Name: Imagerie animal entier et cytométrie de flux techniques pour T CD8 + Analyse des réponses spécifiques de lantigène de cellule après nanoparticules vaccination (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Découvrez la synthèse de nanoparticules vaccinales lipidiques pour évaluer l'expansion des lymphocytes T CD8+ spécifiques d'antigène chez la souris. Cette méthode combine imagerie bioluminescente et cytométrie en flux.

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Cette étude a été soutenue par l&#39;Institut national de la santé accorde 1K22AI097291-01 et par le Centre national pour l&#39;avancement des sciences translationnelle des Instituts nationaux de la santé en vertu Prix Nombre UL1TR000433. Nous reconnaissons également professeur Darrell Irvine au MIT et professeur Matthias Stephan au Fred Hutchinson Cancer Center pour leur contribution sur le travail initial sur les nanoparticules de vaccins et les souris transgéniques OT-I / Luc.

Toutes les expériences décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le Comité de l&#39;Université sur l&#39;utilisation et l&#39;entretien des animaux (UCUCA) à l&#39;Université du Michigan et réalisés selon les politiques et les lignes directrices établies. 1. Synthèse et caractérisation de ICMVs Co-chargé avec de la protéine antigène et adjuvant Molécules <ol><li> Mélanger 1: 1 de rapport molaire de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC) et de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) butyramide] (MPB) dans du chloroforme, en maintenant la quantité de lipides totaux à 1,26 umol par lot (par exemple, 500 pg de DOPC et 630 ug de MPB) dans un flacon en verre de 20 ml (diamètre = 28 mm et hauteur = 61 mm). </li><li> Ajouter médicaments lipophiles, tels que le monophosphoryl lipide A (MPLA) ou des colorants lipophiles (par exemple, a fait), à la solution de lipides à la concentration souhaitée. Bien enlever le solvant organique par purge à nitroge extra-secn gaz et plaçant les échantillons sous vide O / N. </li><li> Hydrater le film de lipide par addition de 200 ul de 10 mM de bis-tris propane (BTP, pH 7,0) contenant des médicaments solubles dans l&#39;eau (par exemple, des antigènes de protéines). Vortex pendant 10 secondes toutes les 10 minutes pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Transférer le contenu du flacon en verre dans un tube de 1,5 ml, placer les échantillons dans un bain d&#39;eau glacée, et soniquer en continu pendant 5 min en utilisant le réglage sur une 125 W / 20 kHz pointe de sonde sonicator intensité de 40%. </li><li> Ajouter 4 pi de dithiothréitol 150 mM (DTT) à chaque lot (concentration de travail de 2,4 mM), vortex et centrifuger brièvement en utilisant une microcentrifugeuse de table. </li><li> Ajouter 40 ul de 200 mM de CaCl2 et mélanger avec la pipette (concentration de travail de 33 mm). Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 heure pour permettre la réticulation du MPB-contenant des couches lipidiques avec la TNT. </li><li> Centrifuger les échantillons à 20000 g pendant 15 min, retirer le surnageant et remettre en suspension dans 200 pi de ddiH 2 O. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.7 et centrifuger à nouveau après le deuxième ddiH 2 O lavage pour éliminer CaCl 2, qui n&#39;a pas réagi de la TNT, et des matériaux de fret non encapsulées à partir du surnageant. </li><li> Préparer 10 mg / ml de 2 kDa polyéthylène glycol-thiol (PEG-SH) en ddiH 2 O. Remettre en suspension chaque échantillon ICMV dans 100 ul de solution de PEG-SH et incuber à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Effectuer deux ddiH 2 O lavages (étape 1.7) et remettre le culot ICMV finale dans PBS et conserver à 4 ° C. Avant l&#39;utilisation, mélanger la suspension ICMV, comme des particules peuvent se déposer au fond après un stockage prolongé. </li><li> Pour la caractérisation de particules, retirer une petite quantité aliquote (~ 10%) du ICMVs de chaque lot individuel et diluer à un volume total de 1 ml de ddiH 2 O. Placer un échantillon unique dans une cellule Zetasizer taille et la mesure des particules, l&#39;indice de polydispersité, et le potentiel zêta des échantillons en utilisant un système DLS et de mesure de potentiel zêta (selon le protocole du fabricant). </li></ol> 2. Examen des ganglions lymphatiques Evacuation des ICMVs fluorescence étiqueté avec la microscopie confocale <ol><li> Préparation de ICMVs chargé avec un antigène marquée par un fluorophore et un colorant fluorescent lipophile <ol><li> Préparer fluorophore protéine à marquage, tel que mis à réagir avec de l&#39;ovalbumine Alexa Fluor 555-succinimidyl ester, selon les instructions du fabricant. </li><li> Pour préparer ICMVs marqués avec fluorophore dans l&#39;enveloppe lipidique, ajouter lipophile colorant fluorescent, (par exemple, 1,1 dioctadécyl-3,3,3 &#39;, 3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) pendant la préparation du film lipidique (Étape 1.2) à 0,05% quantité de lipides molaire. Pour le film lipidique hydratation (Étape 1.3), tampon d&#39;utilisation contenant l&#39;antigène marquée par un fluorophore, et la synthèse de ICMV complète telle que décrite dans les étapes 1.4 à 1.11. </li></ol></li><li> Administration sous-cutanée de nanoparticules à base de la queue <ol><li> Anesthésier la souris au moyen d&#39;un évaporateur à flux contrôlé équipé d&#39;une chambre d&#39;induction utilizing 3% d&#39;isoflurane et 1,5 l / min de débit d&#39;oxygène selon l&#39;une IACUC a approuvé le protocole de l&#39;animal. Une fois que la souris est inconscient, effectuez les étapes suivantes rapidement avant l&#39;anesthésie se dissipe pour permettre un accès optimal au site de l&#39;injection et de minimiser l&#39;inconfort à l&#39;animal. Vous pouvez également utiliser un cône de nez bon raccord pour maintenir l&#39;anesthésie. Si les souris sont anesthésiées pendant plus de 5 minutes, appliquer du lubrifiant nécessaire de minimiser l&#39;irritation de l&#39;oeil après l&#39;intervention. </li><li> Pulvériser la base de la queue avec 70% d&#39;éthanol pour désinfecter et mouiller la fourrure partie les cheveux mouillés pour exposer une petite parcelle de peau visible, qui peut être utilisé pour visualiser l&#39;aiguille sous la peau. </li><li> Préparez particule suspension injectable contenant la quantité désirée de l&#39;antigène et de l&#39;adjuvant pour 100 ul de dose de vaccination dans du PBS (par exemple, 10 pg d&#39;OVA et 0,3 ug MPLA pour 100 ul de dose d&#39;injection a été utilisé dans le passé de 6,9). </li><li> Dessinez le int suspension de particulesoa seringue avec une aiguille 27-29 G et insérer l&#39;aiguille à la base de la queue (~ 5 mm de la racine des cheveux) avec le biseau vers le haut et injecter 50 pi de la suspension de particules 22. </li><li> Attendez quelques secondes pour que la pression pour égaliser à prévenir tout refoulement excessive et retirez l&#39;aiguille. Répéter l&#39;injection de l&#39;autre côté de la base de la queue de cibler les ganglions inguinaux de drainage. </li></ol></li><li> Préparation des lymphatiques cryosections de noeuds et de l&#39;examen par microscopie confocale. <ol><li> Euthanasier la souris avec CO 2 asphyxie, suivie d&#39;un pneumothorax induite selon un IACUC approuvé le protocole de l&#39;animal. Extrait ganglions inguinaux selon le protocole démontré dans Bedoya 23 et laver le sang en plaçant les tissus dans 1 ml de 4 ° C PBS. </li><li> Absorber le PBS à partir des tissus avec les tissus et les placer dans le tissu cryomoules de tissus (10 x 10 x 5 mm 3) pré-remplie à ras OCT milieu de congélation 24. Aligner geler le tispoursuivre bloc dans l&#39;azote liquide pendant 30 sec. Sinon, placez bloc de tissu sur glace sèche pendant 30 min. Stockez tissu congelé à -80 ° C dans le congélateur. </li><li> Couper des sections de tissus 5-10 um d&#39;épaisseur dans un cryostat fixé à -20 ° C 24. </li><li> Si nécessaire, effectuez l&#39;étiquetage d&#39;immunofluorescence, et d&#39;examiner le tissu avec la microscopie confocale comme précédemment démontré 24. </li></ol></li></ol> 3. Suivi Expansion de l&#39;antigène spécifique, la luciférase exprimant T CD8 + après vaccination avec des nanoparticules entier imagerie animale <ol><li> Isolement de OVA257-264 spécifique de cellules de luciférase exprimant CD8 + T de souris transgénique OT-I / Luc <ol><li> Euthanasier une souris transgénique OT-I / Luc avec CO 2 asphyxie et d&#39;induire un pneumothorax selon un IACUC approuvé le protocole de l&#39;animal. Récolter la rate d&#39;une manière stérile en accédant à la cavité péritonéale et soigneusement détacher le tissu du pancréas 23, etdans 5 ml de PBS à 4 ° C + 2% de FBS pour le transfert de la culture de tissus capot. </li><li> Placer la rate sur un tamis en nylon de 70 pm sur un tube de centrifugation conique de 50 ml (jusqu&#39;à 3 rates à la fois). L&#39;utilisation d&#39;un plongeur d&#39;une seringue de 3 ml, broyer les cellules à travers le tamis. </li><li> Laver le piston et la crépine avec PBS + 2% de FBS et le jeter. Porter le volume total à 10 ml / rate dans le tube de 50 ml, prendre un petit échantillon de la suspension cellulaire de compter avec un hémocytomètre, et centrifuger pendant 10 min à 300 x g. </li><li> Utilisation d&#39;un kit disponible dans le commerce de sélection négative magnétique, isoler la population de cellules T CD8 + en suivant les instructions du fabricant. </li><li> Après avoir lavé les cellules avec du PBS, compter le nombre de cellules T CD8 + isolées. Afin d&#39;évaluer la pureté des cellules T CD8 + isolées, incuber ~ 20.000-30.000 cellules dans 20 ul de CD16 de souris / anticorps 32 (0,025 mg / ml) pendant 10 min, puis ajouter 20 ul d&#39;anticorps αCD8-APC (0,005 mg / ml) et incuber pendant 30 min. Perform toutes les incubations à 4 ° C dans du PBS + 1% p / v de BSA. Effectuer flux analyse cytométrique 25. </li></ol></li><li> Le transfert adoptif de lymphocytes T CD8 + isolés et la visualisation de leur vaccination l&#39;expansion de poste <ol><li> Effectuer le transfert adoptif de cellules isolées OT-I / Luc T CD8 + naïfs en C57BL / 6 souris par administration de 1 à 10 x 10 5 cellules dans un volume de 200 ul de PBS par voie intraveineuse via la queue injection dans la veine 22 (jour -1). Considérant que la fourrure et de la peau noire correctifs dans C57BL / 6 peut interférer avec le signal de bioluminescence, albinos rasé souris C57BL / 6 sont idéales pour ces études. </li><li> Après une journée (jour 0), administrer le vaccin comme décrit précédemment (section 2.2). </li><li> Administrer 150 mg de luciférine par kg de poids corporel de la souris par voie intraperitoneale dans un volume de 300 ul de PBS. Après 10 min, anesthésier les souris avec l&#39;isoflurane (comme à l&#39;étape 2.2.1) et visualiser les cellules OT-I / Luc T CD8 + par l&#39;acquisition du signal de bioluminescence pendant 5-10 min wvec tout un système d&#39;imagerie animale (IVIS; se référer à Wilson 26 pour des instructions détaillées). Répéter au besoin pour les études longitudinales. </li></ol></li></ol> Les cellules T CD8 + peptide-CMH 4. La coloration tétramère de PBMC pour l&#39;analyse de l&#39;antigène-spécifiques Remarque: La procédure de protocole qui suit peut être effectuée en utilisant soit des souris C57BL / 6 avec des cellules transférées de manière adoptive OT-I / Luc T CD8 + ou des souris C57BL / 6 sans le transfert adoptif. <ol><li> A un point de temps souhaité après la vaccination, de recueillir environ 100 pi de sang (4-6 gouttes) de souris via submandibular technique de saignements 27 dans un tube revêtu de K 2 EDTA et inverser plusieurs fois pour empêcher la coagulation. </li><li> Transférer 100 ul de sang dans un tube à centrifuger, ajouter 1 ml de tampon de lyse, et incuber pendant 2 à 3 min pour éliminer les globules rouges (hématies). Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 1500 xg et retirer le surnageant. Si la pastille encoreppears rouges (indiquant une élimination incomplète des globules rouges), répéter l&#39;étape de lyse avec une brève incubation (&lt;1 min) de tampon de lyse. </li><li> Laver les PBMC restantes avec 1 ml de tampon FACS (PBS + 1% p / v de BSA) et centrifuger à 1500 g pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension l&#39;échantillon dans 20 pi de CD16 / 32 anticorps de souris (0,025 mg / ml) pour bloquer la liaison non spécifique d&#39;anticorps et à médiation par FcR. Incuber pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Transfert cellules de microtubes en 4 ml tubes FACS à fond rond. Ajouter 20 pi de H-2K b solution OVA Tétramère-SIINFEKL-PE selon les spécifications du fabricant pour chaque échantillon et incuber pendant 30 min sur la glace. </li><li> Préparer le cocktail d&#39;anticorps (par exemple, αCD8-APC, αCD44-FITC, et αCD62L-PECy7 anticorps (0,005, 0,005 et 0,002 mg / ml concentration, respectivement)). Ajouter 20 ul à chaque échantillon expérimental, et incuber pendant 20 min sur de la glace. Préparer des témoins fluorophores simples par laBeling cellules avec chaque anticorps tétramère ou fluorophore marqués à la concentration indiquée ci-dessus. </li><li> Laver deux fois avec du tampon FACS et remettre en suspension le culot final dans du tampon FACS contenant 2 ug / ml de DAPI. Les cellules sont maintenant prêts pour l&#39;analyse par cytométrie en flux (détails et des exemples peuvent être trouvés dans Scheffold 25). </li></ol>

Perkin Elmer à condition que le coût de production encourus lors de la publication de cet article.

Le protocole fourni dans cet article décrit la synthèse et la caractérisation d&#39;un nouveau système de nanoparticules à base de lipides, appelé ICMVs, et fournit le processus de validation efficacité des formulations de vaccins à base de nanoparticules à induire CD8 + réponses des lymphocytes T spécifiques de l&#39;antigène. Synthèse ICMV est terminée dans tous les état ​​aqueuse, qui est un avantage majeur par rapport aux autres systèmes couramment utilisés polymères de nanoparticules (par exemple, le poly ...

Développement traditionnel de vaccin a principalement utilisé l&#39;approche empirique de l&#39;essai-erreur. Cependant, avec le développement récent d&#39;un large éventail de biomatériaux et de découverte de déterminants moléculaires de l&#39;activation immunitaire, il est maintenant possible de concevoir rationnellement des formulations de vaccins avec des indices biophysiques et biochimiques dérivées d&#39;agents pathogènes 1,2. En particulier, diverses plates-formes de distribution de médicaments particulaires ont été examinés en tant que supports de vaccins, car ils peuvent être co-chargés avec des antigènes de sous-unités et agents immunostimulants, protéger les composants du vaccin contre la dégradation, et de renforcer leur collaboration livraison à cellules présentatrices d&#39;antigène (CPA) résidant dans la lymphe nœuds (LNS), maximisant ainsi la stimulation et l&#39;activation immunitaire 3-5. Dans ce rapport, nous décrivons la synthèse d&#39;un système de nanoparticules &quot;pathogène imitant&quot;, appelé interbilayer réticulé vésicules multilamellaires (ICMVs), qui ont déjà été démontrées comme un platfor de vaccin puissantm pour le déclenchement de solide lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et des réponses immunitaires humorales dans les deux compartiments de tissus muqueux et systémiques 9.6. En particulier, la vaccination avec ICMVs atteint des niveaux d&#39;IgG sérique sensiblement améliorée contre un antigène de la malaria, par rapport à la vaccination avec des adjuvants classiques (par exemple, l&#39;alun et Montanide) 7 et également provoqué des réponses CTL puissantes contre les cellules tumorales et des modèles de provocation virale chez la souris 9. Ici, en utilisant ICMVs comme un système de nanoparticules de vaccin de modèle, nous décrivons des procédés de caractérisation de vaccins nano-formulations, y compris la taille des particules et des mesures de potentiel zêta et le suivi du trafic de particule de ganglions drainants (DLNS) en utilisant l&#39;imagerie confocale des tissus cryosectioned 7. En outre, nous présentons une méthode d&#39;analyse de l&#39;expansion de réponses CTL chez des souris après le transfert adoptif de lymphocytes T CD8 + spécifiques de l&#39;antigène exprimant la luciférase basé 9,10-imagerie-ensemble des animaux. Enfin, nous avons describe coloration tétramère de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) pour la quantification longitudinal de réponses de cellules T endogènes dans les souris vaccinées avec des nanoparticules 6,9. ICMVs sont une formulation de nanoparticules à base de lipides synthétisés par fusion contrôlée de liposomes multilamellaires à des structures simples, qui sont ensuite stabilisés chimiquement par des groupes de reticulation tête de phospholipides à fonction maléimide à l&#39;intérieur de couches lipidiques avec des agents de reticulation 6 dithiol. Une fois ICMVs sont synthétisés, une petite fraction de nanoparticules peut être utilisée pour déterminer la taille des particules et le potentiel zêta (c.-à-charge de surface des particules) d&#39;un système de diffusion de lumière dynamique (DLS) et un analyseur potentiel zêta. DLS mesure les changements dans la diffusion de lumière dans des suspensions de particules, permettant de déterminer le coefficient de diffusion et la taille hydrodynamique des particules 11. Atteindre la taille des particules cohérente de lot à la synthèse des lots est essentielleétant donné que la taille des particules est un des principaux facteurs qui influent sur ​​le drainage lymphatique de particules de vaccin à DLNS et l&#39;absorption cellulaire ultérieur par des APC 12,13. En outre, le potentiel zêta peut être obtenue par mesure de la vitesse des particules quand un courant électrique est appliqué, ce qui permet la détermination de la mobilité électrophorétique des particules et la surface de la charge particulaire 11. Assurer des valeurs de potentiel zêta de particules cohérentes est important car la charge de surface des particules détermine la stabilité colloïdale, ce qui a un impact direct sur ​​la dispersion de particules pendant le stockage et après l&#39;administration in vivo 14,15. Afin de suivre la localisation des particules à DLNS, ICMVs peuvent être marquées par des fluorophores désirés, y compris les colorants lipophiles et les antigènes de façon covalente-marqués. Après immunisation, les souris peuvent être euthanasiés à différents points dans le temps, DLNS réséqués, cryosectioned, et analysées par microscopie confocale. Cette technique permet de visualiser drai lymphatiquening des deux porte-vaccins de nanoparticules et de l&#39;antigène à DLNS. Les sections de tissu peuvent en outre être colorés avec des anticorps marqués par fluorescence et utilisé pour obtenir plus d&#39;informations, tels que les types de cellules associées à l&#39;antigène et la formation de centres germinatifs comme nous l&#39;avons indiqué précédemment 7. Une fois la synthèse des particules est optimisée et le trafic aux DLNS est confirmé, il est important de valider le déclenchement de l&#39;expansion dans vivo de CTL. Afin d&#39;analyser le déclenchement des cellules spécifiques de l&#39;antigène T CD8 + en réponse à la vaccination de nanoparticules, nous avons utilisé un antigène modèle, l&#39;ovalbumine (OVA), avec de l&#39;OVA 257-264 peptide (SIINFEKL) d&#39;un epitope immunodominant de cellule T CD8 +, ce qui permet des analyses immunologiques détaillées des réponses de cellules T spécifiques de l&#39;antigène pour 16,17 initiale de développement d&#39;un vaccin. En particulier, pour interroger la dynamique d&#39;expansion et de la migration des cellules spécifiques de l&#39;antigène T CD8 +, nous avons généré unmodèle de la double-souris transgénique en traversant la luciférase de luciole exprimant souris transgéniques (Luc) avec des souris transgéniques OT-I qui possèdent des cellules avec le récepteur des cellules T (TCR) spécifique pour SIINFEKL (en association avec H-2K b) T CD8 +. A partir de ces souris OT-I / Luc, exprimant la luciférase, les cellules OT-I T CD8 + peuvent être isolées et préparées pour le transfert adoptif dans des souris C57BL / 6 naïves. Une fois ensemencée, l&#39;immunisation réussie avec des nanoparticules contenant OVA se traduira par l&#39;expansion des cellules T transférées, qui peuvent être suivis en surveillant le signal de bioluminescence avec un ensemble de 9,10 Système d&#39;imagerie par animal. Cette technique d&#39;imagerie du corps entier non invasif a été utilisé avec d&#39;autres antigènes viraux ou tumoraux dans le passé 18 à 20, les processus impliqués dans l&#39;expansion des cellules T dans les tissus lymphoïdes et la diffusion dans les tissus périphériques de manière longitudinale révélateur. Complémentaire à l&#39;analyse des adoptive cellules spécifiques de l&#39;antigène transférés T CD8 +, endógenoles réponses des lymphocytes nous T après la vaccination peut être examiné avec le complexe peptide-complexe majeur d&#39;histocompatibilité (CMH) de dosage de tétramère 21, dans lequel un complexe tétramère peptide-CMH, composé de quatre fluorophore marqués MHC-molécules de classe I chargé avec des epitopes peptidiques, est utilisé à lier le TCR et l&#39;étiquette des cellules T CD8 + d&#39;une manière spécifique à un antigène. L&#39;essai de tétramère MHC-peptide peut être effectuée soit dans des études d&#39;autopsie terminaux afin d&#39;identifier les cellules T CD8 + spécifiques de l&#39;antigène dans les tissus périphériques et lymphoïde ou dans des études longitudinales avec des cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) obtenues à partir de sang en série tire. Après coloration des lymphocytes avec un peptide tétramère MHC, la cytométrie en flux analyse est effectuée pour des analyses détaillées sur le phénotype des CTL ou la quantification de leur fréquence chez les cellules T CD8 +.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Synthèse et caractérisation d’ICMV co-chargés avec des molécules protéiques, antigènes et adjuvantes </td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sel de sodium) (MPB)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td></td><td></td>870012</tr><tr><td>1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td></td><td></td>850375</tr><tr><td>Lipide monophosphoryle A (synthétique) (PHAD&trade ;) (MPLA)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td>699800</td><td></td></tr><tr><td>Flacons en verre de 20 ml</td><td>Wheaton</td><td>0334125D</td><td></td></tr><tr><td>Symphny Four</td><td>sous vide VWR</td><td>414004-580</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumine (OVA)</td><td>Worthington</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris Propane (BTP)</td><td>Fisher</td><td>BP2943</td><td></td></tr><tr><td>Q125 Sonicator (125&nbsp ; W/20&nbsp ; kHz)</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>2 kDa Polyéthylène glycol thiolé (PEG-SH)</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SH-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&nbsp ;</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer Cuvettes</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2. Examen du drainage ganglionnaire d’ICMV marqués à la fluorescence avec microscopie confocale</td></tr><tr><td>1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tétraméthylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzènesulfonate de sel (DID)</td><td>Life Technologies</td><td>D-7757</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)</td><td>Life Technologies</td><td>A37571</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT moyen de congélation&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Cryomoules tissulaires</td><td>VWR</td><td>25608-922</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3. Surveillance de l’expansion des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène et exprimant la luciférase après la vaccination par nanoparticules avec l’imagerie de l’animal entier </td></tr><tr><td>C57BL/6 souris</td><td>Jackson</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Albino C57BL/6 souris</td><td>Jackson</td><td>000058</td><td></td></tr><tr><td>OT-1 C57BL/6 souris</td><td>Jackson</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu ; passoire en nylon m</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade ; Souris CD8+ Kit d’isolement des lymphocytes T</td><td>StemCell</td><td>19853</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&reg ; système d’imagerie pour l’animal entier</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. Coloration peptide-tétramère CMH des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) pour l’analyse cytométrique en flux des cellules T CD8+ spécifiques de l’antigène </td></tr><tr><td>K2EDTA Tampon</td><td>de</td> lyse BD <td>365974</td><td></td></tr><tr><td>ACK</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 Fc Block</td><td>Ebioscience</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>H-2Kb OVA Tetramer</td><td>MBL</td><td>TS-5001-1C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8-APC</td><td>BD</td><td>553031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD44-FITC</td><td>BD</td><td>553133</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD62L-PECy7</td><td>Ebioscience</td><td>25-0621-82</td><td></td></tr><tr><td>4&prime ;,6- Dichlorhydrate de diamidino-2-phénylindole (DAPI)</td><td>SIGMA</td><td>D8417-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux CyAn</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie animal entier et cytométrie de flux techniques pour t cd8 + analyse des réponses spécifiques de l&#39;antigène de cellule après nanoparticules vaccination

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

<classe p = 'jove_content'>Les adjuvants vaccinaux traditionnels, tels que l’alun, provoquent des réponses sous-optimales des lymphocytes T CD8+. Pour relever ce défi majeur dans le développement de vaccins, divers systèmes de nanoparticules ont été conçus pour imiter les caractéristiques des agents pathogènes afin d’améliorer l’apport d’antigène aux ganglions lymphatiques drainants et d’augmenter l’absorption de l’antigène par les cellules présentatrices d’antigènes, ce qui a conduit à de nouvelles formulations de vaccins optimisées pour l’induction de réponses des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène. Dans cet article, nous décrivons la synthèse d’un système de nanoparticules « imitant les agents pathogènes », appelé vésicules multilamellaires réticulés interbicouches (ICMV) qui peuvent servir de vecteur de vaccin efficace pour l’administration conjointe d’antigènes sous-unitaires et d’agents immunostimulants et l’induction de réponses puissantes des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTL). Nous décrivons des méthodes de caractérisation de la taille hydrodynamique et de la charge de surface des nanoparticules vaccinales avec diffusion dynamique de la lumière et analyseur de potentiel zêta, et présentons une procédure basée sur la microscopie confocale pour analyser l’administration d’antigène médiée par les nanoparticules aux ganglions lymphatiques drainants. De plus, nous montrons une nouvelle technique d’imagerie par bioluminescence sur l’animal entier utilisant le transfert adoptif de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène exprimant la luciférase dans des souris receveuses, suivi d’une vaccination par nanoparticules, qui permet d’interroger de manière non invasive les modèles d’expansion et de trafic des CTL en temps réel. Nous décrivons également la coloration des tétramères et l’analyse cytométrique en flux des cellules mononucléées du sang périphérique pour la quantification longitudinale des réponses des lymphocytes T endogènes chez des souris vaccinées avec des nanoparticules.

Les étapes impliquées dans la synthèse de ICMVs sont illustrés sur la figure 1 6. En bref, un film lipidique contenant des médicaments lipophiles ou des colorants fluorescents est hydraté en présence de médicaments hydrophiles. Les cations divalents, tels que Ca2 +, sont ajoutés pour conduire la fusion de liposomes anioniques dans des vésicules multilamellaires. Dithiol agent de reticulation, tel que le DTT, est ajoutée aux lipides à fonction maléimide &quot;discontinues&quot; appo...

Nous décrivons des techniques basées sur l’imagerie de l’animal entier et la cytométrie en flux pour surveiller l’expansion des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène en réponse à l’immunisation par des nanoparticules dans un modèle murin de vaccination.

Imagerie animal entier et cytométrie de flux techniques pour T CD8 + Analyse des réponses spécifiques de l&#39;antigène de cellule après nanoparticules vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de synthétiser et de caractériser des nanoparticules vaccinales à base de lipides, puis d'évaluer leur capacité à induire une expansion in vivo de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de l'antigène. Ceci est réalisé en concevant des vésicules multilamellaires interbilayées réticulées, ou ICMV, imitant un agent pathogène et chargées simultanément d'un antigène et d'un adjuvant, afin de vacciner des souris naïves. Transfert adoptif de lymphocytes T CD8 positifs, spécifiques de l'antigène et exprimant la luciférase.Dans la deuxième étape, l'expansion des lymphocytes T CD8 positifs spécifiques de l'antigène est évaluée par imagerie in vivo sur l'animal entier. Les cellules mononucléées du sang périphérique, prélevées chez les animaux immunisés contre l'ICMV, sont ensuite marquées avec des tétramères marqués au fluorochrome et analysées par cytométrie en flux afin de quantifier la fréquence des lymphocytes T CD8 positifs spécifiques de l'antigène endogène au sein du compartiment systémique. Enfin, l'imagerie bioluminescente peut être utilisée pour suivre l'expansion des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de l'antigène en réponse à la vaccination par nanoparticules.Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions préliminaires essentielles dans la conception de vaccins, telles que l'ampleur de l'expansion des lymphocytes T cytotoxiques et la manière dont ces cellules migrent vers divers tissus en réponse à une vaccination par nanoparticules. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'analyse in-situ des lymphocytes T après nécropsie tissulaire, est que l'imagerie in vivo de la réponse des lymphocytes T est non invasive. Permettant ainsi un suivi longitudinal du même animal, commencez par mélanger un rapport molaire un pour un de DOPC et de MPB dans du chloroforme, en maintenant une quantité totale de lipides de 1,26 micromole par lot dans un flacon en verre de 20 millilitres.Ensuite, ajoutez le cargo lipophile à la solution lipidique à la concentration souhaitée et purgez la solution avec un excès d'azote gazeux sec afin d'éliminer complètement le solvant organique. Placez l'échantillon sous vide pendant la nuit, puis, le lendemain matin, ajoutez 200 microlitres d'une solution de BTP 10 millimolaire contenant le cargo hydrosoluble d'intérêt pour hydrater le film lipidique ; vortexez la solution obtenue pendant 10 secondes toutes les 10 minutes, pendant une heure à température ambiante. Transférez ensuite le contenu dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.Placez ensuite le tube dans un bain d’eau glacée avec une sonication continue en utilisant le réglage d’intensité à 40 % sur un sonicateur de 125 watts équipé d’une sonde à pointe de 20 kilohertz. Après cinq minutes, ajoutez quatre microlitres de DTT à 150 millimolaire dans le tube, vortexez pour homogénéiser, puis centrifugez brièvement l’échantillon dans une microcentrifugeuse. Ensuite, ajoutez 40 microlitres de chlorure de calcium à 200 millimolaire à l’échantillon, puis effectuez la réticulation des couches lipidiques contenant le MPB avec le DTT à 37 degrés Celsius pendant une heure.À la fin de l'incubation, centrifuger la solution trois fois en ajoutant 200 microlitres d'eau doublement distillée lors des deuxième et troisième centrifugations, afin d'éliminer le chlorure de calcium résiduel, le DTT non réagi et les composants cargos non encapsulés du surnageant. Après la dernière centrifugation, resuspendre les I CMVs dans 100 microlitres de pegol fraîchement préparé pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Puis laver les vésicules deux fois supplémentaires dans de l'eau doublement distillée.Resuspendre le culot final dans du PBS et conserver les VCI à quatre degrés Celsius. Pour caractériser les particules, mélanger la suspension froide de VCI avant de diluer un petit aliquot de l'échantillon dans un volume total d'un millilitre d'eau doublement distillée. Ensuite, placer les VCI dans une cuvette de zétamètre et utiliser un système de diffusion dynamique de la lumière et de mesure du potentiel zêta afin de déterminer la taille des particules, l'indice de polydispersité et le potentiel zêta des échantillons selon les instructions du fabricant.Pour isoler les cellules T CD8 positives exprimant la luciférase spécifiques aux ovules, commencez par prélever les spléens de souris transgéniques OT1-luciférase. Placez les tissus dans cinq millilitres de PBS glacé contenant 2 % de FBS, puis transférez-les dans une hotte de culture cellulaire.Utilisez le piston d'une seringue de trois millilitres pour broyer jusqu'à trois splènes simultanément à travers un tamis de 70 microns dans un tube conique de 15 millilitres. Rincez le piston et le tamis avec du PBS et du FBS à 2 %. Ensuite, amenez le volume total de la suspension cellulaire à 10 millilitres par rate.Déterminez le nombre total de cellules, puis centrifugez les cellules. Ensuite, utilisez un kit de sélection négative magnétique disponible dans le commerce pour isoler les cellules spléniques positives pour le CD eight conformément aux instructions du fabricant. Puis lavez les cellules T dans du PBS.Les compter et incuber deux à trois fois 10 puissance 5 de ces cellules dans 20 microlitres d'anticorps bloquant CD1632 de souris. Après 10 minutes, ajouter 20 microlitres d'anticorps anti-CD8a APC aux cellules pendant 30 minutes, puis évaluer la pureté de la population de lymphocytes T CD8 positifs isolés par billes magnétiques par cytométrie en flux. Ensuite, transférer de façon adoptive de 1 à 10 fois 10 puissance 5 lymphocytes T CD8 positifs OT1 luciférase dans des souris C57BL/6 albinos rasées naïves, en 200 microlitres de PBS, par injection intraveineuse dans la veine de la queue. 24 heures plus tard, administrer le vaccin au nombre approprié de jours suivant la vaccination.Injecter les animaux avec 150 milligrammes par kilogramme de Lucifer après 10 minutes, puis acquérir le signal de bioluminescence pendant cinq à 10 minutes à l’aide d’un système d’imagerie sur animal entier afin de visualiser les lymphocytes T OT1 Lucifer CD8 positifs pour déterminer le nombre de lymphocytes T CD8 positifs spécifiques de l’antigène au moment approprié. Après la vaccination, prélever environ 100 microlitres de sang chez les souris vaccinées par la technique de saignement sous-mandibulaire dans un tube revêtu d’EDTA potassium, puis retourner le tube plusieurs fois pour éviter la coagulation. Ensuite, transférer 100 microlitres de sang dans un tube de microcentrifugeuse et ajouter un millilitre de tampon de lyse CK.Après deux à trois minutes, centrifuger les cellules et éliminer le surnageant. Laver les PBMC restants dans un millilitre de tampon fax et bloquer la liaison non spécifique avec le CD 1632 comme vient de l'être démontré. Après 10 minutes, répartir la suspension cellulaire dans des tubes fax ronds de quatre millilitres et ajouter 20 microlitres de la solution H deux KB sur tétramère syn fécale PE à chaque échantillon selon les spécifications du fabricant.Après 30 minutes sur glace, ajoutez 20 microlitres du cocktail d'anticorps approprié à chaque échantillon expérimental, ainsi que les anticorps de contrôle uniques pour chaque étiquette tétramère ou anticorps fluoro four à chaque échantillon témoin. Enfin, après une autre incubation de 20 minutes, lavez tous les échantillons dans du tampon fax, redispensez les culots dans du tampon fax supplémenté avec DPI, puis analysez les échantillons par cytométrie en flux. Les CMV chargés conjointement avec des antigènes protéiques fluoro four et des colorants lipophiles fluorescents permettent la visualisation in vivo de la livraison d'antigènes et de nanoparticules. Par exemple, l'imagerie par microscopie confocale indique que l'antigène soluble administré par voie sous-cutanée à la base de la queue atteint les ganglions lymphatiques drainants dans les quatre heures suivant l'administration et est éliminé au bout de 24 heures.En revanche, les I CMV surchargés sont d'abord détectés au niveau de la périphérie des ganglions lymphatiques drainants à 24 heures après l'administration, avec une accumulation continue conduisant à un important dépôt d'I CMV ova au sein du tissu lymphatique drainant. Dès le quatrième jour, l'imagerie de bioluminescence de souris C57BL/6 ayant reçu une transfusion adoptive de cellules T CD8 positives exprimant OT1-luciférase le jour de la vaccination montre un niveau de fond minimal de cellules T OT1-luciférase au quatrième jour suivant la vaccination. Toutefois, les souris immunisées avec les I CMV ova MPI présentent un signal de bioluminescence intense au niveau des ganglions lymphatiques inguinaux drainants.Les souris vaccinées avec l'ova soluble montrent, en revanche, une expansion nettement réduite des cellules T CD8 positives OT1 Lucifer dans les ganglions lymphatiques drainants. De plus, les souris immunisées avec l'ova soluble et le MPLA, sans transfert adoptif de cellules T spécifiques de l'antigène, n'exhibent pas d'expansion appréciable de cellules T CD8 positives spécifiques de l'ova, comme l'indique le suivi hebdomadaire des PBMC. La vaccination ICMV, cependant, induit une réponse endogène de cellules T CD8 positives significativement plus forte, atteignant un pic de 28 % de cellules T tétramères spécifiques de l'ova parmi le compartiment des cellules T CD8 positives au sein des PBMC au jour 41. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la synthèse des nanoparticules à base lipidique, de la réalisation des immunisations, ainsi que de la visualisation et de la quantification de l'expansion des lymphocytes T cytotoxiques in vivo.Ces méthodes peuvent être davantage modifiées afin de révéler des informations supplémentaires sur la réponse CTL. Par exemple, l'essai de coloration teer peut être complété par des marqueurs supplémentaires tels que CD127, BCL2 et KLRG1 afin d'évaluer le phénotype de mémoire des cellules.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dans cet article, nous décrivons une méthode utilisant multi-spectrale cytométrie de flux d'imagerie pour quantifier l'internalisation des nanoparticules ou des bactéries polyanhydride par des cellules RAW 264.7.

Analyser l&#39;internalisation cellulaire de nanoparticules et de bactéries multi-spectrale par cytométrie de flux d&#39;imagerie

Cette vidéo décrit un protocole permettant d’isoler des lymphocytes T CD8+ spécifiques à des antigènes rares à l’aide de cellules présentatrices d’antigènes artificielles (aAPCs) à base de nanoparticules magnétiques fonctionnalisées avec des Ig-CMH chargées de peptides antigéniques et des anticorps anti-CD28. L’interaction des aAPCs avec les lymphocytes T CD8+ exprimant spécifiquement les récepteurs des lymphocytes T ciblant les peptides antigéniques, suivie de leur expansion in vitro, entraîne...

Enrichissement et expansion à base de nanoparticules de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène

Cette vidéo présente un test permettant d’analyser les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène à différentes étapes du cycle cellulaire. Les cellules viables marquées par fluorescence sont sélectionnées à l’aide de la cytométrie en flux, et les cellules des différentes étapes du cycle cellulaire sont identifiées par leur contenu en ADN à l’aide d’anticorps contre les protéines nucléaires associées à la prolifération cellulaire et d’une coloration d’acide nucléique.

Un test pour l’analyse du cycle cellulaire des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène

La vidéo présente une méthode immunologique pour surveiller in vivo la production de lymphocytes T cytotoxiques induits par l’adjuvant. Une souris est pré-injectée avec des lymphocytes T CD8+ de donneur génétiquement modifiés et colorés par un colorant prolifératif. L’injection sous-cutanée d’ovalbumine avec des adjuvants génère des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques qui sont identifiés après la récolte par immunomarquage et cytométrie en flux.

Une technique immunologique pour surveiller la génération de lymphocytes T cytotoxiques médiés par adjuvant

L'analyse de l'interaction des nanoparticules avec des sous-populations de cellules immunitaires définies par cytométrie de flux.

Détection de nanoparticules fluorescentes Interactions avec immunitaire primaire sous-populations de cellules par cytométrie en flux

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Validation des Nanobodies et Anticorps Based<em&gt; In Vivo</em&gt; Expériences tumeur xénogreffe NIRF-imagerie dans des souris en utilisant<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cytométrie en flux et microscopie

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Lymphocytes T antigène-spécifiques sont difficiles à caractériser ou utiliser dans les thérapies en raison de leur fréquence extrêmement basse. Ici, nous fournissons un protocole visant à développer une particule magnétique qui peut lier aux cellules T spécifiques de l’antigène à enrichir ces cellules, puis d’en faire plusieurs techniques pour la caractérisation et le traitement.

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L’expansion clonale est une caractéristique clé de la réponse des lymphocytes T spécifiques à l’antigène. Cependant, le cycle cellulaire des lymphocytes T répondant à l’antigène a été mal étudié, en partie à cause de limitations techniques. Nous décrivons une méthode de cytométrie en flux pour analyser les lymphocytes T CD8 spécifiques de l’antigène à expansion clonale dans la rate et les ganglions lymphatiques de souris vaccinées.

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In vitro Évaluation de l’activité cellulaire de l’adjuvant du vaccin à nanoémulsion ophiopogonine D

Découvrez la synthèse de nanoparticules vaccinales lipidiques pour évaluer l'expansion des lymphocytes T CD8+ spécifiques d'antigène chez la souris. Cette méthode combine imagerie bioluminescente et cytométrie en flux.

Imagerie animal entier et cytométrie de flux techniques pour T CD8 + Analyse des réponses spécifiques de lantigène de cellule après nanoparticules vaccination (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie animal entier et cytométrie de flux techniques pour T CD8 + Analyse des réponses spécifiques de l'antigène de cellule après nanoparticules vaccination

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