Name: Foie conservation et de récupération fonctionnelle humaine par des moyens de Subnormothermic machine à perfusion (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Découvrez la perfusion machine sous-normothermique du foie humain à 21 °C pour la préservation et l'évaluation fonctionnelle. Cette méthode permet de récupérer l'activité métabolique et la production biliaire tout en réduisant les demandes énergétiques.

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L&#39;utilisation de tissus humains doit être examiné par un comité d&#39;examen institutionnel (IRB) ou équivalent. Le travail décrit ici a été approuvé et déclaré exemptés par le Conseil du Massachusetts General Hospital institutionnel de révision (n ° 2011P001496). 1. Solution Préparation <ol><li> Ajouter stérilement suppléments au phénol milieu E de Williams exempt de rouge, comme indiqué dans le tableau 1. La solution doit être préparé avant l&#39;utilisation. L&#39;insuline doit être ajouté juste avant l&#39;utilisation. </li></ol> 2. Retour Table Préparation du foie <ol><li> Passer une cuvette d&#39;organes rempli de glace sur une surface stérile, drapé. Retirer le foie de la boîte, laissant dans le sac de solution de conservation par le froid. Gardez le foie essentiellement submergé. </li><li> Identifier l&#39;artère hépatique (HA), qui se trouve en aval de la plaque aortique. Disséquer gratuitement l&#39;artère pour révéler différentes branches coupées le long de la longueur à l&#39;aide des ciseaux de Metzenbaum. Disse soigneusementct toute la longueur de l&#39;artère afin d&#39;éviter la rupture d&#39;un récipient qui alimente le foie. Ne pas couper ou attacher les branches qui ne ont pas de fin visible. </li><li> Attacher les branches artérielles alimentant pas le foie en utilisant une suture de soie taille allant de 0 à 4-0, en fonction de la taille du navire. Fermer branches qui sont trop courts pour attacher ou des trous dans l&#39;artère avec un point de prolène 7-0. Nouer et couper les artères gastriques spléniques et gauche à proximité de leur origine sur le tronc cœliaque. </li><li> Retirer le patch aortique en coupant le tronc cœliaque directement sous le patch. Cathétériser du tronc cœliaque utilisant la canule aortique. </li><li> Identifier la veine porte (PV) et carrément disséquer libre. Nouez les branches et canuler PV avec le segment prêt de la taille 24 tube. </li><li> Supprimer des sections de membrane de la veine cave sus-hépatique, sans couper la veine elle-même. Sortie de la veine cave drains directement dans la chambre d&#39;organe. </li><li> Couper 2 pleine circonférence tiSSUE échantillons (2-3 mm de longueur) de l&#39;extrémité de la voie biliaire principale; pression geler une dans l&#39;azote liquide (conserver à -80 ° C) et stocker l&#39;autre dans 10% de formol tamponné, pour le tissu et l&#39;analyse histologique, respectivement. Cathétériser le canal biliaire commun avec la canule de récipient et un tube de drainage en tube d&#39;oxygénateur à membrane. </li><li> Identifier et ligaturer le canal cystique avec une cravate de soie 0. Le canal cystique se trouve entre le canal cholédoque et la vésicule biliaire. </li><li> Raccordez le tube de rinçage réglé sur des sacs de glace froide de (LR) la solution de Ringer lactate et amorcer la tubulure, en supprimant tout l&#39;air. </li><li> Réglez le régulateur de débit sur le tube de rinçage à un mince filet. Avant de brancher les tuyaux au ras de la canule de la veine porte, obturer la veine porte avec les doigts au niveau du hile et de remplir la canule et la veine avec chasse d&#39;eau pour éliminer l&#39;air de la veine porte. Ne soulevez pas le sac plus de 20 cm sur la hauteur du foie au cours rinçage froide pour éviter une pression excessive sur leveine. </li><li> Au cours de l&#39;arroser brièvement occlure le PV au point le plus bas. Examinez le PV de fuites. Navire branches peuvent être obturés de la manière décrite ci-dessus. Rincez le foie par le PV avec un total de 2 litres de glace froide LR. </li><li> Répétez les étapes 2,10, 2,11 pour la HA avec 1 L de LR. </li></ol> 3. Amorçage du système SNMP <ol><li> Le premier dispositif de perfusion par addition de 2 L de liquide de perfusion (21 ° C) à la cuvette de l&#39;organe et le dispositif à partir du premier tube. Suivez les instructions de l&#39;appareil pour se préparer à la perfusion, réglage de la température à 21 ° C. Commencer avec des pressions de 3 mmHg et 30 mmHg à la PV et HA, respectivement. Ouvrez le réservoir de gaz et mettre à un flux de 3 L / min. </li><li> Prélever un échantillon de gaz du sang de l&#39;entrée à la fois HA et PV par prélèvement d&#39;un échantillon à partir des ports de l&#39;échantillon 0,3 ml et en l&#39;exécutant dans la machine d&#39;analyse des gaz du sang, selon les instructions du fabricant. Confirmez oxygénation adéquate (PO 2&gt; 700 mmHg) et le pH (7,35 à 7,45). </li><li> Avant le foie est relié prélever un échantillon du liquide de perfusion de 1,0 ml au = 0 mesure dans un tube Eppendorf et conserver à -80 ° C. Coupez deux ± 250 biopsies de coin mg de foie en utilisant une lame en acier à un seul tranchant; pression geler une dans l&#39;azote liquide (conserver à -80 ° C) et stocker l&#39;autre dans 10% de formol tamponné. Peser le foie avant perfusion. </li></ol> 4. foie humain Perfusion <ol><li> Transférer le foie à l&#39;appareil. Brancher l&#39;arrivée de PV à la canule de PV, après le retrait de l&#39;air de la PV comme dans l&#39;étape 2.10. Connectez le HA de la même façon. Réglez PV et la pression HA à 3 et 30 mmHg. Le foie doit être presque submergé par perfusion. Couvrir toutes les surfaces sèches, y compris les navires d&#39;afflux, avec de la gaze stérile humide pour éviter la déshydratation </li><li> Laisser le tube de drain de bile dans un récipient de collecte. Assurez-vous que l&#39;ouverture de la vidange biliaire est au niveau du foie ou inférieure pour permettre la bile pour exécuter out librement. </li><li> les débits cibles sont respectivement de 275 à 325 ml / min.kg et 50-100 ml / PV min.kg pour la HA et une fois que le foie est réchauffée à 21 ° C. Puisque chaque foie réagit différemment à la perfusion, surveiller le flux de près pendant les premières minutes. Augmenter ou diminuer la pression sur l&#39;un des navires si les débits cible ne sont pas atteints. Ne pas dépasser 50 mmHg sur le HA et 5 mmHg sur le PV. </li><li> Les échantillons peuvent être prélevés sur le tissu du foie, de la bile et perfusat à la préférence des chercheurs. Nous recommandons au minimum la collecte échantillon régime suivant pendant la perfusion. <ol><li> biopsies tissulaires, n = 2 x 250 mg, toutes les heures. Stockage: snap geler une dans de l&#39;azote liquide et conserver à -80 ° C à long terme. En outre, prendre une autre biopsie avant et après la perfusion et fixer 10% de formol tamponné (n = 1) </li><li> Échantillons de perfusat, n = 2x 1 ml toutes les 15 minutes pendant la première heure et ensuite toutes les 30 min. Prélever des échantillons de l&#39;inf PVfaible port échantillon. Stockage: -80 ° C à long terme. </li><li> l&#39;analyse des gaz du sang des PV et HA entrées, sorties et la veine cave. n = 3 x 0,3 ml toutes les 30 min. Prélever des échantillons à la fois du PV et les ports d&#39;échantillonnage HA. Dessinez un échantillon de la veine cave 0,3 ml en insérant une seringue dans la veine et exécuter directement dans l&#39;analyseur des gaz du sang. Utilisez la sortie pour assurer l&#39;oxygénation et le pH adéquat. </li><li> La production de bile, n = 1 x 1 ml, chaque heure. Visuellement quantifier la production de bile toutes les heures et prélever un échantillon du récipient de collecte. Renouveler le récipient après l&#39;échantillonnage. Stockage: la glace sèche et -80 ° C à long terme. </li></ol></li><li> Continuer perfusion pendant 3 heures. Surveillance de la pression, le pH et l&#39;oxygénation et le prélèvement d&#39;échantillons dans l&#39;ensemble. Ajuster le pH il par addition de bicarbonate de sodium à la solution de perfusion. </li><li> A la fin de la perfusion prendre les échantillons finals tandis que le foie est perfusé. Débranchez le foie et enlever la canule de la voie biliaire. Prenez deux échantillons de tissus post-perfusion de lavoie biliaire comme décrit précédemment pour le stockage à -80 ° C et à 10% de formaline tamponnée. </li><li> Jeter le foie humain en suivant les directives d&#39;élimination des déchets contaminés. </li></ol>

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</ol>

Drs. ÊTRE Uygun, K Uygun et Yarmush sont des inventeurs sur un brevet en instance qui est pertinent pour cette étude (WO / 2011/002926), et les Drs. ÊTRE Uygun, K Uygun et Yarmush sont des inventeurs sur un brevet en instance qui est pertinent pour cette étude (WO / 2011/35223). Drs. K Uygun Bruinsma ont une demande de brevet provisoire relatives à ces travaux. Dr K Uygun et BE Uygun ont un intérêt financier dans Organ Solutions, une société axée sur le développement de technologies de conservation d&#39;organes. Dr K Uygun et IL les intérêts de UYGUN sont gérés par le MGH et Partners HealthCare en fonction de leur politiques de conflit d&#39;intérêt.

Dans une tentative pour récupérer le foie blessés pendant l&#39;ischémie nous avons développé un système de SNMP qui peut être utilisé après une période de stockage de froid. Subnormothermic machine à perfusion offre une alternative viable au stockage à froid classique, ainsi que les modalités machine à perfusion d&#39;hypothermie et normothermiques. Divers systèmes différents existent; tous offrent différents avantages et inconvénients 3,9,20. SNMP permet une perfusion sans un transporteur d&#39;oxygène, comme les demandes métaboliques de l&#39;oxygène à 21 ° C sont satisfaits par l&#39;oxygénation active de la perfusion. Bien que réduite dans des conditions subnormothermic, le métabolisme est important et nécessite le soutien d&#39;une solution de perfusion riche en éléments nutritifs. Solutions pour perfusions traditionnels, tels que la solution de perfusion appareil Belzer, sont généralement minimes dans la composition et sont conçus pour perfusion froid. Moyen E de Williams a été utilisé comme milieu de culture d&#39;hépatocytes pendant de nombreuses années, et contient des composantes qui sont universels pour soutenir la fonction cellulaire, en particulier des conditions ex vivo chaudes. Les mesures effectuées au cours de la perfusion appareil sont le reflet de la fonction de l&#39;organe. Paramètres directement observables telles que la production de bile et la consommation d&#39;oxygène sont des mesures en temps réel qui peuvent être utilisés pour évaluer le foie pré-transplantation. De même, les marqueurs de lésions cellulaires et l&#39;ischémie (K +, la libération de lactate) peuvent être mesurés directement dans la solution de perfusion et peuvent être le signe de la fonction des organes 20. Comme la technologie machine à perfusion développe davantage et réalise l&#39;application clinique plus répandue, des corrélations précises entre ex vivo la fonction et les résultats cliniques peuvent être faites et les paramètres de perfusion seront utiles en aidant les décisions de transplantation ou rejeter foies de qualité marginale. En outre, comme point de soins outils analytiques avance, une analyse plus sophistiquée sera disponible directement lors de la machine perfusion 21. Dans ce travail, nous montrons que le foie peuvent être pris en charge dans le système SNMP avec des blessures minimes au foie, réfléchie par l&#39;histologie et la libération de ALT. La récupération fonctionnelle du foie est mieux reflétée par l&#39;ATP, qui se est révélé être en corrélation à la viabilité du foie et suggère fortement du succès de la transplantation chez des modèles animaux 22. Ex vivo et la récupération pré-transplantation de greffons de foie permettrait une expansion importante du donneur piscine du foie, la correction de la disparité entre l&#39;offre et la demande de foies de donneurs en transplantation.

La transplantation hépatique est le seul traitement curatif pour des dizaines de milliers de patients qui souffrent de maladies du foie en phase terminale. Pour faciliter une transplantation réussie, une conservation optimale du foie à partir du moment qu&#39;il est obtenu à partir du donneur jusqu&#39;au moment où il est implanté chez le receveur est nécessaire pour éviter une détérioration rapide de la greffe. La norme actuelle pour la conservation du foie est appelé «stockage à froid statique&quot;: le foie est refroidi dans une solution de conservation glacée, ce qui réduit le métabolisme du foie et de ralentir les effets délétères de l&#39;ischémie. Bien que cette technique de stockage à froid a permis de transplantation réussie, organes de qualité marginale tels que les organes DCD endommagés par l&#39;ischémie chaude ou stéatose spectacle patients inférieure résultats 1. Il ya un corps en pleine expansion de la preuve que l&#39;ex vivo machine à perfusion de greffes du foie comme la préservation modalité alternatives peuvent potentiellement improuver résultats pour ces organes marginaux 2,3. La transplantation hépatique est devenu victime de son propre succès. Beaucoup plus de patients sont référés à la transplantation de foie il ya disponibles, et des milliers meurent sur la liste d&#39;attente aux États-Unis chaque année. Compte tenu de la réalité de la pénurie de foie de donneurs et de l&#39;utilisation croissante des greffes de foie de qualité optimale pour les bénéficiaires nécessiteux, il est largement admis que ex vivo machine à perfusion de greffes de foie avant l&#39;implantation détient la promesse d&#39;un changement de paradigme dans la transplantation du foie. Il ya eu une augmentation marquée de l&#39;intérêt de la recherche dans ce sujet au cours des dernières années 4-8. Dans divers centres européens et nord-américains la machine hypothermie perfusion a fait une introduction 8 et normothermique machine à perfusion clinique à des températures physiologiques a été récemment appliquée à foies humains mis au rebut et est en cours de traduction à l&#39;utilisation clinique ainsi neuf.Le développement intensif a conduit à l&#39;élaboration de divers protocoles, tandis que l&#39;optimisation continue identifie la perfusion optimale paramètres 10-12. Utilisation de greffons de qualité marginale a augmenté de plus de 10 fois au cours de la dernière décennie 13. En comparaison avec la norme actuelle pour la préservation du foie (de stockage à froid statique), ex vivo machine à perfusion offre de nombreux avantages potentiels, qui résultent toutes de l&#39;expansion tant besoin de la piscine d&#39;organes et une baisse potentiellement l&#39;incidence des complications post-transplantation. En particulier, les complications biliaires qui affligent actuellement greffes de foie optimale de qualité après la transplantation restent une question substantielle 14-18. perfusion de la machine dans des conditions subnormothermic fournit une fenêtre de temps pour évaluer la fonction du greffon objective quant à la convenance pour la transplantation 19. Bien que le foie est perfusé dans un circuit ex vivo, à la fois un perfusate la bile produite pendant la perfusion peut être échantillonné pour la mesure des marqueurs de la fonction d&#39;organe. De cette façon, «gravement compromis» foies qui sont jetés à la transplantation dans les critères actuels peuvent être objectivement évaluées quant à leur aptitude à la transplantation. évaluation de la viabilité permet potentiellement de plusieurs de ces organes à être utilisés pour la transplantation. Un avantage tout aussi puissant de la machine perfusion est la réparation et l&#39;amélioration des foies qui ont été endommagés par l&#39;ischémie chaude / froide. ATP est épuisée très rapidement au cours de l&#39;ischémie chaude et froide et subséquent peut être repleted pendant une période de machine à perfusion avant l&#39;implantation du foie 20. Le foie, avec ses réserves d&#39;énergie et l&#39;état métabolique reconstitué, est un préconditionnement et être mieux préparés pour les effets dommageables des lésions de reperfusion après implantation chez le receveur. Ce travail décrit une méthode de perfusion ex vivo la machine de graf de foie humaints dans le laboratoire, qui sera utile pour les chercheurs qui souhaitent étudier à la fois la technique et les effets bénéfiques de l&#39;ex vivo machine à perfusion. Nous faisons usage de foies de donneurs humains qui ont été refusées pour la transplantation et sont ensuite attribués à des fins de recherche. Norme technique de passation des marchés du foie consiste à fleur artérielle situ du foie après clampage aortique dans le cerveau donneurs décédés (DBD) ou après un arrêt circulatoire chez les donneurs de mort circulatoires (DCD), décrites plus en détail ailleurs 20. En outre, le foie est refroidi lors de la passation en remplissant la cavité abdominale du donneur avec de la glace. Préférences de solution de rinçage varient entre les régions, la majorité des achats à l&#39;aide de l&#39;Université du Wisconsin ou histidine-tryptophane-cétoglutarate (HTK) solution. Un retour table de rinçage supplémentaire de la veine porte améliore le lessivage de sang résiduel. Livers sont souvent achetés en laissant un segment sur aortiquearrondissant le tronc cœliaque. La vésicule biliaire est incisée, la bile est aspiré, et le canal biliaire est rincé. Les foies sont emballés dans des sacs stériles contenant une solution de conservation glacée et transportés dans des caisses ou des refroidisseurs désignés. Pour obtenir des résultats représentatifs temps d&#39;ischémie chaude et froide doit être limitée à 60 min et 12 h, respectivement. Malgré le dépistage sérologique de routine pour les agents pathogènes transmissibles, les précautions standard doivent être prises lors de la remise des organes humains, des échantillons obtenus à partir d&#39;organes humains, et tous les produits de déchets. Le protocole décrit ici subnormothermic perfusion de la machine en utilisant un dispositif de perfusion de foie disponible dans le commerce. Utilisation d&#39;un tel dispositif permet plus de traduction rapide à la clinique et la validation croisée de différents protocoles et paramètres de l&#39;appareil parmi les groupes de recherche et des centres de transplantation.

<table><tbody><tr><td>Dispositif de perfusion Liver Assist</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>Liver Assist</td><td></td></tr><tr><td>Liver Assist set jetable</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>Liver Assist jetable</td><td></td></tr><tr><td>Williams' Medium E</td><td>Sigma</td><td>W1878&ndash ; 6x500ml</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Eli Lilly & Co</td><td>Humulin R U-100</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine 5 000 U/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-156</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Pharmacie MGH</td><td>7750500</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir de gaz Carbogen 95 % O2/5 % CO2</td><td>Airgas</td><td>ZO2OX9522000043</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur de gaz spéciaux</td><td>Airgas</td><td>Y11244D580</td><td></td></tr><tr><td>Lactate Ringer' s solution</td><td>Baxter</td><td>2B2324X</td><td></td></tr><tr><td>10 % neutre tamponné formol</td><td>Fischer Scientific</td><td>316-155</td><td></td></tr><tr><td>Pince Adson dentée</td><td>Roboz</td><td>RS-5234</td><td></td></tr><tr><td>Pince à tissus Debakey, 7.75 », 2.25 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-7562</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Metzenbaum 7 » Courbé SureCut Tungsten</td><td></td><td>Roboz RS-6965SC</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Porte-aiguille 5.5&ndash ; 7 pouces</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>0 sutures en soie tressée noire</td><td>Ethicon</td><td>SA66G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 suture en nylon, Nurolon RB1</td><td>Ethicon</td><td>C554D</td><td></td></tr><tr><td>Machine d’analyse des gaz du sang</td><td>Siemens</td><td>RapidPoint 500</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-10000-12</td><td></td></tr><tr><td>Boîte d’affichage de la pression</td><td>Medtronic</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>Medtronic</td><td></td><td>61000</td><td></td></tr><tr><td>Thermomètre à thermocouple portatif et sonde</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-91500-04 et EW-08516-55</td><td></td></tr><tr><td>Canule à récipient à pointe poivrée, 4 mm</td><td>Medtronic</td><td>30005</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’irrigation tuyau de chasse</td><td>Hospira</td><td>06543-01</td><td></td></tr><tr><td>Bol mélangeur, 4 L</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07300-40</td><td></td></tr></tbody></table>

foie conservation et de récupération fonctionnelle humaine par des moyens de subnormothermic machine à perfusion

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Il y a actuellement une grave pénurie de greffons hépatiques disponibles pour la transplantation. De nouvelles techniques de préservation des organes sont nécessaires pour élargir le bassin de foies de donneurs. La perfusion mécanique de greffons de foie de donneur est une alternative au stockage frigorifique traditionnel des foies et est très prometteuse en tant que modalité pour élargir le pool d’organes de donneur. Nous avons récemment décrit le bénéfice potentiel de la perfusion mécanique subnormothermique du foie humain. Les foies perfusés à la machine ont montré une amélioration de la fonction et la restauration des niveaux d’ATP dans les tissus. De plus, la perfusion mécanique de greffons hépatiques à des températures subnormothermiques permet une évaluation objective de la fonctionnalité et de l’aptitude d’un foie pour la transplantation. De cette façon, un grand nombre de foies qui avaient été précédemment jetés en raison de leur qualité sous-optimale peuvent être sauvés grâce aux effets réparateurs de la perfusion mécanique et utilisés pour la transplantation. Nous décrivons ici en détail cette technique de perfusion mécanique subnormothermique. Les greffons de foie humain alloués à la recherche sont perfusés via l’artère hépatique et la veine porte avec un perfusat oxygéné acellulaire à 21 °C.

Un certain nombre d&#39;observations et d&#39;analyses peut être effectuée sur le foie pendant la perfusion, y compris les observations en temps réel directes, comme les débits et la production de bile; mesures en temps réel, tels que l&#39;analyse des gaz du liquide de perfusion, et des mesures post-hoc qui sont faites après le prélèvement de l&#39;échantillon, y compris l&#39;analyse biochimique du liquide de perfusion et de tissus et l&#39;analyse histologique. Résultats mentionnés ici sont de 22 foies humains perfusés. Foies ont été rejetées pour la transplantation, pour diverses raisons, y compris l&#39;âge du donneur, excessive période d&#39;ischémie chaude, résultats de la biopsie (stéatose, l&#39;inflammation, fibrose) et pour des raisons logistiques. 18 foies ont été acquis après la mort cardiaque, et 4 suivant la mort cérébrale. Dans les deux cas, les donateurs ont été prétraités avec 30 000 unités d&#39;héparine et rincés in situ et sur la table de retour avec la solution UW. La durée moyenne d&#39;ischémie froide était 531 ± 237 (SD) min et le temps moyen d&#39;ischémie chaude était de 27 ± 10 (SD) min, mesuré à partir de retrait de la viesoutien au ras froid. Observations et mesures en temps réel peuvent être utilisés pour évaluer le foie pendant la perfusion, tandis que les mesures post-hoc sont révélés après la perfusion. Observations en temps réel L&#39;écoulement à travers le foie commence plus faible que les débits cible, à la suite d&#39;une résistance plus élevée dans le foie froid. En utilisant une pression de 3 mm de Hg sur la PV et 30 mmHg à la HA flux de cibles peuvent généralement être atteint dès que le foie est réchauffé à 21 &#160; ° C après 60 min de perfusion (figure 1A). La bile peut généralement être observé dans les 10 min de perfusion et est produit de façon constante au cours de la perfusion (figure 1B). quantité de bile dépend de la qualité du foie et varie de 0,3 ml / h / kg de foie à 18 ml / min / kg. Dans les foies avec plus de temps d&#39;ischémie chaude, écoulement de la bile aura tendance à diminuer, alors que les résultats de temps plus courtes chaudes ischémiques dans un plus stable, voire en augmentantla production de bile. Mesures en temps réel La mesure directe et fréquente du perfusat par analyse des gaz du sang dans essentiel à des fins expérimentales ainsi que le maintien des conditions de perfusion adéquates, surtout oxygénation et du pH. Pression partielle d&#39;oxygène dissous devrait être supérieure à 700 mm de Hg sur les entrées à la fois PV et le HA. pression d&#39;oxygène de sortie, mesurée dans la veine cave, diminue généralement avec plus perfusion, ce qui reflète une augmentation de l&#39;absorption d&#39;oxygène. taux d&#39;absorption d&#39;oxygène peut être calculée comme décrit précédemment 13 et à distance de 0,5 à 2,2 ml O 2 / min / kg au début de la perfusion de 2.4 à 9.7 ml de O 2 / min / kg à t = 3 heures (figure 1C). Une chute de pH est observée dans les 30 premières minutes (Figure 1D), principalement en raison de la libération de lactate dans le perfusat. Ceci peut être soutenu par la supplémentation avec bicarbo de sodium 8,4%Nate et après environ 90 minutes, le pH retombe dans plage normale. Généralement, 30 à 50 ml de bicarbonate de sodium 8,4% est nécessaire. Concentration augmente rapidement dans le lactate 15-30 premières minutes, mais commence à décéder après la première heure (figure 1E). Mesures post-hoc Transaminases hépatiques telles que ALT peuvent être mesurés dans le perfusat. Dans les 30 premières minutes, une forte augmentation de l&#39;ALT est généralement observée qui reflète le lessivage de ALT qui a été publié pendant l&#39;ischémie (figure 1F). ALT a montré une bonne corrélation avec le temps d&#39;ischémie chaude 13. Machine à perfusion augmenté la teneur en ATP 2,8 fois, ce qui reflète un état ​​d&#39;énergie de récupération (figure 1G). H &amp; E analyse histologique révèle aucune lésion supplémentaire subis pendant machine à perfusion (Figure 1 H, I). Il est à noter que le schéma de biopsie proposé dans ce protocole est de research fins et peuvent ne pas être applicable à des fins cliniques. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" /> Figure 1:. Évaluation des foies humains lors de machine à perfusion écoulement à travers les PV et HA cours SNMP (A), la production de bile, quantifiée par heure de perfusion (B), le taux de uprate d&#39;oxygène (OUR), calculée à partir de la différence de flux (PV + HA) et la sortie (veine cave), interrompus lignes montrent les pressions partielles d&#39;oxygène dans les entrées et sorties au cours de la perfusion (C), le pH au cours de la perfusion et le lactate (D, E), la libération de ALT dans le perfusat (F), l&#39;ATP contenu mesurée dans les tissus de biopsies horaires (G) et H &amp; E taches du foie (54 ans DCD, 19 min ischémie chaude, 559 minutes d&#39;ischémie froide) avant (H) et après (I) perfusion. Les résultats sont présentés en moyenne ± SEM. <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Nous décrivons une méthode ex vivo machine à perfusion de greffes de foie humain à la température subnormothermic (21 ° C).

Foie conservation et de récupération fonctionnelle humaine par des moyens de Subnormothermic machine à perfusion

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

L'objectif général de cette procédure est d'effectuer une machine de perfusion subnormothermique du foie humain en vue de la préservation, de la récupération et de l'évaluation de l'organe. Dans un contexte de recherche préclinique, cela est réalisé en préparant tout d'abord le foie en vue de sa connexion à l'appareil. Dans la deuxième étape, le système de perfusion machine est amorcé, le foie est connecté, puis la perfusion est initiée en dernière étape.Le foie perfusé mécaniquement deviendra fonctionnellement actif à un état thermique subnormal et produira de la bile. En fin de compte, les échantillons prélevés sur le foie pendant la perfusion peuvent être analysés afin d'étudier la récupération métabolique et la fonction de l'organe. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes de préservation existantes, telles que la perfusion froide et la perfusion thermique normale, est que la perfusion mécanique thermique subnormale permet une récupération fonctionnelle et une évaluation de la viabilité du foie, sans avoir à satisfaire les besoins métaboliques élevés d'une perfusion à température corporelle.De nombreux aspects de cette technique nécessitent de l'expérience ou une démonstration pour être réalisés avec succès. Par exemple, la démonstration de la préparation de la table arrière du foie, qui comprend la dissection de l'artère, de la veine et du canal cholédoque, peut s'avérer utile pour les chercheurs n'ayant aucune formation chirurgicale préalable. Dès réception du foie, placez un bac à organes rempli de glace sur une surface stérile recouverte d'un champ opératoire, puis sortez le foie de la boîte de transport en le maintenant largement immergé dans le sac contenant la solution de préservation froide. Ensuite, utilisez des ciseaux Metzenbaum pour mettre à jour les différentes branches du réseau artériel irriguant le foie, depuis l'aorte jusqu'à l'artère hépatique propre.Ensuite, disséquer soigneusement le reste de l'artère afin d'éviter de sectionner les vaisseaux qui vascularisent le foie, sans sectionner ni ligaturer les branches qui ne présentent pas d'extrémité visible. Une fois l'artère isolée, utiliser des fils de suture en soie de calibre zéro à quatre zéro pour ligaturer toutes les branches artérielles qui ne vascularisent pas le foie. Liger et sectionner les artères splénique et gastrique près de leur origine sur le tronc cœliaque.Prélevez un fragment aortique autour du tronc cœliaque. Ensuite, utilisez une canule de perfusion artérielle pour canuler le tronc cœliaque. Désinsérez ensuite la veine porte, ligaturez toutes ses branches ou les perforations présentes dans la veine, puis canulez-la avec une canule de perfusion de la veine porte.Prélever des sections du diaphragme à partir de la veine cave sus-hépatique sans sectionner la veine elle-même. Ensuite, découper deux échantillons de tissu d'une longueur de deux à trois millimètres et d'une circonférence complète à l'extrémité du canal cholédoque. Les échantillons doivent être manipulés délicatement.Congelez rapidement un échantillon dans de l'azote liquide pour le stocker à moins 80 degrés Celsius, et conservez l'autre dans du formol tamponné à 10 %. Ensuite, canulez le canal cholédoque à l'aide d'une canule vasculaire et reliez un tube de drainage constitué d'un petit tuyau. Puis, ligaturez le canal kystique avec un fil de soie zéro.Connectez le dispositif de perfusion à des poches de solution de Ringer lactatée glacée et purgez le tube pour éliminer l'air. Réglez le régulateur de débit du dispositif de perfusion sur un écoulement lent et occluez la veine porte au niveau du hile pour éliminer tout air présent dans le vaisseau. Remplissez ensuite la canule veineuse avec la solution de lavage afin d'expulser l'air de la veine porte, en prenant soin de ne pas élever la poche de plus de 20 centimètres au-dessus de la hauteur du foie afin d'éviter une pression excessive sur la veine.Ensuite, rincez le foie avec un total de deux litres de solution de Ringer lactatée froide ICEC. Pendant le rinçage, occluez brièvement la veine porte au point le plus bas afin de vérifier la présence de fuites, puis répétez le rinçage pour l'artère hépatique avec un litre de solution, comme vient d'être démontré. Pendant que le foie est en cours de rinçage, amorcer le système de perfusion en ajoutant deux litres de solution de perfusion huit à température ambiante dans le bac à organes et démarrez l'appareil pour amorcer les tubulures. Réglez la température à 21 degrés Celsius.Ensuite, régler une pression de trois millimètres de mercure sur la veine porte et de 30 millimètres de mercure sur l'artère hépatique. Ouvrir le réservoir de gaz carbogène et régler le débit à trois litres par minute. Prélever ensuite un échantillon de gaz sanguin aux orifices d'échantillonnage de l'afflux veineux porte et artériel hépatique, puis analyser les échantillons dans l'appareil d'analyse des gaz sanguins conformément aux instructions du fabricant afin de confirmer une oxygénation et un pH adéquats.Utilisez du bicarbonate de sodium ou de l'acide chlorhydrique pour ajuster le pH si nécessaire. Ensuite, avant de connecter le foie, prélève un échantillon d'un millilitre de perfusat comme mesure au temps zéro et conservez-le à moins 80 degrés Celsius. Utilisez une lame en acier à bord unique pour prélever deux biopsies en forme de coin d'environ 250 milligrammes chacune à partir du foie à ce moment-là également.Congeler rapidement un échantillon dans l'azote liquide pour le stocker à moins 80 degrés Celsius et fixer l'autre dans du formol tamponné à 10 %. Avant de commencer la perfusion, peser le foie, puis transférer l'organe dans la chambre d'organe de l'appareil et retirer l'air des canules. Comme vient de l'être démontré.Lorsque les canules sont en place, reliez les entrées de la veine porte et de l'artère hépatique aux canules appropriées. Commencez la perfusion en veillant à ce que le foie soit immergé dans le liquide de perfusion, en recouvrant toutes les surfaces sèches, y compris les vaisseaux d'entrée, avec un gaz stérile humide. Pour prévenir la déshydratation, laissez le tube biliaire s'écouler dans un récipient de collecte.Veiller à ce que l'ouverture du drain biliaire soit au niveau du foie ou en dessous afin de permettre à la bile de s'écouler librement. Une fois que le foie est réchauffé à 21 degrés Celsius, viser des débits de 275 à 325 et de 50 à 100 millilitres par minute par kilogramme pour la veine porte et l'artère hépatique, respectivement. Pendant la perfusion, prélever des échantillons du tissu hépatique perfusé et de la bile selon les besoins.Poursuivez la perfusion pendant trois heures, en surveillant la pression, le pH et l'oxygénation, et en ajustant le pH avec du bicarbonate de sodium si nécessaire. À la fin de la perfusion, prélève les échantillons finaux, déconnecte le foie et retire la canule du canal biliaire. Enfin, prélève deux échantillons tissulaires post-perfusion du canal biliaire comme vient d'être démontré, puis jette le foie humain.Suivre les directives appropriées de traitement des déchets biologiques. Le débit est faible au départ en raison d'une résistance plus élevée dans le foie froid, avec une pression de trois millimètres de mercure sur la veine porte et de 30 millimètres de mercure sur l'artère hépatique. Les débits cibles peuvent généralement être atteints une fois que le foie s'est réchauffé à 21 degrés Celsius après 60 minutes de perfusion. La mesure fréquente du sang perfusé par analyse des gaz sanguins est essentielle à la fois à des fins expérimentales et pour maintenir des conditions de perfusion adéquates.Par exemple, la pression partielle d'oxygène dissous doit être supérieure à 700 millimètres de mercure à l'entrée de la veine porte et de l'artère hépatique. En revanche, la pression d'oxygène en sortie, mesurée dans la veine cave, devrait généralement diminuer avec une perfusion plus longue, reflétant une absorption croissante d'oxygène. Les transaminases hépatiques peuvent également être mesurées dans le PERFU huit, par exemple.Une augmentation de l'alanine, de la transaminase ou d'une LT est généralement observée durant les 30 premières minutes de la perfusion, avec une augmentation minimale supplémentaire au cours du reste de la perfusion. Une évaluation supplémentaire de la production d'ATP dans des foies perfusés par machine révèle une augmentation de 2,8 fois de la teneur hépatique en ATP, reflétant un statut énergétique en cours de récupération. De plus, l'analyse histologique hématoxyline et éosine ne révèle aucune lésion supplémentaire survenue pendant la procédure.Suivre cette procédure permet une analyse approfondie du foie isolé, offrant des aperçus uniques sur la physiologie et la pathologie hépatiques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment maintenir un foie humain pendant une perfusion mécanique subériorique afin de faciliter l'évaluation de sa fonction en dehors du corps.

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Greffons marginaux, tels que les foies gras, les greffes de donneurs plus âgés, ou des foies prélevés après la mort cardiocirculatoire (DDC) tolèrent, stockage statique classique froide mal. Nous avons développé un nouveau modèle de subnormothermic ex vivo perfusion du foie pour la conservation, l'évaluation et la réparation des greffes de foie marginaux avant la transplantation.

Technique de Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Foie de perfusion pour l&#39;entreposage, de l&#39;évaluation et de réparation des marginaux greffes du foie

Nous présentons ici un protocole décrivant ex situ oxygénée machine à perfusion de greffes de foie donateurs. Cet article contient une étape par étape protocole de se procurer et de préparer la greffe du foie pour la machine perfusion, préparer le liquide de perfusion, amorcer la machine à perfusion et d'effectuer oxygénée normothermique machine à perfusion de la greffe de foie.

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Un petit modèle Animal de Perfusion hépatique normothermique Ex Vivo

Le modèle porcin de perfusion hépatique normothermique (NMP), décrit ici, peut être utilisé avec succès pour étudier la NMP en tant que stratégie de préservation, outil d’évaluation de la viabilité et plate-forme pour la réparation d’organes. Il a une grande valeur translationnelle, mais il est techniquement difficile et demande beaucoup de main-d’œuvre.

Perfusion hépatique isolée normomère porcine

Un système de perfusion hépatique ex vivo normothermique (NEVLP) a été créé pour les foies de souris. Ce système nécessite de l’expérience en microchirurgie mais permet des résultats de perfusion reproductibles. La capacité d’utiliser des foies de souris facilite l’étude des voies moléculaires pour identifier de nouveaux additifs perfusats et permet l’exécution d’expériences axées sur la réparation d’organes.

Perfusion hépatique Ex vivo Ex Vivo Normothermic chez la souris

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Conservation du don de porcs après mort circulatoire (DDC) par perfusion et transplantation hépatique orthotopique

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