Imagerie animal entier et cytométrie de flux techniques pour T CD8 + Analyse des réponses spécifiques de l'antigène de cellule après nanoparticules vaccination

L'objectif général de l'expérience suivante est de synthétiser et de caractériser des nanoparticules vaccinales à base de lipides, puis d'évaluer leur capacité à induire une expansion in vivo de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de l'antigène. Ceci est réalisé en concevant des vésicules multilamellaires interbilayées réticulées, ou ICMV, imitant un agent pathogène et chargées simultanément d'un antigène et d'un adjuvant, afin de vacciner des souris naïves. Transfert adoptif de lymphocytes T CD8 positifs, spécifiques de l'antigène et exprimant la luciférase.

Dans la deuxième étape, l'expansion des lymphocytes T CD8 positifs spécifiques de l'antigène est évaluée par imagerie in vivo sur l'animal entier. Les cellules mononucléées du sang périphérique, prélevées chez les animaux immunisés contre l'ICMV, sont ensuite marquées avec des tétramères marqués au fluorochrome et analysées par cytométrie en flux afin de quantifier la fréquence des lymphocytes T CD8 positifs spécifiques de l'antigène endogène au sein du compartiment systémique. Enfin, l'imagerie bioluminescente peut être utilisée pour suivre l'expansion des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de l'antigène en réponse à la vaccination par nanoparticules.

Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions préliminaires essentielles dans la conception de vaccins, telles que l'ampleur de l'expansion des lymphocytes T cytotoxiques et la manière dont ces cellules migrent vers divers tissus en réponse à une vaccination par nanoparticules. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'analyse in-situ des lymphocytes T après nécropsie tissulaire, est que l'imagerie in vivo de la réponse des lymphocytes T est non invasive. Permettant ainsi un suivi longitudinal du même animal, commencez par mélanger un rapport molaire un pour un de DOPC et de MPB dans du chloroforme, en maintenant une quantité totale de lipides de 1,26 micromole par lot dans un flacon en verre de 20 millilitres.

Ensuite, ajoutez le cargo lipophile à la solution lipidique à la concentration souhaitée et purgez la solution avec un excès d'azote gazeux sec afin d'éliminer complètement le solvant organique. Placez l'échantillon sous vide pendant la nuit, puis, le lendemain matin, ajoutez 200 microlitres d'une solution de BTP 10 millimolaire contenant le cargo hydrosoluble d'intérêt pour hydrater le film lipidique ; vortexez la solution obtenue pendant 10 secondes toutes les 10 minutes, pendant une heure à température ambiante. Transférez ensuite le contenu dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Placez ensuite le tube dans un bain d’eau glacée avec une sonication continue en utilisant le réglage d’intensité à 40 % sur un sonicateur de 125 watts équipé d’une sonde à pointe de 20 kilohertz. Après cinq minutes, ajoutez quatre microlitres de DTT à 150 millimolaire dans le tube, vortexez pour homogénéiser, puis centrifugez brièvement l’échantillon dans une microcentrifugeuse. Ensuite, ajoutez 40 microlitres de chlorure de calcium à 200 millimolaire à l’échantillon, puis effectuez la réticulation des couches lipidiques contenant le MPB avec le DTT à 37 degrés Celsius pendant une heure.

À la fin de l'incubation, centrifuger la solution trois fois en ajoutant 200 microlitres d'eau doublement distillée lors des deuxième et troisième centrifugations, afin d'éliminer le chlorure de calcium résiduel, le DTT non réagi et les composants cargos non encapsulés du surnageant. Après la dernière centrifugation, resuspendre les I CMVs dans 100 microlitres de pegol fraîchement préparé pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Puis laver les vésicules deux fois supplémentaires dans de l'eau doublement distillée.

Resuspendre le culot final dans du PBS et conserver les VCI à quatre degrés Celsius. Pour caractériser les particules, mélanger la suspension froide de VCI avant de diluer un petit aliquot de l'échantillon dans un volume total d'un millilitre d'eau doublement distillée. Ensuite, placer les VCI dans une cuvette de zétamètre et utiliser un système de diffusion dynamique de la lumière et de mesure du potentiel zêta afin de déterminer la taille des particules, l'indice de polydispersité et le potentiel zêta des échantillons selon les instructions du fabricant.

Pour isoler les cellules T CD8 positives exprimant la luciférase spécifiques aux ovules, commencez par prélever les spléens de souris transgéniques OT1-luciférase. Placez les tissus dans cinq millilitres de PBS glacé contenant 2 % de FBS, puis transférez-les dans une hotte de culture cellulaire.

Utilisez le piston d'une seringue de trois millilitres pour broyer jusqu'à trois splènes simultanément à travers un tamis de 70 microns dans un tube conique de 15 millilitres. Rincez le piston et le tamis avec du PBS et du FBS à 2 %. Ensuite, amenez le volume total de la suspension cellulaire à 10 millilitres par rate.

Déterminez le nombre total de cellules, puis centrifugez les cellules. Ensuite, utilisez un kit de sélection négative magnétique disponible dans le commerce pour isoler les cellules spléniques positives pour le CD eight conformément aux instructions du fabricant. Puis lavez les cellules T dans du PBS.

Les compter et incuber deux à trois fois 10 puissance 5 de ces cellules dans 20 microlitres d'anticorps bloquant CD1632 de souris. Après 10 minutes, ajouter 20 microlitres d'anticorps anti-CD8a APC aux cellules pendant 30 minutes, puis évaluer la pureté de la population de lymphocytes T CD8 positifs isolés par billes magnétiques par cytométrie en flux. Ensuite, transférer de façon adoptive de 1 à 10 fois 10 puissance 5 lymphocytes T CD8 positifs OT1 luciférase dans des souris C57BL/6 albinos rasées naïves, en 200 microlitres de PBS, par injection intraveineuse dans la veine de la queue. 24 heures plus tard, administrer le vaccin au nombre approprié de jours suivant la vaccination.

Injecter les animaux avec 150 milligrammes par kilogramme de Lucifer après 10 minutes, puis acquérir le signal de bioluminescence pendant cinq à 10 minutes à l’aide d’un système d’imagerie sur animal entier afin de visualiser les lymphocytes T OT1 Lucifer CD8 positifs pour déterminer le nombre de lymphocytes T CD8 positifs spécifiques de l’antigène au moment approprié. Après la vaccination, prélever environ 100 microlitres de sang chez les souris vaccinées par la technique de saignement sous-mandibulaire dans un tube revêtu d’EDTA potassium, puis retourner le tube plusieurs fois pour éviter la coagulation. Ensuite, transférer 100 microlitres de sang dans un tube de microcentrifugeuse et ajouter un millilitre de tampon de lyse CK.

Après deux à trois minutes, centrifuger les cellules et éliminer le surnageant. Laver les PBMC restants dans un millilitre de tampon fax et bloquer la liaison non spécifique avec le CD 1632 comme vient de l'être démontré. Après 10 minutes, répartir la suspension cellulaire dans des tubes fax ronds de quatre millilitres et ajouter 20 microlitres de la solution H deux KB sur tétramère syn fécale PE à chaque échantillon selon les spécifications du fabricant.

Après 30 minutes sur glace, ajoutez 20 microlitres du cocktail d'anticorps approprié à chaque échantillon expérimental, ainsi que les anticorps de contrôle uniques pour chaque étiquette tétramère ou anticorps fluoro four à chaque échantillon témoin. Enfin, après une autre incubation de 20 minutes, lavez tous les échantillons dans du tampon fax, redispensez les culots dans du tampon fax supplémenté avec DPI, puis analysez les échantillons par cytométrie en flux. Les CMV chargés conjointement avec des antigènes protéiques fluoro four et des colorants lipophiles fluorescents permettent la visualisation in vivo de la livraison d'antigènes et de nanoparticules. Par exemple, l'imagerie par microscopie confocale indique que l'antigène soluble administré par voie sous-cutanée à la base de la queue atteint les ganglions lymphatiques drainants dans les quatre heures suivant l'administration et est éliminé au bout de 24 heures.

En revanche, les I CMV surchargés sont d'abord détectés au niveau de la périphérie des ganglions lymphatiques drainants à 24 heures après l'administration, avec une accumulation continue conduisant à un important dépôt d'I CMV ova au sein du tissu lymphatique drainant. Dès le quatrième jour, l'imagerie de bioluminescence de souris C57BL/6 ayant reçu une transfusion adoptive de cellules T CD8 positives exprimant OT1-luciférase le jour de la vaccination montre un niveau de fond minimal de cellules T OT1-luciférase au quatrième jour suivant la vaccination. Toutefois, les souris immunisées avec les I CMV ova MPI présentent un signal de bioluminescence intense au niveau des ganglions lymphatiques inguinaux drainants.

Les souris vaccinées avec l'ova soluble montrent, en revanche, une expansion nettement réduite des cellules T CD8 positives OT1 Lucifer dans les ganglions lymphatiques drainants. De plus, les souris immunisées avec l'ova soluble et le MPLA, sans transfert adoptif de cellules T spécifiques de l'antigène, n'exhibent pas d'expansion appréciable de cellules T CD8 positives spécifiques de l'ova, comme l'indique le suivi hebdomadaire des PBMC. La vaccination ICMV, cependant, induit une réponse endogène de cellules T CD8 positives significativement plus forte, atteignant un pic de 28 % de cellules T tétramères spécifiques de l'ova parmi le compartiment des cellules T CD8 positives au sein des PBMC au jour 41. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la synthèse des nanoparticules à base lipidique, de la réalisation des immunisations, ainsi que de la visualisation et de la quantification de l'expansion des lymphocytes T cytotoxiques in vivo.

Ces méthodes peuvent être davantage modifiées afin de révéler des informations supplémentaires sur la réponse CTL. Par exemple, l'essai de coloration teer peut être complété par des marqueurs supplémentaires tels que CD127, BCL2 et KLRG1 afin d'évaluer le phénotype de mémoire des cellules.