Imagerie animal entier et cytométrie de flux techniques pour T CD8 + Analyse des réponses spécifiques de l'antigène de cellule après nanoparticules vaccination

Nous décrivons des techniques basées sur l’imagerie de l’animal entier et la cytométrie en flux pour surveiller l’expansion des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène en réponse à l’immunisation par des nanoparticules dans un modèle murin de vaccination.

L’objectif général de l’expérience suivante est de synthétiser et de caractériser des nanoparticules vaccinales à base de lipides et d’évaluer leur capacité à provoquer une expansion des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de l’antigène in vivo. Ceci est réalisé en concevant des agents pathogènes imitant des vésicules multilamiques inter-bicouches, réticulées ou des CMV I co-chargés d’antigène et d’adjuvant pour la vaccination des souris naïves. Transféré adoptivement avec la luciférase exprimant des lymphocytes T CD spécifiques de l’antigène.

Dans un deuxième temps, l’expansion des lymphocytes T positifs CD huit spécifiques de l’antigène est évaluée par imagerie in vivo chez l’animal entier. Les cellules mononucléées du sang périphérique prélevées sur les animaux immunisés à l’ICMV sont ensuite colorées avec des tétramères marqués par fluorescence et analysées par cytométrie en flux pour quantifier la fréquence des cellules T positives CD huit spécifiques de l’antigène endogène dans le compartiment systémique. En fin de compte, l’imagerie bioluminescente peut être utilisée pour suivre l’expansion des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de l’antigène en réponse à la vaccination des nanoparticules.

Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions préliminaires clés dans la conception d’un vaccin, telles que l’étendue de l’expansion des lymphocytes tiaux cytotoxiques et comment ces cellules se déplacent-elles vers divers tissus en réponse à la vaccination par nanoparticules ? Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l’analyse in situ des lymphocytes T après nécropsie tissulaire, est que l’imagerie in vivo de la réponse des cellules TT est non invasive. Commencer par mélanger un rapport molaire de un à un de DOPC et de MPB dans du chloroforme, en maintenant une quantité totale de lipides de 1,26 micromole par lot dans un flacon en verre de 20 millilitres.

Ensuite, ajoutez une cargaison lipophile à la solution lipidique à la concentration souhaitée et purgez la solution avec de l’azote gazeux extra sec pour éliminer complètement le solvant organique. Placez l’échantillon sous vide pendant la nuit du lendemain matin à 200 microlitres de BTP de 10 millimolaires contenant la cargaison soluble dans l’eau d’intérêt pour hydrater le vortex de film lipidique la solution résultante pendant 10 secondes toutes les 10 minutes pendant une heure à température ambiante. Transférez ensuite le contenu dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre.

Ensuite, placez le tube dans un bain d’eau glacée avec sonication continue en utilisant le réglage d’intensité de 40 % sur un soat à pointe de sonde de 125 watts et 20 kilohertz. Après cinq minutes, ajoutez quatre microlitres de DTT de 150 millimolaires dans le vortex du tube pour mélanger et faire tourner l’échantillon dans une micro-centrifugeuse. Ensuite, mélangez 40 microlitres de chlorure de calcium de 200 millimolaires dans l’échantillon, suivi d’une réticulation du MPB contenant des couches lipidiques avec du DTT à 37 degrés Celsius pendant une heure.

À la fin de l’incubation, faire tourner la solution trois fois à 200 microlitres d’eau double distillée lors de la deuxième et de la troisième centrifugation pour éliminer le chlorure de calcium restant non réagi DTT et les matériaux de cargaison non encapsulés du surnageant. Après le dernier tour, nous suspendons les CMV I dans 100 microlitres de pegol fraîchement préparés pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les vésicules deux fois de plus dans de l’eau distillée doublement.

Suspension de la pastille finale dans PBS et stockage de l’ICM VS à quatre degrés Celsius. Pour caractériser les particules, mélanger la suspension froide d’ICMV avant de diluer une petite aliquote de l’échantillon dans un volume total d’un millilitre d’eau distillée doublement. Placez ensuite les CMV I dans une cellule de mesure de la zidéca et utilisez un système de mesure dynamique de la diffusion de la lumière et du potentiel zêta pour mesurer la taille des particules, l’indice de polydispersité et le potentiel zêta des échantillons selon les instructions du fabricant.

Isoler la luciférase spécifique de l’ovule exprimant des lymphocytes T CD huit positifs. Récoltez d’abord la rate de souris transgéniques OT one luciférase. Placez les tissus dans cinq millilitres de PBS glacé et 2 % FBS, puis dans une hotte de culture tissulaire.

Utilisez le piston d’une seringue de trois millilitres pour broyer jusqu’à trois rates à la fois à travers une passoire de 70 microns dans un tube conique de 15 millilitres. Lavez le piston et la passoire avec du PBS et 2 %FBS. Amenez ensuite le volume total de la suspension cytaire à 10 millilitres par rate.

Déterminez le nombre total de cellules, puis faites tourner les cellules. Ensuite, utilisez un kit de sélection magnétique négative disponible dans le commerce pour isoler les cellules positives de la rate CD selon les instructions du fabricant. Ensuite, lavez les lymphocytes T dans du PBS.

Comptez-les et incubez deux à trois fois 10 à 10 à cinquième des cellules dans 20 microlitres d’anticorps bloquant le CD 1632 de souris. Après 10 minutes, ajoutez 20 microlitres d’anticorps PC anti CD huit A aux cellules pendant 30 minutes et évaluez la pureté de la population de cellules T positives CD huit isolées par bille magnétique par cytométrie en flux. Ensuite, transférez adoptivement un à 10 fois 10 au cinquième OT une luciférase CD huit cellules T positives dans six souris noires albinos naïves rasées et cinq, dans 200 microlitres de PBS par injection intraveineuse dans la veine de la queue 24 heures plus tard, administrez le vaccin au nombre approprié de jours après la vaccination.

Injectez aux animaux 150 milligrammes par kilogramme de Lucifer après 10 minutes, acquérez le signal de bioluminescence pendant cinq à 10 minutes avec un système d’imagerie animal entier pour visualiser l’OT un Lucifer CD huit cellules T positives pour déterminer le nombre de cellules T positives CD spécifiques à l’antigène au moment approprié. Après la vaccination, prélever environ 100 microlitres de sang sur les souris vaccinées par la technique de saignement sous-mandibulaire dans un tube recouvert d’EDTA de potassium, retourner le tube plusieurs fois pour empêcher la coagulation. Transférez ensuite 100 microlitres de sang dans un microtube de centrifugation et ajoutez un millilitre d’un tampon de lyse CK.

Après deux à trois minutes, centrifugez les cellules et retirez le surnageant. Lavez le pbmc restant dans un millilitre de tampon de fax et bloquez la liaison non spécifique avec le CD 1632 comme nous venons de le démontrer. Après 10 minutes, divisez la suspension cellulaire en tubes de télécopie à fond rond de quatre millilitres et ajoutez 20 microlitres de H deux KB sur une solution de PE fécale de tétramère syn à chaque échantillon selon les spécifications du fabricant.

Après 30 minutes sur la glace, ajoutez 20 microlitres du cocktail d’anticorps approprié à chaque échantillon expérimental et les anticorps de contrôle fluorés quatre pour chaque tétramère ou anticorps fluorés à quatre marqueurs à chaque échantillon témoin. Enfin, après une autre incubation de 20 minutes, laver tous les échantillons dans un tampon de fax, remettre en suspension les pastilles dans un tampon de fax complété par DPI et analyser les échantillons par cytométrie en flux I Les CMV co-chargés d’antigènes protéiques à quatre tact fluorés et de colorants lipophiles fluorescents permettent de visualiser l’administration d’antigènes et de nanoparticules in vivo. Par exemple, l’imagerie par microscopie confocale indique que l’antigène soluble délivré par voie sous-cutanée à la base de la queue atteint les ganglions lymphatiques drainants dans les quatre heures suivant l’administration et est éliminé dans les 24 heures.

En revanche, les CMV I surchargés sont détectés pour la première fois à la périphérie des ganglions lymphatiques drainants 24 heures après l’administration, avec une accumulation continue qui entraîne un dépôt important d’OVLES I CMV dans le tissu lymphatique drainant. Au quatrième jour, en effet, l’imagerie par bioluminescence de six souris C 57 BL transférées adoptivement avec OT un Luciférase CD huit lymphocytes T positifs le jour de la vaccination démontre un niveau de fond minimal de lymphocytes T OT une luciférase au quatrième jour après la vaccination. Cependant, les souris immunisées avec les CMV MPI ovales présentent un signal de bioluminescence robuste dans les ganglions lymphatiques inguinaux drainants.

Les souris solubles vaccinées contre les ovules, en revanche, présentent une expansion beaucoup plus réduite des cellules T positives OT one Lucifer CD eight dans les ganglions lymphatiques drainants. De plus, les souris immunisées avec des ovules solubles et du MPLA sans aucun transfert adoptif d’antigène Les lymphocytes T spécifiques ne présentent pas une expansion appréciable des lymphocytes T CD-8 positifs spécifiques aux ovules, comme l’indique la surveillance hebdomadaire de la vaccination par l’ICMV pbmc, mais elle provoque une réponse significativement plus forte et endogène des lymphocytes T positifs pour le tétramère fécal atteignant un pic de 28 % des lymphocytes T positifs pour le tétramère fécal syn dans le compartiment des lymphocytes T positifs pour le lymphome CD-VII chez les PBMC au jour 41. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de synthétiser des nanoparticules à base de lipides, d’effectuer des immunisations et de visualiser et quantifier l’expansion des CTL in vivo.

Ces méthodes peuvent être modifiées pour révéler des informations supplémentaires sur la réponse CTL. Par exemple, l’essai de coloration teer peut être complété par des marqueurs supplémentaires tels que CD 1 27, BCL deux et K lrg un pour évaluer le phénotype de mémoire des cellules.