Une technique d'enrichissement Optimisé pour l'isolement de Arthrobacter Bactériophage Espèces de l'échantillon du sol Isole

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les phases de la bactérie Arthrobacter à partir d’échantillons de sol à l’aide d’un protocole d’enrichissement. Pour ce faire, il faut d’abord prélever des échantillons de sol et isoler les particules de phages viables des micro-organismes contaminants du sol. La deuxième étape consiste à infecter les cellules bactériennes de l’hôte Arthrobacter avec les particules de phage isolées.

Ensuite, les cellules bactériennes infectées sont plaquées sur des plaques de tarière pour identifier le phage, comme en témoigne la formation de plaques. La dernière étape consiste à purifier les phages souhaités à partir de plaques clairement isolées en utilisant la méthode de la plaque striée. En fin de compte, cette technique d’enrichissement est optimisée pour l’isolement relativement facile des phages d’arthrobacter à partir de l’espèce d’arthrobacter KY 3 9 0 1.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes d’enrichissement existantes est l’ajout d’un échantillon de sol finement filtré à une culture pure de bactéries hôtes afin d’éviter la croissance de bactéries concurrentes. Bien que cette méthode se soit avérée efficace pour l’isolement des phages d’Arthrobacter, elle devrait être applicable pour l’isolement des phages d’autres hôtes bactériens. Nous avons eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons appris que d’autres chercheurs avaient de la difficulté à trouver des phages d’arthrobacter

Avec des techniques d’enrichissement traditionnelles. Mes étudiants feront la démonstration des techniques utilisées pour isoler avec succès les phages d’arthrobacter. Les cellules d’Arthrobacter sont cultivées à partir de colonies striées sur une plaque de tarière LB, incubées à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours.

À l’aide d’une boucle stérile, choisissez une colonie et ajoutez-la à 50 millilitres de bouillon. Dans une culture à chicanes, incubez le ballon dans un incubateur à agitation à 225 tr/min à 30 degrés Celsius pendant environ 24 heures. Obtenir des cellules en phase stationnaire exponentielle ou précoce pour des expériences d’infection par phage.

Surveillez de près l’état de croissance bactérienne pour empêcher les cellules d’entrer dans la croissance stationnaire du milieu à la fin. État. La DO 600 idéale pour l’isolement des phages se situe entre 0,5 et 0,7. Étant donné que les bactéries du genre arthrobacter sont des bactéries courantes du sol, elles et les phages qui les infectent peuvent être trouvés dans la plupart des types de sol.

Rassemblez 200 à 400 grammes de terre à l’endroit souhaité. Ajoutez au moins 400 millilitres de tampon de lysois au sol dans des béchers suffisamment grands pour qu’au moins 200 millilitres de tampon de lysobe se trouvent dans le surnageant et puissent être extraits mélangés en remuant doucement ou en tourbillonnant jusqu’à ce que le sol soit en suspension et laissez les sédiments du sol se déposer, généralement pendant 30 minutes. Ensuite, enlevez les débris de sédiments du sol en passant l’extrait de sol à travers un papier filtre par filtration sous vide.

Ajoutez quatre grammes de poudre LB à 200 millilitres d’extrait de sol filtré et mélangez pour obtenir une solution à 2 %. Passer la solution à travers un filtre de 0,22 micron par filtration sous vide pour obtenir un filtrat stérile. Si possible, passez immédiatement à l’étape suivante.

Néanmoins, si nécessaire, les échantillons filtrés peuvent être stockés à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine avant de continuer. Cependant, le nombre de particules de phages viables sera réduit en utilisant comme techniques septiques l’aliquote de plusieurs portions de 50 millilitres du mélange d’extrait de sol LB stérilisé par filtre en 250 millilitres individuels. Des flacons de culture stérilisés et déflecteurs ajoutent une solution stérile de chlorure de calcium 2,0 molaires aux concentrations finales souhaitées.

Étant donné que différents phages d’arthrobacter se développent de manière optimale dans différentes conditions de chlorure de calcium, commencez cette procédure en ajoutant un à 2,5 millilitres de culture bactérienne en phase exponentielle tardive ou stationnaire précoce à chacun des flacons contenant un mélange d’extrait de sol LB stérilisé par filtre. Si la DO 600 de la culture est de 0,5 à 0,7, utilisez un millilitre. Si l’OD 600 est supérieur à 0,7, utilisez 2,5 millilitres.

Agitez les flacons à 250 tr/min à 30 degrés Celsius pendant environ 24 heures dans un incubateur à agitation. Après la période d’incubation de 24 heures, retirer les flacons d’enrichissement de l’incubateur à agitation. Diluez les échantillons d’enrichissement dix fois dans un tampon de phage.

Mettez en place des tubes de culture avec 0,5 millilitre d’exponentielle tardive ou de stationnaire précoce. Culture bactérienne en phase. Ajoutez des quantités variables de cinq microlitres à 500 microlitres de culture d’enrichissement dilué dans les tubes de culture.

Ajouter du chlorure de calcium dans les tubes de culture pour obtenir une concentration finale en cinq millilitres égale à la concentration présente dans la fiole d’enrichissement d’origine. Utilisez une gamme de concentrations différentes de chlorure de calcium pour sélectionner de nombreux phages avec des dépendances variables au chlorure de calcium. Ajoutez 4,5 millilitres de vis sans fin LB dans chaque tube de culture et versez le mélange sur une plaque de vis sans fin LB.

Agitez doucement pour répartir uniformément sur la plaque et laissez la vis supérieure se solidifier pendant environ 15 minutes. Retournez les plaques et incubez à 30 degrés Celsius pendant la nuit jusqu’à 48 heures. Variez les temps d’incubation pour optimiser la présence de phages après une incubation de 24 heures, vérifiez la formation de plaque sur les plaques.

La plupart des phages isolés proviennent de plaques incubées à 30 degrés Celsius à une concentration de chlorure de calcium de 1 à 2,5 millimolaires après une période d’incubation de 24 heures, la purification des phages souhaités à partir de plaques clairement isolées à l’aide d’un bâton en bois étant la partie la plus difficile de cette procédure. Une expertise technique est nécessaire pour répartir doucement les plaques sur la plaque de la vis sans fin afin de produire une plaque de stries uniforme. Stérilisez un bâtonnet en bois en le passant à travers une flamme et en le laissant refroidir.

Touchez brièvement une plaque avec le bâtonnet en bois stérile et frottez le bâtonnet sur la plaque de la vis sans fin dans le mouvement doux comme indiqué. Répétez cette opération à l’aide d’un bâton propre pour chaque passage. Une fois que la plaque de la tarière LB est striée au moins trois fois, marquez la zone avec la plus faible concentration de particules de phages présumées.

Appliquez délicatement 0,5 millilitre d’arthrobacter et 4,5 millilitres de tarière supérieure LB fondue sur la zone marquée et laissez-le s’étaler uniformément sur la plaque. Laissez la vis supérieure se solidifier pendant au moins une heure lorsque la plaque s’est solidifiée, retournez-la et incubez-la pendant la nuit. Répétez la technique de la plaque striée pendant au moins trois itérations pour vous assurer qu’une espèce de phage pure est isolée.

Les plaques peuvent être stockées à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine au besoin entre les traînées sans perte significative de viabilité des phages. Une fois que les plaques souhaitées ont été cultivées et isolées sur la plaque de traînée finale, touchez une plaque bien isolée avec une pointe de micro-pipette et remettez-la en suspension dans 100 microlitres de tampon de phage en série. Diluez cette solution jusqu’à la dilution de 10 à moins huitième en passant 20 microlitres de l’échantillon dans 180 microlitres de tampon de phage frais. Ajouter 10 microlitres de chaque dilution à 0,5 millilitre d’arthrobacter cultivé dans un tube de culture pendant cinq à 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, en mélangeant les bactéries infectées avec 4,5 millilitres de tarière supérieure LB fondue contenant la même concentration de chlorure de calcium que celle utilisée pour isoler le phage de l’échantillon de sol d’origine. Incuber les assiettes pendant la nuit. Conservez toute dilution faite à quatre degrés Celsius jusqu’au lendemain.

Déterminer la dilution des céréales de phage nécessaire pour créer un motif de toile à l’aide du dosage traditionnel du titre de plaque. Identifiez une plaque de motif de toile comme étant principalement dépourvue de bactéries, mais contenant des restes de bactéries qui n’ont pas encore été mélangées par des phages. Ajouter cinq millilitres de culture d’arthrobacter exponentielle tardive ou stationnaire précoce dans une fiole de culture stérile de 50 millilitres.

Ajoutez 100 microlitres de la dilution qui a donné un motif de toile à la culture d’arthrobacter et laissez les phages infecter les cellules bactériennes pendant cinq à 10 minutes. À température ambiante, ajouter à la vis supérieure en fusion contenant la même concentration de chlorure de calcium que celle utilisée pour identifier initialement la plaque de phage. Cinq millilitres de ce mélange sur chacune des 10 assiettes LB fraîches.

Après avoir laissé la vis supérieure se solidifier, s’inverser et incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant la nuit le lendemain, inondez les plaques de motif de bande avec cinq millilitres de tampon de phage par plaque et stockez-les pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Filtrez le lysat de phage à travers un filtre à seringue de 0,22 micron. Stockez ce dernier stock de phages à quatre degrés Celsius pour un stockage à long terme.

Ajouter une quantité égale de lysat de phage à du glycérol stérile dans de petits flacons pour l’archivage des stocks à moins 80 degrés Celsius dans la procédure d’enrichissement démontrée dans cette vidéo, la méthode des traînées de plaques pour isoler les populations de phages purs après l’enrichissement initial et le placage sur la tarière LB montrés sont des résultats représentatifs de l’isolement des plaques pour le DI de phage à température ambiante, 30 degrés Celsius et 37 degrés Celsius. Les cercles rouges sur deux des plaques entourent des plaques clairement isolées. Phage Dylan produit des plaques similaires à trois températures différentes.

Alternativement, un dosage standard traditionnel du titre de plaque peut être utilisé pour isoler un isolat de phage pur. Ce test a été utilisé ici pour déterminer empiriquement le nombre de titres de phages et le nombre d’unités formant des plaques pour former un motif de sangle sur une plaque. Un ensemble de dilutions en série pour la banane de phage est illustré avec un exemple de ce à quoi devrait ressembler un bon motif de toile.

Il s’agit d’images en micromicrographie électronique de 20 phages d’arthrobacter isolés à l’aide de la technique d’enrichissement. Sur les 25 phages actuellement isolés, 23 d’entre eux sont des virus cifo à queue assez longue. Deux des phages isolés sont des myovirus dont le diamètre de la tête est similaire à celui de leur queue.

Une fois maîtrisé, le placage d’enrichissement devrait permettre d’isoler avec succès les phages d’arthrobacter à partir d’une variété d’échantillons de sol. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier le phage est utilisé dans la méthode de peinture à traînées à partir d’un échantillon de sol environnemental.