Name: Une technique denrichissement Optimisé pour lisolement de Arthrobacter Bactériophage Espèces de léchantillon du sol Isole (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Découvrez un protocole d'enrichissement optimisé pour isoler des bactériophages infectant Arthrobacter à partir d'échantillons de sol. Cette méthode permet une isolation rapide et reproductible pour la recherche en virologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Le financement pour le développement de ce protocole a été fourni par le Southeastern Pennsylvania Consortium pour l&#39;enseignement supérieur et le ministère de la Science Cabrini College. Financement et de soutien supplémentaires sont venus de l&#39;Université Arcadia et l&#39;Université Immaculata. Nous remercions tout particulièrement le Dr Karen Snetselaar à l&#39;Université Saint-Joseph pour prendre de bien vouloir les images microscope électronique de nos phages isolés. Un soutien supplémentaire a été fourni par les chasseurs Howard Hughes Medical Institute Science Education Alliance phages Advancing génomique et le programme (SEA-PHAGES) évolutive Science.

1. Préparation des cellules pour Arthobacter Phage Isolement <ul><li> Culture Arthrobacter sp. KY3901 colonies striées sur une Luria Bertaini (LB) plaque de gélose incubées à 30 ° C pendant 2-3 jours. Choisissez une colonie et utiliser une boucle stérile pour l&#39;ajouter à 250 ml de bouillon LB dans un flacon de culture perplexe et incuber dans un incubateur sous agitation à 225 tours par minute à 30 ° C. </li><li> Laisser environ 24 h de la croissance pour obtenir fin des cellules en phase stationnaire exponentielles / début pour des expériences d&#39;infection de phage. Surveiller l&#39;état de la croissance bactérienne étroitement pour empêcher les cellules de pénétrer dans le milieu à la fin l&#39;état stationnaire de croissance. NOTE: La croissance cellulaire devrait être composé d&#39;une densité optique OD 600 de 0,5-.0.7 pour les procédures d&#39;isolement et de purification de phages / étapes décrites ci-dessous. </li></ul> 2. Collecte des phages d&#39;échantillons de sol <ol><li> Rassemblez 200-400 g de sol de l&#39;emplacement souhaité. Remarque: Comme les bactéries dans le Arthrobagenre Cter sont des bactéries du sol et les communes qu&#39;ils phages qui les infectent peuvent être trouvés dans et sont omniprésents dans la plupart des types de sol. </li><li> Ajouter au moins 400 ml de tampon de phage (PB) [mM de NaCl 68 mM MgSO4 10, 10 mM de Tris-Cl (pH 7,5)] pour le sol et les mélanger dans un grand ballon suffisamment pour qu&#39;au moins 200 ml de PB est dans le surnageant et est apte à être extrait. </li><li> Mélanger par agitation ou remuant doucement jusqu&#39;à ce que le sol est suspendu et laisser les sédiments du sol pour se installer, généralement 30 min. </li><li> Passez le &quot;extrait de sol&quot; à travers un papier filtre par filtration par gravité pour éliminer les débris sédiments du sol. </li><li> Ajouter la poudre LB et mélanger pour obtenir une solution à 2% (4 g de poudre LB dans 200 ml d&#39;extrait sol). </li><li> Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 um par filtration sous vide pour obtenir un filtrat stérile. Si possible, passez à l&#39;étape 2.7 immédiatement. Si besoin est, magasin filtré échantillons à 4 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine avant de continuer, cependant, le nombre de particules de phages viablessera réduite. </li><li> Aliquote multiples portions de 50 ml du mélange d&#39;extrait LB / sol stérilisée par filtration dans individuels de 250 ml stérilisés secouant flacons de culture dérouté aide de techniques aseptiques. Ajouter stérile 2,0 M CaCl 2 solution aux concentrations finales souhaitées (0-50 mm) depuis différents phages Arthrobacter croissent de manière optimale dans différentes conditions de CaCl 2. REMARQUE: On constate que la majorité des phages Arthrobacter sont identifiés par nous dans la plage de 1 mM à 2,5 mM, CaCl 2. Cependant, plusieurs des phages isolés ont augmenté par nous exclusivement à 0 mM CaCl2 .ou à de très hautes concentrations de CaCl 2. Procéder immédiatement à l&#39;étape 3.1. </li></ol> 3. Isolation Phage <ol><li> Ajouter 1 à 2,5 ml de retard fixe culture de bactéries en phase exponentielle / début de chacun des flacons. Pour une DO 600 de 0,5 à 0,7, utiliser 1 ml de cellules. Pour une DO 600 supérieure à une DO de 0,7 utiliser 2,5 ml decellules. REMARQUE: Les cellules en phase de croissance exponentielle donnent généralement plus de phages et des titres plus élevés que les cellules de la croissance de la phase stationnaire. </li><li> Secouez flacons à 250 tours par minute à 30 ° C pendant environ 24 heures dans un incubateur à agitation. </li><li> Après une période d&#39;incubation de 24 h retirer flacons enrichissement de l&#39;incubateur secouant et diluer les échantillons d&#39;enrichissement de dix fois dans le tampon de phage. </li><li> Mettre en place des tubes de culture avec 0,5 ml de retard fixe culture de bactéries en phase exponentielle / début et ajouter diverses quantités de la culture d&#39;enrichissement (5 ul à 500 ul d&#39;une dilution à 10 -1 PB) aux tubes de culture. NOTE: Il est conseillé de tester une large gamme de concentrations puisque chaque échantillon de sol génère différents titres de phages après enrichissement. </li><li> Ajouter CaCl 2 pour des tubes de culture pour rendre une concentration finale égale à la concentration présente dans le ballon de l&#39;enrichissement initial. Utilisez une gamme de différents CaCl 2 concentrations de sélectionner pour nombreux phages wCaCl 2 ième variable dépendances. REMARQUE: La plupart des phages seront isolés dans la plage de 1 à 2,5 CaCl 2 mm, mais il ya des phages isolés plus optimale partout 0-50 mM CaCl 2 concentrations. Pour cette raison, il est préférable de vérifier une gamme de CaCl 2 concentrations de maximiser le nombre de phages uniques Arthrobacter isolés. </li><li> Mélanger 4,5 ml d&#39;agar LB dans le tube de culture et versez le mélange sur une plaque de gélose LB. Agiter doucement pour répartir uniformément sur la plaque et permettre top agar se solidifier pendant environ 15 min. REMARQUE: Top agar peut être préparé en lots plus importants (250 ml) et top agar supplémentaire peut être conservé à température ambiante et réutilisé pour des expériences ultérieures pendant au moins deux semaines. Bien qu&#39;il existe différentes formules utilisées pour faire agar dessus, nous faisons top agar en utilisant 7g / L d&#39;agar mélangé avec LB. agar Placez dans un bain-marie à 60 ° pour conserver l&#39;état liquide au cours d&#39;une expérience. </li><li> Inverser til plaque et incuber à la température souhaitée (température à 30 ° C) O / N à 48 h. Vary ces conditions pour optimiser les phages présents. Phages plus isolées proviennent de plaques ont été incubées à 30 ° C à 1 à 2,5 mM CaCl concentration 2 après une période d&#39;incubation de 24 h. </li></ol> 4. Phage Purification <ol><li> Après un contrôle d&#39;incubation de 24 heures pour la formation de plaque sur des plaques. Continuer incubation jusqu&#39;à 72 heures si aucune plaques sont évidentes ou pour déterminer si des plaques supplémentaires apparaîtront. Si nécessaire, des plaques de magasins avec plaques putatifs pour jusqu&#39;à une semaine à 4 ° C avant de procéder. NOTE: Il ne est pas rare de trouver une variété de différentes morphologies de la plaque sur une plaque. Trouver plaques après 3 jours d&#39;incubation est possible, mais rare. </li><li> Purifier phages souhaités de plaques clairement isolé en utilisant la méthode de la plaque de série. Touchez une plaque avec un bâton en bois stérile. Streak la plaque en exécutant un bâton en bois à travers une flamme, allowing le bâton pour refroidir brièvement, puis frotter le bâton sur la plaque de gélose dans le mouvement doux comme le montre la figure 1. Répétez cette aide d&#39;un bâton propre pour chaque passage. </li><li> Vous pouvez également utiliser le dosage traditionnelle plaque de titre pour isoler plaques de phages individuels. La plaque de dosage titre exige l&#39;utilisation de plusieurs réactifs tels que l&#39;agar LB et LB agar supérieur et des matériaux tels que des boîtes de Pétri pour l&#39;isolement de la plaque de phage. Nous avons eu beaucoup de succès en utilisant la méthode de la plaque de série, mais il est techniquement plus facile à isoler plaques individuelles en utilisant le test de la plaque titre. </li><li> Une fois que la plaque de gélose LB est striée au moins trois fois, marquer la zone avec la plus faible concentration de particules de phage putatifs et appliquer doucement 0,5 ml d&#39;Arthrobacter et 4,5 ml de top agar fondu LB (contenant la même concentration de chlorure de calcium comme la plaque mère ) et lui permettre de se répandre uniformément sur la plaque. </li><li> Inversez et incuber la plaque O / N. Répétez la plaque de sérietechnique pendant au moins trois itérations pour assurer une espèce de phage pur est isolé. plaques de conserver à 4 ° C pour jusqu&#39;à une semaine selon les besoins entre les stries sans perte significative de la viabilité du phage. </li><li> Une fois plaques souhaités ont été cultivées et isolé sur la plaque de série finale, touchez une plaque bien isolée avec une pointe de micropipette et remettre en suspension dans 100 pi de PB. Série diluer cette solution à 10 0 à la dilution 10 -8 en passant 20 pi de l&#39;échantillon dans 180 pl de PB frais. </li><li> Ajouter 10 ul de chaque dilution de 0,5 ml de cultivé Arthrobacter dans un tube de culture pendant 5 à 10 min à la température ambiante et la plaque en mélangeant les bactéries infectées avec 4,5 ml de top agar LB fondu contenant la même concentration de CaCl 2 utilisé pour isoler les phages de l&#39;échantillon de sol d&#39;origine. Enregistrer toutes les dilutions faites à 4 ° C jusqu&#39;au lendemain. </li><li> Déterminer la dilution en série de phage nécessaire pour faire un modèle Web en utilisant le titre de plaque traditionnelledire. Le but de l&#39;essai de plaque de titrage est de déterminer le titre de phage nécessaire pour obtenir une plaque-modèle Web. Identifier une plaque de motif de forme Web comme la plupart du temps mais dépourvu de bactéries contenant des restes de bactéries qui ne ont pas encore été lysées par les phages. Ajouter 5 ml de la culture exponentielle / début fin Arthrobacter fixe à une culture de 50 ml flacon stérile. <ol><li> Ajouter 100 ul de la dilution (qui a donné un motif de bande de la culture de Arthrobacter) dans le flacon de culture et de permettre aux phages pour infecter les cellules bactériennes pendant 5 à 10 min à température ambiante. Mélanger avec le dessus de la gélose LB fondu contenant la même concentration de CaCl 2 comme initialement utilisé pour identifier le phage et la plaque 5 ml de ce mélange sur 10 plaques LB frais. Laisser solidifier et incuber les plaques inversées à 30 ° C. </li></ol></li><li> Le lendemain, inonder les plaques modèles Web avec 5 ml de PB et stocker O / N à 4 ° C ou 4 heures à température ambiante. </li><li> Filtrer le lysat de phage à travers un filtre à seringue de 0,22 umet stocker à 4 ° C. Utilisez ce phage finale stock pour des expériences supplémentaires tels que des images de microscopie électronique de particules de phage, phage isolement de l&#39;ADN génomique pour l&#39;analyse de restriction enzyme ADN et le séquençage génomique en utilisant des procédures standard. Pour le stockage à long terme du stock de phages, ajouter un montant égal du lysat de phage glycérol stérile dans de petites fioles pour le stock archivage à -80 ° C. NOTE: Pour ceux qui ne expérience avec ces techniques de phage, une grande ressource est le site de www.phagesdb.org accessible en ligne. </li></ol>

<ol><li>Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Catabolic+Pathways%3A+Genomic+Insights+into+Microbial+s-Triazine+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism.</a> J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).</li>
<li>Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Atrazine+Degrading+Arthrobacter+sp.+AD26+and+Use+of+this+Strain+in+Bioremediation+of+Contaminated+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil.</a> J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).</li>
<li>Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+an+Arthrobacter+sp.+Strain+HB-5+that+Transforms+Atrazine%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Geochem+Hlth%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine.</a> Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).</li>
<li>Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identities+of+Arthrobacter+spp.+And+Arthrobacter-Like+Bacteria+Encountered+in+Human+Clinical+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens.</a> J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).</li>
<li>Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Arthrobacter+Bacteriophages+and+Their+Application+to+Phage+Typing+of+Soil+Arthrobacters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters.</a> Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).</li>
<li>Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+Gordonia+and+Nocardia+Stabilized+Foam+Formation+by+Using+Bacteriophage+GTE7%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).</li>
<li>Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Characterization+of+Site-specific+Integration+Functions+of+phi+AAU2+infecting+%E2%80%9CArthrobacter+aureus%E2%80%9D+C70%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70.</a> J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).</li>
<li>Casida, L. E., Liu, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthrobacter+globiformis+and+Its+Bacteriophage+in+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil.</a> J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).</li>
<li>Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+a+Bacteriophage+of+Arthrobacter+globiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis.</a> J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).</li>
<li>Twest, R., Kropinski, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+Enrichment+from+Soil+and+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage Enrichment from Soil and Water.</a> Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).</li>
<li>Fullner, K. J., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteriophage+L5+Infection+of+Mycobacterium+bovis+BCG%3A+Implications+for+Phage+Genetics+in+the+Slow-growing+Mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria.</a> Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).</li>
<li>Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+Growth+Characteristics+on+Stationary+Phase+Achromobacter+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells.</a> J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).</li>
<li>Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T4+Bacteriophage+Average+Burst+Size+Varies+with+Escherichia+coli+B23+Cell+Culture+Age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age.</a> Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).</li>
<li>MacWilliams, M. P., Liao, M. K. Luria Broth (LB) and Luria Agar, Media and Their Uses Protocol. ASM MicrobeLibrary. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli">http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli</a> (2013).</li>
</ol>

Auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrentes.

Malgré de nombreuses tentatives antérieures afin d&#39;isoler les phages capables d&#39;infecter des hôtes Arthrobacter, nous avons eu peu de succès en utilisant des procédures d&#39;enrichissement standard. La méthode généralisée de l&#39;enrichissement bactérienne développé et adapté par van Twest et Kropinski 10 pour enrichir phages partir d&#39;échantillons environnementaux demeure la base de la majorité des procédures d&#39;enrichissement. Les résultats d&#39;études précédentes suggèrent que les...

L&#39;omniprésence des espèces Arthrobacter dans des environnements de sol offre un grand nombre et la diversité des phages susceptibles d&#39;être isolé de cette espèce de bactéries hôtes. Bactériennes membres de la famille Acintobacteriaceae sont les plus notables pour leurs voies cataboliques de dégrader des composés récalcitrants comme l&#39;atrazine et d&#39;autres pesticides et herbicides 1,2,3. Bien que la plupart des recherches ont été faites en utilisant des souches environnementales de Arthrobacter, isolats cliniques de ce genre se trouve dans le sang, l&#39;urine, les yeux, et de nombreuses autres sources humaines tout une hétérogénéité phylogénétique 4. Bien qu&#39;il existe un corps plutôt vaste de la recherche sur les bactéries Arthrobacter, seules quelques études signalent sur ​​les phages capables d&#39;infecter les membres de ce genre diversifié. Fait intéressant cependant, le travail fait précédemment sur ​​Arthrobacter phages touches sur plusieurs sujets distincts clés tels que le typage du sol &lt;em&gt; espèces Arthrobacter 5, les utilisations industrielles dans le but de réduire la mousse délétère dans les usines de traitement des boues activées 6, et le travail en soulignant recombinaison spécifique de site et les gènes de l&#39;intégrase 7. Divers protocoles de technique d&#39;enrichissement ont été employées pour générer des isolats de phage pur dans les espèces Arthrobacter. Les premières procédures comprennent incubations de sol avec des agents toxiques ajoutés comme les sels de nicotine pour des périodes de plus d&#39;un an donnant lieu à 8 phages capables de ne infecter A. globiformis. Des études effectuées en utilisant le sol percole avec des matières organiques labiles semblent produire des phages détectables par des techniques d&#39;analyse plaque, en omettant longues périodes d&#39;incubation 8. Fait intéressant cependant, une technique qui ressemble à ensemencement direct a été utilisé dans le passé donnant lieu à plusieurs phages tout en ayant un taux de réussite particulièrement faible par les enquêteurs 5, citant des études passées avec faibles taux de réussite <sjusqu&#39;à&gt; 8. Dans l&#39;ensemble, les techniques d&#39;isolation utilisés dans le passé ont été remarquables pour avoir peu d&#39;efficacité dans la pratique malgré les genre Arthrobacter représentant le sol aérobie la plus courante isoler dans la nature 4,9, Van Twest et Kropinski 10 méthodes d&#39;enrichissement présents pour isoler les phages de l&#39;eau et du sol adapté de techniques antérieures utilisées pour enrichir isolats bactériens environnementaux, mais ces techniques d&#39;enrichissement se est avéré inefficace à isoler phages Arthrobacter. Le but de la méthode décrite ici est de montrer &quot;preuve de concept&quot; que les méthodes d&#39;enrichissement début peuvent être adaptés pour isoler cohérente et efficace phages Arthrobacter, surmonter les défis techniques associés à isoler précédentes phages de ce genre bactérien.

<table><tbody><tr><td>LB Bouillon en poudre</td><td>Fisher</td><td>BP9722-2</td><td>Il est préférable de les commander en gros.</td></tr><tr><td>Gélose</td><td>granulée Fisher</td><td>BP1423-2</td><td>Il est préférable de les commander en gros.</td></tr><tr><td>0,22 um filtres à seringue</td><td>Fisher</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>0,22 um filtres buchner</td><td>Fisher</td><td>430320</td><td>Plus de 50 ml de liquide peuvent être obtenus en échangeant soigneusement le tube récepteur.</td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipettes individuelles</td><td>Fisher</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubes coniques</td><td>Fisher</td><td>76002844</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubes coniques</td><td>Fisher</td><td>76002845</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipettes individuelles</td><td>Fisher</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipettes individuelles</td><td>Fisher</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Whatman papier filtre qualitatif</td><td>Fisher</td><td>1001-824</td><td></td></tr></tbody></table>

une technique d&#39;enrichissement optimisé pour l&#39;isolement de<em&gt; arthrobacter</em&gt; bactériophage espèces de l&#39;échantillon du sol isole

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

L’isolement des bactériophages à partir d’échantillons environnementaux est effectué depuis des décennies en utilisant les principes énoncés par les pionniers de la microbiologie. L’isolement des phages infectant les hôtes d’Arthrobacter a été limité, peut-être en raison du faible taux de réussite de nombreuses techniques d’isolement précédentes, ce qui a entraîné une sous-représentation d’un groupe de phages d’Arthrobacter disponibles pour l’étude. La technique d’enrichissement décrite ici, contrairement à beaucoup d’autres, utilise un extrait filtré exempt de bactéries contaminantes comme base pour la croissance des bactéries indicatrices, Arthrobactersp. KY3901, plus précisément. En éliminant d’abord les bactéries du sol, les phages cibles ne sont pas gênés par la concurrence avec les bactéries du sol indigènes présentes dans les échantillons de sol initiaux. Cette méthode d’enrichissement a permis d’obtenir des dizaines de phages uniques provenant de plusieurs types de sols différents et même de produire différents types de phages à partir du même isolat d’échantillon de sol enrichi. L’utilisation de cette procédure peut être étendue à la plupart des milieux aérobies riches en nutriments pour l’isolement des phages dans une grande diversité de bactéries hôtes intéressantes.

Pour démontrer la reproductibilité de la technique d&#39;enrichissement amélioré pour phages Arthrobacter, 30 échantillons de sol différents ont été utilisés à différents moments et les lieux au cours du printemps et de l&#39;été 2014. Parmi ces échantillons 30 de sol phages Arthrobacter uniques ont été obtenus à partir de 22 échantillons de sol prélevés en utilisant cet enrichissement procédure. La procédure d&#39;enrichissement donné norme phages uniques à partir de trois de ces mêmes échantillons de...

Nous présentons un protocole d’enrichissement pour l’isolement des bactériophages infectant des bactéries du genre Arthrobacter. Ce protocole d’enrichissement produit des résultats rapides et reproductibles pour l’isolement et l’amplification des phages d’Arthrobacter à partir d’isolats de sol.

Une technique d&#39;enrichissement Optimisé pour l&#39;isolement de<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bactériophage Espèces de l&#39;échantillon du sol Isole

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des phases de bactéries arthrobacter à partir d'échantillons de sol en utilisant un protocole d'enrichissement. Cela est réalisé en premier lieu en prélevant des échantillons de sol et en isolant des particules de phage viables à partir des micro-organismes du sol contaminants. La deuxième étape consiste à infecter des cellules bactériennes hôtes arthrobacter avec les particules de phage isolées.Ensuite, les cellules bactériennes infectées sont ensemencées sur des géloses en boîtes de Pétri pour identifier les phages par la formation de plaques. La dernière étape consiste à purifier les phages souhaités à partir de plaques clairement isolées en utilisant la méthode de la stries. En définitive, cette technique d'enrichissement est optimisée pour l'isolement relativement aisé de phages d'Arthrobacter à partir de la souche Arthrobacter KY 3 9 0 1.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes d'enrichissement existantes réside dans l'ajout d'un échantillon de sol finement filtré à une culture pure de bactéries hôtes, afin d'éviter la croissance de bactéries concurrentes. Bien que cette méthode se soit révélée efficace pour l'isolement de phages d'Arthrobacter, elle devrait également s'appliquer à l'isolement de phages à partir d'autres bactéries hôtes. Nous avons eu l'idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons appris que d'autres chercheurs rencontraient des difficultés à isoler des phages d'Arthrobacter.Avec des techniques d'enrichissement traditionnelles. Mes étudiants démontreront les techniques utilisées pour isoler avec succès des phages d'Arthrobacter. Les cellules d'Arthrobacter sont cultivées à partir de colonies étalées sur une boîte de gélose LB, incubées à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours.Utilisez une anse stérile pour prélever une colonie et ajoutez-la à 50 millilitres de bouillon LB. Dans un flacon de culture à brides, incubez le flacon dans un incubateur agité à 225 tr/min à 30 degrés Celsius pendant environ 24 heures afin d'obtenir des cellules en phase exponentielle ou en début de phase stationnaire pour des expériences d'infection par des phages.Surveillez attentivement l'état de la croissance bactérienne afin d'empêcher les cellules d'entrer en phase stationnaire moyenne à tardive. La densité optique idéale à 600 nm pour l'isolement de phages se situe entre 0,5 et 0,7. Étant donné que les bactéries du genre Arthrobacter sont des bactéries courantes du sol, elles ainsi que les phages qui les infectent peuvent être trouvés dans la plupart des types de sol.Prélevez 200 à 400 grammes de sol à l'emplacement souhaité. Ajoutez au moins 400 millilitres de tampon à phages au sol dans un bécher suffisamment grand pour qu'au moins 200 millilitres de tampon à phages se retrouvent dans le surnageant et puissent être extraits, puis mélangez en agitant doucement ou en faisant tourbillonner jusqu'à ce que le sol soit en suspension. Laissez le sédiment de sol se déposer, généralement pendant 30 minutes. Ensuite, éliminez les débris du sédiment en faisant passer l'extrait de sol à travers un papier filtre par filtration sous vide.Ajoutez quatre grammes de poudre LB à 200 millilitres de l'extrait de sol filtré et mélangez pour obtenir une solution à 2 %. Faites passer la solution à travers un filtre de 0,22 micron par filtration sous vide afin d'obtenir un filtrat stérile. Si possible, passez immédiatement à l'étape suivante.Néanmoins, si nécessaire, les échantillons filtrés peuvent être conservés à quatre degrés Celsius pendant une semaine au maximum avant de poursuivre. Toutefois, le nombre de particules de bactériophages viables sera réduit ; utilisez des techniques aseptiques pour aliquoter plusieurs portions de 50 millilitres du mélange d'extrait de sol LB filtré stérile dans des flacons de culture individuels de 250 millilitres. Dans des flacons de culture stériles agités équipés de cloisons, ajoutez une solution stérile de chlorure de calcium 2,0 M pour obtenir les concentrations finales souhaitées.Étant donné que différents phages d'Arthrobacter présentent une croissance optimale sous des conditions variables de chlorure de calcium, commencez cette procédure en ajoutant un à 2,5 millilitres de culture bactérienne en phase exponentielle tardive ou en phase stationnaire précoce à chacun des flacons contenant le mélange de bouillon LB et d'extrait de sol stérilisé par filtration. Si la DO 600 de la culture est comprise entre 0,5 et 0,7, utilisez un millilitre. Si la DO 600 est supérieure à 0,7, utilisez 2,5 millilitres.Agiter les flacons à 250 tr/min à 30 degrés Celsius pendant environ 24 heures dans un incubateur agité. Après la période d'incubation de 24 heures, retirer les flacons de enrichissement de l'incubateur agité. Diluer les échantillons de enrichissement dix fois dans du tampon bactériophage.Préparer des tubes de culture contenant 0,5 millilitre de culture bactérienne en phase exponentielle tardive ou en phase stationnaire précoce. Ajouter différentes quantités, allant de cinq microlitres à 500 microlitres, de la culture d'enrichissement diluée dans les tubes de culture.Ajouter du chlorure de calcium dans les tubes de culture afin d'obtenir une concentration finale dans cinq millilitres égale à celle présente dans le flacon d'enrichissement d'origine. Utiliser une gamme de concentrations différentes de chlorure de calcium afin de sélectionner de nombreux phages présentant des dépendances variables au chlorure de calcium. Ajouter 4,5 millilitres d'agar LB liquide à chaque tube de culture, puis verser le mélange sur une boîte de Petri contenant de l'agar LB.Agiter doucement pour répartir uniformément sur la boîte et laisser la couche supérieure durcir environ 15 minutes. Retourner les boîtes et incuber à 30 degrés Celsius pendant toute la nuit jusqu'à 48 heures. Faire varier les durées d'incubation afin d'optimiser la détection des phages présents ; après une incubation de 24 heures, vérifier la formation de plaques sur les boîtes.La plupart des phages isolés proviennent de plaques incubées à 30 degrés Celsius, avec une concentration de chlorure de calcium comprise entre 1 et 2,5 millimolaire, après une période d'incubation de 24 heures. La purification des phages souhaités à partir de plaques clairement isolées à l’aide d’un bâtonnet en bois constitue la partie la plus délicate de cette procédure. Une compétence technique est requise pour étaler délicatement les plaques sur la boîte en rayures afin d’obtenir une culture en stries uniforme. Stérilisez un bâtonnet en bois en le passant dans une flamme, puis laissez-le refroidir.Toucher brièvement une plaque avec le bâtonnet en bois stérile et frotter le bâtonnet sur la boîte de culture en zigzag avec un mouvement doux, comme indiqué. Répéter cette opération en utilisant un bâtonnet propre pour chaque passage. Une fois que la boîte de culture LB a été striée au moins trois fois, marquer la zone présentant la plus faible concentration de particules de phages présumés.Appliquez délicatement 0,5 millilitre d'Arthrobacter et 4,5 millilitres d'agar LB liquide fondu sur la zone marquée, puis laissez-le s'étaler uniformément sur la boîte. Laissez l'agar supérieur durcir pendant au moins une heure, puis, une fois la boîte solidifiée, retournez-la et incubez-la toute la nuit. Répétez la technique de striation en plaque au moins trois fois afin de garantir l'isolement d'une espèce de bactériophage pure.Les boîtes peuvent être conservées à quatre degrés Celsius pendant jusqu'à une semaine, selon les besoins entre les stries, sans perte significative de viabilité des phages. Une fois que les plaques souhaitées ont été cultivées et isolées sur la dernière boîte de stries, toucher une plaque bien isolée avec une pointe de micropipette et la resuspendre dans 100 microlitres de tampon à phage. Diluer sérialement cette solution jusqu'à une dilution de 10 à la puissance moins huit en transférant 20 microlitres de l'échantillon dans 180 microlitres de tampon à phage frais. Ajouter 10 microlitres de chaque dilution à 0,5 millilitre d’*Arthrobacter* cultivé dans un tube à essai pendant cinq à dix minutes à température ambiante.Ensuite, étaler en mélangeant les bactéries infectées avec 4,5 millilitres d'agar LB top liquide contenant la même concentration de chlorure de calcium utilisée pour isoler le bactériophage à partir de l'échantillon de sol initial. Incuber les boîtes pendant toute la nuit. Conserver toutes les dilutions effectuées à quatre degrés Celsius jusqu'au lendemain.Déterminez la dilution céréaleuse du bactériophage nécessaire pour obtenir un motif en réseau en utilisant le dosage classique de titrage des plaques. Identifiez une boîte présentant un motif en réseau comme étant presque dépourvue de bactéries, mais contenant des résidus de bactéries qui n'ont pas encore été lysées par les bactériophages. Ajoutez cinq millilitres de culture d’Arthrobacter en phase exponentielle tardive ou stationnaire précoce à un flacon stérile de 50 millilitres.Ajoutez 100 microlitres de la dilution ayant donné un motif en réseau à la culture d'Arthrobacter et laissez les phages infecter les cellules bactériennes pendant cinq à dix minutes. À température ambiante, ajoutez au flacon de l'agar LB liquide contenant la même concentration de chlorure de calcium que celle utilisée initialement pour identifier la plaque phagique. Répartissez 5 millilitres de ce mélange sur chacune des 10 nouvelles plaques LB.Après avoir laissé le gel supérieur durcir, retournez les boîtes et incubez-les à 30 degrés Celsius pendant la nuit le jour suivant. Inondez les boîtes présentant le motif en réseau avec cinq millilitres de tampon de bactériophages par boîte et conservez-les pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Filtrez le lysat de phages à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 micron. Conservez ce stock final de phages à quatre degrés Celsius pour une conservation à long terme.Ajoutez une quantité égale de lysat de phage à du glycérol stérile dans de petites fioles pour la conservation en stock à moins 80 degrés Celsius. Dans la procédure d'enrichissement illustrée dans cette vidéo, la méthode de striation en plaque permet d'isoler des populations pures de phages après enrichissement initial et étalage sur gélose LB. Les résultats présentés sont représentatifs de l'isolement de plaques pour le phage DI à température ambiante, à 30 degrés Celsius et à 37 degrés Celsius. Les cercles rouges sur deux des boîtes entourent des plaques clairement isolées. Le phage Dylan produit des plaques similaires à trois températures différentes.Alternativement, un dosage classique de la concentration en plaques peut être utilisé pour isoler un isolat pur de bactériophage. Ce dosage a été utilisé ici afin de déterminer empiriquement les concentrations en bactériophages et le nombre d'unités formant des plaques nécessaires à la formation d'un motif réticulé sur une boîte de culture. Une série de dilutions consécutives pour le bactériophage « banana » est présentée, accompagnée d'un exemple illustrant l'aspect qu'un bon motif réticulé doit avoir.Ce sont des images micrographiques électroniques de 20 phages d'Arthrobacter isolés à l'aide de la technique d'enrichissement. Sur les 25 phages actuellement isolés, 23 sont des virus de type Caudovirales à longues queues. Deux des phages isolés sont des myovirus possédant des diamètres de capside comparables en longueur à celui de leurs queues.Une fois maîtrisée, la technique de la plaque d'enrichissement devrait permettre l'isolement réussi de phages d'Arthrobacter à partir d'une variété d'échantillons de sol. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment purifier un phage à l'aide de la méthode de striation sur gélose à partir d'un échantillon de sol environnemental.

an-optimized-enrichment-technique-for-isolation-arthrobacter

Research

Recherche

JoVE Journal

Environment

Environnement

Source : Watson, D. C., et.al. Isolement et purification évolutifs des vésicules extracellulaires d’Escherichia coli et d’autres bactéries. J. Vis. Exp. (2021)Cette vidéo démontre l’isolement et la concentration de vésicules extracellulaires (VE) dérivées de la membrane externe de bactéries génétiquement modifiées. Le processus implique la culture des bactéries pour libérer des VE, suivie d’étapes de centrifugation et de filtration séquentielles pour éliminer les cellules et les débris. Enfin,...

Isolement et enrichissement de vésicules extracellulaires dérivées de la membrane externe à partir de bactéries

Source : Cross, T., et al., Une technique d’enrichissement optimisée pour l’isolement des espèces de bactériophages arthrobacters à partir d’isolats d’échantillons de sol. J. Vis. Exp.(2015)Cette vidéo montre la préparation d’une culture bactérienne pour la production de bactériophages. Il couvre les étapes d’inoculation d’une bactérie du sol dans une fiole déflectée, la promotion d’une croissance uniforme par aération et secouement, et la surveillance de la densité cellulaire à l’aide de...

Préparation d’une culture bactérienne du sol pour une infection bactériophage

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp.(2015)This video demonstrates the isolation of bacteriophages from a soil sample. A soil sample is collected and suspended in a phage buffer and allowed to settle the sediment. The extract is filtered, and nutrients are added. A vacuum filtration is done to remove microbial contaminants. The filtrate with phages is aliquoted into flasks, and...

Isolation of Bacteriophages from a Soil Sample

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the isolation of Arthrobacter bacteriophages from a soil sample using enrichment and plaque assay techniques. It highlights the infection, amplification, and visualization of phages as clear lysis zones formed on a bacterial lawn.

Isolation of Arthrobacter Bacteriophages from a Soil Sample

Une nouvelle méthode d’extraction semi-automatisée d’ADN hybride destinée à être utilisée avec des échantillons de volaille environnementaux a été mise au point et a démontré des améliorations par rapport à une méthode d’extraction mécanique et enzymatique courante en termes d’estimations quantitatives et qualitatives des communautés bactériennes totales.

Une méthode hybride d&#39;extraction d&#39;ADN pour l&#39;évaluation qualitative et quantitative des communautés bactériennes de la volaille Échantillons de production

Les bactéries sécrètent des vésicules extracellulaires (VE) de taille nanométrique transportant des molécules biologiques bioactives. La recherche sur les véhicules électriques se concentre sur la compréhension de leur biogenèse, de leur rôle dans les interactions microbes-microbes et hôte-microbe et des maladies, ainsi que de leurs applications thérapeutiques potentielles. Un flux de travail pour l’isolation évolutive des véhicules électriques de diverses bactéries est présenté pour faciliter...

Isolement et purification évolutifs de vésicules extracellulaires à partir d’Escherichia coli et d’autres bactéries

Les colonies fongiques entomopathogènes sont isolées à partir d’échantillons de sol tropical à l’aide d’appâts Tenebrio , d’appâts Galleria , ainsi que de milieux artificiels sélectifs, c’est-à-dire de gélose de dextrose de pomme de terre enrichie en extrait de levure complété par du chloramphénicol, du thiabendazole et du cycloheximide (milieu CTC).

Comparaison des méthodes d’isolement des champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol

L’isolement des microbes résistants aux métaux lourds des sources géothermiques est un sujet brûlant pour le développement de biosystèmes de bioremédiation et de surveillance de l’environnement. Cette étude fournit une approche méthodologique pour isoler et identifier les bactéries tolérantes aux métaux lourds des sources chaudes.

Bioprospection de micro-organismes extrêmophiles pour lutter contre la pollution de l’environnement

Ici, nous présentons une technique simple pour évaluer la résistance aux antimicrobiens environnementaux (RAM) en augmentant la proportion d’ADN extracellulaire de faible poids moléculaire. Un traitement antérieur avec 20 à 30 % de PEG et 1,2 M de NaCl permet de détecter à la fois les gènes génomiques et les gènes AMR transférés horizontalement. Le protocole se prête à un processus sans kit avec une optimisation supplémentaire.

Amélioration de l’extraction de l’ADN de faible poids moléculaire des eaux usées pour une évaluation complète de la résistance aux antimicrobiens 

Nous décrivons ici des méthodes d’échantillonnage dans les zones euphotiques des écosystèmes marins et d’eau douce pour isoler les cyanophages (et leurs hôtes) et des processus de post-échantillonnage qui enrichissent les génotypes uniques et caractérisent la dynamique d’interaction virus-hôte.

Échantillonnage environnemental des microbes photosynthétiques et de leurs virus : du champ au laboratoire

Découvrez un protocole d'enrichissement optimisé pour isoler des bactériophages infectant Arthrobacter à partir d'échantillons de sol. Cette méthode permet une isolation rapide et reproductible pour la recherche en virologie.

Une technique d'enrichissement Optimisé pour l'isolement de

Explorer plus de vidéos