Application de la tache verte de méthyle DNA-spécifique dans le Marquage fluorescent d'embryons
2 mai 2015
Une méthode de coloration fluorescente de matériel biologique fixé avec le marquage spécifique de l’ADN vert de méthyle est décrite. Le vert de méthyle est utilisé dans une solution aqueuse diluée et est très résistant au photoblanchiment. Son émission rouge lointain permet d’imager des échantillons en profondeur, ce qui la rend particulièrement adaptée aux embryons entiers.
Dans cette vidéo, nous montrerons comment la coloration histologique très courante du vert de méthyle peut être utilisée comme marqueur nucléaire extrêmement pratique en microscopie fluorescente avec les applications spéciales en microscopie confocale laser d’échantillons biologiques épais tels que des embryons entiers. Après avoir brièvement introduit le vert de méthyle en tant que colorant spécifique à l’ADN, nous décrirons la méthode de préparation des solutions mères et de travail pour la coloration fluorescente. Nous montrerons ensuite la procédure expérimentale pour réaliser une coloration nucléaire et maintenir plusieurs embryons de poissons et des exemples d’images confocales obtenues.
Enfin, les excellentes propriétés physico-chimiques des verts méthyles seront démontrées et discutées. Freddy Misha a découvert l’ADN en 1869 et a montré quelques années plus tard qu’il formait des précipités avec une annale relativement nouvelle et une coloration vert de méthyle. Le vert de méthyle a deux charges positives qui lui permettent d’interagir fortement avec l’ADN de son groupe principal, se liant préférentiellement aux régions d’accès.
L’utilisation la plus répandue du vert de méthyle a été sa combinaison dans une solution nasale avec de l’ARN colorant la périne, un méthyle développé par l’UNA et Poppen Heim au début du XXe siècle. Cependant, très peu a été analysé sur les propriétés fluorescentes du vert de méthyle, et c’est pourquoi nous avons décidé de tester la possibilité qu’il puisse être utilisé comme marqueur fluorescent de très haute affinité et spécifique. Pour l’ADN sur les cellules.
Le vert de méthyle est une coloration al méthane avec sept racines méthyliques. Ce septième groupe se perd facilement et il revient au violet cristallin. Pour cette raison, il y a une quantité d’arrivée de violet cristallin mélangé à du vert de méthyle pour éliminer le cristal.
La solution de vert de méthyle violet peut être lavée avec du chloroforme pour extraire le violet cristallin. Comme nous le montrerons immédiatement à cet effet, nous préparons une solution à 4 % d’ACU sous une hotte. Nous le mélangeons avec au moins deux parties de chloroforme et le centrifugons pour accélérer la séparation des phases.
Après centrification, on obtient une phase aqueuse avec du vert de méthyle et une phase organique inférieure avec du chloroforme et du violet cristallin. Nous avons récupéré la phase supérieure et répété jusqu’à ce que la phase inférieure apparaisse claire. À la fin, la phase supérieure est récupérée et diluée.
Cette solution est une écurie sur le banc de travail pendant des mois. Nous allons maintenant montrer comment procéder pour tendre toute la couche de MO dans les embryons avec du vert de méthamphétamine. Pour la micro-intégration confocale, nous utiliserons l’embryon de poisson à haute transplantation.
À titre d’exemple, obtenez des embryons de poisson-zèbre et lavez les débris avec une passoire. Incuber-les jusqu’au stade souhaité dans l’eau de l’aquarium ou dans un milieu embryonnaire. Retirez le corium à l’aide d’une pince à épiler, fixez les embryons à 4 % pour le formaldéhyde pendant ces quelques heures ou toute la nuit.
Ensuite, lavez les embryons dans du PBST plusieurs fois. Préparez une solution de travail de vert de méthyle en diluant la solution mère cinq à 10 000 fois dans du PBST. Incuber les embryons dans la solution pendant au moins trois heures à température ambiante ou une nuit à quatre degrés Celsius diminués.
Dans cet exemple, les images confocales seront obtenues dans un microscope confocal de moindre qualité équipé de détecteurs spectraux. L’excitation maximale est obtenue avec un laser de 633 nanomètres et le détecteur est réglé sur une large plage. Dans la zone rouge du spectre visible.
L’émission méthyl-vert-rouge permet d’obtenir une imagerie nucléaire de bonne qualité, même à partir d’échantillons profonds comme des embryons entiers, avec une perte de signal minimale. Cette première série montre la rétine d’un poisson zèbre dont les noyaux ont été colorés avec une coloration d’ADN bien établie à plus de trois. Au bout d’une minute, nous faisons un zoom arrière.
Une région de balayage ABL devient évidente lorsque nous effectuons la même expérience avec du vert de méthyle, aucun blanchiment évident n’est observé. Dans la série suivante, nous montrons des résultats représentatifs de ce qui peut être obtenu en utilisant le protocole décrit ici, cellule mitotique de l’épiderme du poisson zèbre dans laquelle des figures mitotiques peuvent être observées. Noyau IIC du même spécimen où l’architecture nucléaire peut être observée.
Reconstruction 3D d’une partie d’une cellule épidermique de larves de poisson-zèbre marquée au vert méthyle amalin, une vue plus panoramique de différentes formes nucléaires dans un port de 48 heures fécondation, poisson d’argent, br rétine. Nous avons montré ici un moyen facile de préparer une coloration d’ADN fluorescente extrêmement peu coûteuse qui peut être utilisée dans l’étiquetage nucléaire, bien que nous montrions juste à titre d’exemple, le de en contenir plusieurs. Cette technique peut s’appliquer à vos embryons ou tissus, qu’ils soient entiers ou sectionnels.
Il peut également être utilisé pour la coloration de l’ADN dans les gels et pour la détermination de l’ADN en solution à l’aide de la photométrie.
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Aperçu
Cet article décrit une méthode de coloration fluorescente de matériel biologique fixé à l'aide du vert de méthyle, un marqueur spécifique de l'ADN. L'émission en lumière rouge lointaine du vert de méthyle permet une imagerie en profondeur des échantillons, ce qui le rend adapté à l'étude d'embryons entiers.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microscopie fluorescente
- Coloration histologique
- Imagerie biologique
Contexte général
- Le vert de méthyle est une coloration histologique courante.
- Il interagit fortement avec l'ADN, en se liant préférentiellement aux régions riches en AT.
- Il a été découvert dans le cadre de recherches sur l'ADN à la fin du XIXe siècle.
- La coloration est résistante au blanchiment photochimique, ce qui améliore son utilité en microscopie.
Objectif de l'étude
- Démontrer l'utilisation du vert de méthyle comme marqueur nucléaire en microscopie fluorescente.
- Proposer une méthode pour la préparation des solutions mères et de travail pour la coloration.
- Présenter l'imagerie confocale de spécimens biologiques épais.
Méthodes utilisées
- Préparation des solutions mères et de travail du vert de méthyle.
- Coloration fluorescente de matériel biologique fixé.
- Application de la microscopie confocale à laser.
- Imagerie d'embryons entiers et analyse des images confocales.
Résultats principaux
- Coloration nucléaire réussie des embryons de poisson à l'aide de vert de méthyle.
- Démonstration d'excellentes capacités d'imagerie dues aux propriétés du vert de méthyle.
- Les images en microscopie confocale obtenues montrent une étiquetage nucléaire clair.
- La résistance du vert de méthyle au photoblanchiment a été confirmée.
Conclusions
- Le vert de méthyle est un marqueur nucléaire efficace pour la microscopie fluorescente.
- Ses propriétés le rendent adapté à l'imagerie de spécimens biologiques épais.
- La méthode peut être appliquée à divers contextes de recherche biologique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'étiquetage nucléaire fluorescent au vert de méthyle permet une imagerie haute résolution des noyaux dans des échantillons biologiques épais, soutenant les flux de travail de découverte précoce et de validation de cibles. Sa stabilité, sa spécificité pour l'ADN et sa compatibilité avec la microscopie confocale offrent une confiance prédictive pour les analyses au niveau cellulaire et tissulaire. Cette capacité améliore la prise de décision stratégique en permettant une imagerie robuste et reproductible dans des systèmes modèles complexes.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une visualisation précise du noyau pour des études fondées sur des hypothèses dans des cellules et tissus fixés.
- Facilite la validation fonctionnelle des cibles en permettant une identification claire de l'architecture nucléaire.
- Réduit l'ambiguïté mécanistique dans les modèles cellulaires grâce à un marquage spécifique de l'ADN.
- Permet une sélection fiable des cibles candidates à partir de données d'imagerie de haute fidélité.
Développement de criblages et de tests
- Prépare des systèmes biologiques validés pour des flux de travail d'imagerie à haut contenu en aval.
- Fournit une marquage nucléaire reproductible et quantitatif, essentiel à la standardisation des tests.
- Permet une montée en échelle et une réutilisation de la plateforme grâce à la stabilité et au faible coût du vert de méthyle.
- Permet une évaluation fiable des composés en minimisant la photodégradation et la perte de signal.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur les modèles biologiques pertinents pour la maladie en permettant l'imagerie d'embryons entiers et de tissus épais.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique grâce à un marquage nucléaire robuste.
- Facilite un développement adapté au risque en fournissant des résultats d'imagerie cohérents entre différents modèles.
- Améliore la réduction prédictive des risques par sa compatibilité avec des protocoles de coloration multiplexés.
Intégration des pipelines et des flux de travail
L'étiquetage fluorescent au vert de méthyle s'intègre dans la continuité de la découverte, depuis les premiers tests d'hypothèses jusqu'à l'imagerie préclinique, en soutenant les flux de travail qui nécessitent une visualisation nucléaire robuste dans des échantillons complexes.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses et la clarification des voies grâce à l'imagerie nucléaire spécifique à l'ADN.
- Triage : Fournit un marquage nucléaire prêt à l'emploi et reproductible pour les plates-formes de criblage à contenu élevé.
- Analytique : Fournit des lectures quantitatives et photostables pour l'analyse comparative des conditions cellulaires.
- Recherche translationnelle : Facilite l'alignement des biomarqueurs et la continuité dans les modèles pertinents pour les maladies.
- Réutilisation en entreprise : Offre une solution de marquage stable et rentable, adaptable à divers programmes de recherche et développement.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté en imagerie nucléaire.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation, la reproductibilité et la scalabilité des flux de travail d'imagerie.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt et l'efficacité du capital en permettant une génération robuste de données.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation et l'avancement, ajustés au risque, des programmes de découverte.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie confocale et en techniques d'imagerie fluorescente.
- Requiert un accès à des détecteurs spectraux et à des sources d'excitation laser compatibles (par exemple, 633 nm).
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles de coloration et d'imagerie pour assurer la reproductibilité.
- Adaptable à divers systèmes modèles fixés, y compris des embryons entiers et des coupes de tissus.
- Limité aux échantillons fixés ; non adapté à l'imagerie nucléaire en cellules vivantes.
