 ° C. Laver les embryons 3 fois en PBS, 1 heure chacun. Mont dans la chambre avec 75% de glycerol, 0,1 M de Tris, pH 8. </li></ol> 4. imagerie marqué par fluorescence des noyaux dans des embryons entiers monté <ol><li> Préparer une chambre d&#39;imagerie par collage de plusieurs couches de ruban isolant sur une lame de microscope et soigneusement découper un trou dans le avec un scalpel pour placer les embryons à l&#39;intérieur. Cela permettra d&#39;éviter des embryons de l&#39;écrasement lors de l&#39;imagerie. </li><li> Soigneusement transférer les embryons à la chambre de l&#39;imagerie et de remplir la chambre vers le haut avec 75% de glycérol, 0,1 M de Tris-HCl, pH = 8 à unvide la formation de bulles. </li><li> Couvrir avec un # 0 lamelle en évitant ou en éliminant débordement moyenne. Sceller avec du vernis à ongles. </li><li> Acquérir des images de l&#39;échantillon sur un microscope à fluorescence équipé d&#39;un filtre 633 ou la ligne d&#39;excitation au laser. REMARQUE: les filtres d&#39;émission devraient couvrir le maximum 677 d&#39;émission de vert de méthyle. </li></ol>

<ol><li>Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+imaging+in+three+dimensions%3A+a+unique+tool+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research.</a> Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).</li>
<li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAPI%3A+a+DNA-specific+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic%22%5BJournal%5D)">DAPI: a DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).</li>
<li>Latt, S. A., Stetten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+studies+on+33258+Hoechst+and+related+bisbenzimidazole+dyes+useful+for+fluorescent+detection+of+deoxyribonucleic+acid+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry. 24 (1), 24-33 (1976).</li>
<li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TO-PRO-3+iodide%3A+a+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li>
<li>Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemistry+on+Xenopus+embryos+using+far-red+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes.</a> Trends in genetics. 11 (1), 9(1995).</li>
<li>Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+low+cost%2C+and+highly+efficient+fluorescent+DNA+labeling+method+using+methyl+green%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green.</a> Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).</li>
<li>Kim, S. K., Nordén, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl+green.+A+DNA+major-groove+binding+drug%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Methyl green. A DNA major-groove binding drug.</a> FEBS letters. 315 (1), 61-64 (1993).</li>
<li>Nordén, B., Tjerneld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+methyl+green+to+deoxyribonucleic+acid+analyzed+by+linear+dichroism%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism.</a> Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).</li>
<li>Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+methyl+green-pyronin+Y+procedures+using+pure+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes.</a> The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).</li>
<li>Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+comprehensive+cell+lineage+reconstructions+in+complex+organisms+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy.</a> Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).</li>
<li>Lenz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+measurement+in+thick+tissue+layers+by+linear+or+nonlinear+long-wavelength+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Applied%22%5BJournal%5D)">Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation.</a> Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le développement progressif des techniques de microscopie au cours des dernières décennies, avec un accent particulier sur les variations de la microscopie fluorescente, a conduit à la possibilité d’explorer la dynamique et la structure d’échantillons de tissus intacts, y compris des embryons entiers10,11. Cependant, l’une des principales limitations a été la disponibilité de fluorophores de bonne qualité qui peuvent être utilisés pour colorer directement et rapidement les structures subcellulaires. 
<p cl...

La coloration fluorescente de l’ADN est largement et couramment utilisée à la fois dans la recherche biologique et dans le diagnostic clinique, soit pour l’étude détaillée de la structure nucléaire et chromosomique, soit pour la contre-coloration des tissus et des cellules, soit pour l’étude des paramètres du cycle cellulaire1. Bien que plusieurs colorants d’ADN soient disponibles, les plus largement utilisés ont été ceux excités par la lumière UV et émettant en bleu, qui s’intègrent dans les systèmes à trois filtres habituels utilisés dans la plupart des microscopes à épifluorescence conventionnels lorsqu’ils sont combinés avec des fluorophores émettant du vert et du rouge orangé, tels que des protéines fluorescentes ou de petites molécules attachées aux anticorps. Parmi ces colorants d’ADN émettant du bleu, les plus courants sont le DAPI et les agents de liaison de sillon mineurs de Hoechst2,3. Néanmoins, l’incorporation d’une grande variété de raies d’émission laser et la détection spectrale dans les microscopes à balayage laser ont permis aux chercheurs de choisir l’utilisation de colorants nucléaires émettant du rouge lointain tels que l’iodure de propidium (PI) ou TO-PRO 34. L’un des avantages de ces colorants est qu’ils surmontent le problème de l’autofluorescence présent dans de nombreuses cellules et tissus, en particulier dans les embryons5, mais beaucoup d’entre eux ont des problèmes différents tels que des profils d’émission larges ou une grande sensibilité au photoblanchiment6.
Le chercheur suisse Friedrich Miescher a découvert l’ADN en 1869, en l’extrayant des noyaux de globules blancs présents dans le pus. Il l’a appelé nucléine et a montré quelques années plus tard qu’il formait des précipités avec la coloration relativement nouvelle vert de méthyle. Le vert de méthyle est composé de trois cycles d’aniline, avec différents degrés de méthylation, et possède deux charges positives qui lui permettent de se lier fortement au sillon majeur de l’ADN7,8. La coloration de l’ADN par le vert de méthyle s’est avérée très tôt spécifique, ce qui a conduit à la mise au point par Unna et Pappenheim d’une coloration combinée avec de la pyronine, qui marque spécifiquement l’ARN. Depuis lors, le vert-pyronine de méthyle a été largement utilisé dans les techniques histologiques de routine9.
Jusqu’à récemment, on savait très peu de choses sur les propriétés fluorescentes du vert de méthyle. Cependant, nos travaux antérieurs ont révélé certains des avantages spectraux du vert de méthyle6, tels que son excitation à 633 nm, un décalage de Stokes pratique, son émission sur la partie proche infrarouge du spectre électromagnétique, une photostabilité supérieure à celle des colorants d’ADN disponibles dans le commerce avec des propriétés spectrales similaires et à un coût très faible. C’est pourquoi nous avons décidé de le tester pour être utilisé comme marqueur fluorescent spécifique de très haute affinité et pour l’ADN sur les tissus embryonnaires et dans les embryons entiers. De plus, jusqu’à présent, la coloration nucléaire au vert de méthyle était réalisée à faible pH, ce qui la rendait difficile à combiner avec la coloration par anticorps. L’objectif de la méthode détaillée ici est de disposer d’un protocole de coloration fluorescente de l’ADN nucléaire qui surmonte l’inconvénient susmentionné en effectuant la procédure de coloration à pH physiologique, ce qui en fait une contre-coloration appropriée pour l’immunomarquage sur des coupes et des tissus entiers.

<table><tbody><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Vert de méthyle</td><td>Dr. G. Gr&uuml ; bler</td><td></td><td>a également testé Sigma-Aldrich 323829, qui est sans violet de cristal</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie confocale à balayage laser Leica TCS-SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin&ndash ; Isothiocyanate de tétraméthylrhodamine B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td> P1951&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>chloroforme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372978</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5810 R</td><td>eppendorf</td><td>5811 000.010&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>lames de microscope</td><td>Deltalab</td><td>D100004</td><td></td></tr><tr><td>lamelles Esco</td><td>optics</td><td>R525025</td><td></td></tr></tbody></table>

application de la tache verte de méthyle dna-spécifique dans le marquage fluorescent d&#39;embryons

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

< classe p = 'jove_content'> Le vert de méthyle est connu depuis longtemps comme une coloration histologique avec une affinité spécifique pour l’ADN, bien que ses propriétés fluorescentes soient restées inexplorées jusqu’à récemment. Dans cet article, nous illustrons la méthode de préparation d’une solution mère aqueuse de vert de méthyle qui, une fois diluée, peut être utilisée comme un marqueur nucléaire fluorescent très pratique pour les cellules et les tissus fixés. Des procédures simples pour étiqueter des embryons entiers de poisson-zèbre et de poussin sont détaillées, et des exemples d’images obtenues sont présentés. Le vert de méthyle est excité au maximum par la lumière rouge, à 633 nm, et émet avec un spectre relativement net qui culmine à 677 nm. Il est très peu coûteux, non toxique, très stable en solution et très résistant au photoblanchiment lorsqu’il est lié à l’ADN. Son émission rouge permet une imagerie confocale à balayage haute résolution inaltérée des noyaux dans des échantillons épais. Enfin, ce protocole de coloration au vert de méthyle est compatible avec d’autres procédures de coloration cellulaire, telles que le marquage d’anticorps ou le marquage des filaments d’actine avec de la phalloïdine conjuguée aux fluorophores.

Coloration nucléaire des échantillons épais. Le protocole décrit ici permet la réalisation de coloration homogène de structures profondes dans des embryons entiers. Lentilles développement former des noyaux 48 hpf embryons de poisson zèbre sont étiquetés de façon homogène (figure 1). Vert de méthyle coloration de l&#39;ADN permet la discrimination des différences morphologiques dépendants du cycle cellulaire tels que l&#39;identification des figures de mitose ou noyaux apopt...

Une méthode de coloration fluorescente de matériel biologique fixé avec le marquage spécifique de l’ADN vert de méthyle est décrite. Le vert de méthyle est utilisé dans une solution aqueuse diluée et est très résistant au photoblanchiment. Son émission rouge lointain permet d’imager des échantillons en profondeur, ce qui la rend particulièrement adaptée aux embryons entiers.

Application de la tache verte de méthyle DNA-spécifique dans le Marquage fluorescent d&#39;embryons

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

Dans cette vidéo, nous montrerons comment la coloration histologique très courante au vert méthyle peut être utilisée comme marqueur nucléaire extrêmement pratique en microscopie fluorescente, notamment en microscopie confocale à laser sur des échantillons biologiques épais tels que des embryons entiers. Après une brève présentation du vert méthyle comme colorant spécifique de l'ADN, nous décrirons la méthode de préparation des solutions mères et des solutions de travail pour la coloration fluorescente. Nous présenterons ensuite le protocole expérimental permettant d'obtenir une coloration nucléaire, en conservant plusieurs embryons de poisson, ainsi que des exemples d'images confocales obtenues.Enfin, les excellentes propriétés physico-chimiques du vert de méthyle seront démontrées et discutées. Freddy Misha a découvert l'ADN en 1869 et a montré quelques années plus tard qu'il formait des précipités avec une teinture relativement nouvelle, l'annal, et le vert de méthyle. Le vert de méthyle possède deux charges positives qui lui permettent d'interagir fortement avec l'ADN au niveau de son groupe majeur, en se liant préférentiellement aux régions riches en AT.L'utilisation la plus étendue du vert de méthyle a été sa combinaison, dans une solution nasale, avec la coloration d'ARN nommée périmine, un colorant méthylé mis au point par UNA et Poppen Heim au début du XXe siècle. Très peu d'analyses ont toutefois été menées sur les propriétés fluorescentes du vert de méthyle, c'est pourquoi nous avons décidé d'évaluer la possibilité de l'utiliser comme marqueur fluorescent présentant une affinité et une spécificité très élevées pour l'ADN dans les cellules.Le vert de méthyle est une substance colorante dérivée du méthane possédant sept groupes méthyles. Ce septième groupe peut facilement se détacher, ce qui le fait revenir au violet de gentiane. Pour cette raison, une certaine quantité de violet de gentiane est mélangée au vert de méthyle afin d'éliminer les cristaux.La solution de vert méthyl violet peut être lavée au chloroforme pour extraire le violet de cristal. Comme nous le montrerons immédiatement à cette fin, nous préparons une solution d'ACU à 4 % sous une hotte. Nous la mélangeons avec au moins deux parties de chloroforme et centrifugeons pour accélérer la séparation des phases.Après la centrifugation, nous obtenons une phase aqueuse contenant le vert de méthyle et une phase organique inférieure contenant le chloroforme et le violet de crésyl. Nous avons récupéré la phase supérieure et répété l'opération jusqu'à ce que la phase inférieure devienne limpide. À la fin, la phase supérieure est récupérée et diluée.Cette solution est stable sur le banc de travail pendant plusieurs mois. Nous allons maintenant montrer comment procéder pour étendre la couche entière de MO dans les embryons avec du vert de méthyle. Pour la microscopie confocale, nous utiliserons l'embryon de poisson transgénique hautement fluorescent.À titre d'exemple, obtenir des embryons de poisson zèbre et éliminer les débris à l'aide d'une passoire. Les incuber jusqu'au stade souhaité dans de l'eau de bassin ou dans un milieu pour embryons. Retirer le chorion à l'aide de fines pincettes, puis fixer les embryons dans du formaldéhyde 4 % pendant quelques heures ou toute la nuit.Ensuite, laver les embryons dans du PBST plusieurs fois. Préparer une solution de travail au vert de méthyle en diluant la solution mère de cinq à dix mille fois dans du PBST. Incuber les embryons dans cette solution pendant au moins trois heures à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.Dans cet exemple, des images confocales seront obtenues sur un microscope confocal doté de détecteurs spectraux. L'excitation maximale est obtenue à l'aide d'un laser de 633 nanomètres et le détecteur est réglé sur une plage large, dans la région rouge du spectre visible.L'émission rouge du vert de méthyle permet d'obtenir une imagerie nucléaire de bonne qualité, même à partir d'échantillons profonds comme des embryons entiers, avec une perte de signal minimale. Cette première série montre une rétine de poisson zèbre dont les noyaux ont été marqués à l'aide d'un colorant ADN bien établi pour trois. Après une minute, nous effectuons un zoom arrière.Une région de balayage ABL devient évidente lorsque nous réalisons la même expérience avec du vert de méthyle ; aucun blanchiment évident n'est observé. Dans la série suivante, nous présentons des résultats représentatifs de ce qui peut être obtenu en utilisant le protocole décrit ici : cellule en mitose provenant de l'épiderme de zebrafish, dans laquelle des figures mitotiques peuvent être observées. Noyau IIC du même spécimen, où l'architecture nucléaire est visible.Reconstruction 3D d'une partie de la cellule épidermique d'une larve de poisson zèbre marquée au vert de méthyle amaline, une vue plus panoramique de différentes formes nucléaires au sein d'un poisson zèbre âgé de 48 heures post-fécondation, poisson d'argent, rétine de br. Nous avons montré ici une méthode simple permettant de préparer un colorant fluorescent pour l'ADN extrêmement peu coûteux, pouvant être utilisé pour l'étiquetage nucléaire. Bien que nous ne présentions ici qu'un exemple parmi plusieurs possibles, cette technique peut être appliquée à vos embryons ou tissus, en montage entier ou en coupes histologiques.Il peut également être utilisé pour la coloration de l'ADN dans les gels et pour la détermination de l'ADN en solution à l'aide de la photométrie.

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