Mesure de extracellulaire Ion flux Utilisation de l'Ion sélectif microélectrodes Technique d'auto-référencement

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les flux ioniques extracellulaires in vivo à l'aide de la technique microélectrode auto-référente sélective aux ions. Cela est réalisé en premier lieu en assemblant les microélectrodes sélectives aux ions et la microélectrode de référence. La deuxième étape consiste à étalonner et valider les microélectrodes auto-référentes sélectives aux ions.

Ensuite, les mesures du flux spécifique aux ions sont effectuées sur l'échantillon biologique sous forme d'enregistrements de tension. Enfin, l'enregistrement de tension est converti en flux ionique. En définitive, cette technique permet une mesure précise et non invasive des flux ioniques extracellulaires spécifiques dans des cellules ou tissus vivants.

Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés en physiologie ou en vieillissement, ainsi qu'en régénération ou en pathologie. Par exemple, cette méthode permet l'identification de flux ioniques spécifiques, qui contrôlent des processus biologiques tels que la morphogenèse, la croissance ou la différenciation tissulaires. Cette procédure sera démontrée par le Dr Gim Ardi, postdoctorant, et le laboratoire du Dr Benjas. Avant le montage pour l'étalonnage de l'électrode, insérez une électrode sélective pré-remplie dans un support pour microélectrode équipé d'un connecteur mâle en or d'un millimètre de diamètre et d'un fil d'argent revêtu de chlorure d'argent.

Ensuite, fixez le porte-électrode microscopique à un micropositionneur électronique commandé par ordinateur à trois axes. L'électrode sélective d'ions doit déjà contenir l'électrolyte et la solution du mélange ionique quatre correspondant aux ions d'intérêt. Une fois montée, l'électrode doit être immergée dans une solution contenant un millimolaire de chlorure de potassium.

En outre, fixez l'électrode de référence dans un porte-électrode micro droit contenant une solution saline à trois molarités dans de l'agar, une pastille d'argent revêtue de chlorure d'argent et un connecteur mâle en or de deux millimètres pour l'électrode de référence. Le choix de la solution saline dépend des espèces ioniques à mesurer. Après avoir préparé l'électrode de référence, fixez le porte-électrode à un micropositionneur manuel préalablement monté sur un support magnétique.

Une fois monté, l'électrode doit être immergée dans une solution contenant un millimolaire de chlorure de potassium. Avant de commencer, le dispositif d'électrode sélective d'ions doit avoir préparé une série de dilutions d'étalons d'électrolytes contenant les ions d'intérêt. Par exemple, si l'on souhaite détecter le cation potassium à une concentration physiologique d'environ un millimolaire, préparez une série logarithmique de trois ordres de grandeur de solutions de chlorure de potassium à 10, 1 et 0,1 millimolaire.

Cela maximise la plage dynamique de détection requise par le test. Pour étalonner l'électrode sélective d'ions, commencez par plonger l'électrode sélective et l'électrode de référence dans la solution d'étalonnage la moins concentrée, dans ce cas, 0,1 millimolaire. Après une brève période de stabilisation d'une à trois minutes à température ambiante, mesurez et enregistrez la tension en régime permanent.

Répétez les mesures de tension pour les autres étalons de calibration, en portant les tensions mesurées en fonction du logarithme des concentrations molaires des ions. Pour chaque solution étalon, appliquez une régression linéaire afin de déterminer la pente N, l'ordonnée à l'origine et la valeur du coefficient de détermination R² de la courbe d'étalonnage. Pour calculer la pente de Nernst, pensez à diviser les tensions mesurées par le gain total de l'amplificateur de tension.

Pour démontrer le protocole de mesure, le flux d'ions potassium provenant d'un ovocyte de grenouille perforé sera caractérisé à l'aide d'une microélectrode sensible au potassium. Avant de mettre en place l'électrode sélective aux ions, découpez un morceau de 1 centimètre carré dans une maille en nylon de 800 micromètres et collez-le au fond d'une boîte de Petri en plastique. Préparez également au préalable la solution de Ringer modifiée de Mark ayant la formulation suivante : 100 millimolaire de chlorure de sodium, 2 millimolaire de chlorure de potassium, 2 millimolaire de chlorure de calcium, 1 millimolaire de chlorure de magnésium et 5 millimolaire de HEPES. Ajustez le pH du tampon à 7,5 à l'aide d'hydroxyde de sodium et ajoutez un aliquot du tampon préparé dans la boîte de Petri.

Placez soigneusement la cellule de grenouille, l'électrode sélective d'ions et l'électrode de référence dans la boîte de Pétri. Percez ensuite la cellule et actionnez le micropositionneur de manière à ce que l'électrode sélective d'ions se trouve à environ 10 micromètres de l'échantillon. Sur le plan de la nomenclature, la distance actuelle entre l'échantillon et l'électrode sera désignée comme la position rapprochée.

Ensuite, actionnez le micro-positionneur de manière à ce que l'électrode sélective d'ions traverse périodiquement une position proche de 10 micromètres à une position plus éloignée de 100 micromètres, puis revienne à la position proche à une fréquence de 0,3 hertz, autrement dit effectue trois trajets complets tous les 10 secondes. Pendant l'actionnement du micro-positionneur, vérifiez que le déplacement de l'électrode est parfaitement perpendiculaire à la surface tangentielle lésée du cyte, puis activez le logiciel de mesure et d'enregistrement de la tension. Le micro-positionneur est programmé pour s'arrêter brièvement aux positions proche et éloignée pendant la collecte des données de tension.

Les données sont enregistrées en continu pendant la cicatrisation de l'ovocyte, ce qui prend environ 15 minutes pour les expériences plus longues, comme l'observation de processus s'étendant sur plusieurs jours. Lors des mesures de régénération de la queue de têtard d'opus, les données sont enregistrées deux minutes à différents points temporels. Par exemple, 1, 3, 6, 12 et 24 heures. À la fin de l'expérience, extraire les données de tension sous forme de fichier texte et copier les valeurs dans un tableur.

Utilisez la courbe d'étalonnage déterminée précédemment pour convertir les valeurs de tension mesurées en leurs concentrations ioniques correspondantes. Tracez les concentrations ioniques extrapolées en fonction de la distance par rapport à l'échantillon biologique. Enfin, calculez le flux ionique à l'aide de la loi fixe de diffusion.

Où C est la concentration en ions dans la solution, MU est la mobilité ionique, et DC DX est la différence de concentration sur une distance dx. Avant les expériences biologiques, la valeur de l'ordonnée à l'origine de la pente du NER et toute la courbe d'étalonnage de l'électrode ionosélective peuvent être validées par rapport à un gradient ionique artificiel généré à partir d'une source ionique d'un molaire placée dans une boîte de Pétri. Lorsque les variations des concentrations en ions potassium sont tracées à une distance proche ou éloignée d'une plaie au niveau du site annu.

Les données suggèrent qu'un événement massif de flux de potassium se produit au moment de la lésion cellulaire ; au fur et à mesure que la cicatrisation progresse, le flux de potassium diminue progressivement pour revenir à des niveaux de repos après 15 minutes, lorsque la plaie est complètement cicatrisée. En outre, lorsque les concentrations mesurées en ions potassium sont converties en flux ionique, l'augmentation soudaine et la diminution progressive du flux de potassium après la lésion apparaissent comme un effet statistiquement significatif par rapport à un ovocyte témoin intact. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que le marquage fluorescent de la bioélectricité, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires sur les caractéristiques des flux ioniques intercellulaires et intracellulaires.